Medição do metabolismo energético, no tecido da retina explantado, usando análise de fluxo extracelular

Resumo

Esta técnica descreve a gravação em tempo real do consumo de oxigênio e taxas de acidificação do extracelular nos tecidos da retina explantados rato, usando um analisador de fluxo extracelular.

Resumo

Visão de alta acuidade é um processo altamente consumidores de energia, e a retina desenvolveu várias adaptações exclusivas para atender precisamente tais demandas, mantendo a transparência do eixo visual. Perturbações para este delicado equilíbrio causam doenças cegantes, como retinopatia diabética. Portanto, a compreensão das mudanças do metabolismo de energia na retina durante a doença é fundamental para o desenvolvimento de terapias racionais para várias causas de perda de visão. O recente advento dos analisadores de fluxo extracelular comercialmente disponíveis tornou mais acessível o estudo do metabolismo energético da retina. Este protocolo descreve o uso de um analisador de medir as contribuições para o fornecimento de energia da retina através de seus braços dois princípio - fosforilação oxidativa e glicólise - através da quantificação de alterações em taxas de consumo de oxigênio (OCR) e extracelular taxas de acidificação (ECAR) como proxies para essas vias. Esta técnica é executada prontamente no tecido da retina explantado, facilitando a avaliação das respostas a vários agentes farmacológicos em uma única experiência. Assinaturas metabólicas em retinas de animais sem haste fotorreceptoras sinalização são comparadas aos controles do selvagem-tipo usando esse método. Uma limitação importante nesta técnica é a falta de capacidade de discernir entre a utilização de energia de luz-adaptado e vez, uma importante consideração fisiológica no tecido da retina.

Introdução

A retina é entre os tecidos mais exigentes de energia no sistema nervoso central¹. Como a maioria dos tecidos, gera triphosphate de adenosina (ATP) via glicólise no citosol ou via fosforilação oxidativa em mitocôndrias. A vantagem energética da fosforilação oxidativa sobre glicólise para produzir ATP a partir de uma molécula de glicose é clara: 36 moléculas de ATP gerado a partir do antigo vs 2 moléculas de ATP gerado deste último. Por conseguinte, os neurônios da retina dependem principalmente de respiração mitocondrial para fornecimento de energia e isto é refletido por sua alta densidade de mitocôndrias

Protocolo

Protocolos seguiram a associação para pesquisa em visão e oftalmologia declaração sobre a utilização dos animais e foram aprovados pela Universidade de Washington.

1. preparação animal

1. Manter animais em habitação padrão com um 12 horas escuro para ciclo de luz de 12 horas. Begin experimentos no padronizado para evitar efeitos circadianos, geralmente pela manhã, logo que as luzes estão ativadas.

2. preparação da solução

1. Preparar a mídia base dissolvendo 8,4 mg de mídia em pó em bidestilada H₂O (ddH₂O) e ajustar o pH para 7,4 com HCl ou NaOH, até um volume final de 1 ....

Resultados

Usando as técnicas descritas (resumidas na Figura 1), retinais explantes de 8 semanas de idade selvagem tipo (WT) de ratos foram comparados a idade - e fundo-combinada transducina nula ratos (Gnat1^{- / -}). Porque Gnat1^{- / -} animais não possuem a maquinaria para fechar nucleotídeo cíclico condomínio fechado de canais iônicos em resposta a estímulos de luz, os fotorreceptores haste permanecem despolarizadas mesmo .......

Discussão

OCR e ECAR prontamente são medidos em explantados tecido retinal usando um bioanalyzer usando as técnicas descritas. Este método parte das de outros grupos em várias etapas críticas. Tecidos da retina são isolados por meio de uma grande incisão da córnea sem enucleating do globo, como foi originalmente descrito por Winkler¹⁵. Este método de isolamento da retina permite uma rápida transferência do olho vivo para a placa de captura de tecido (muitas vezes dentro de 5 minutos). Os tecidos são mantido.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seahorse XF24 Analisador de Fluxo Extracelular	Agilent, Santa Clara, CA
Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (inclui: Microplaca de Captura de Ilhotas, Cartucho de Sensor e Solução Calibrante)	Agilent, Santa Clara, CA	101174-100	Inclui microplaca de captura de ilhotas, cartucho de sensor e solução calibrante
RPMI 1640 Mídia (Meio em pó)	Millipore-Sigma	R1383	RPMI 1640 Meio com L-Glutamina e sem glicose ou bicarbonato de sódio
D-Glucose	Millipore-Sigma	G8270	1M D-Glucose filtrado, para preparação de meios
Piruvato de sódio	Corning	25000CI	100 mM piruvato de sódio
Antimicina-A	Millipore-Sigma	A8674	Componente de protocolo de estresse mitocondrial
FCCP	Millipore-Sigma	C2920	Componente do protocolo de estresse mitocondrial
Rotenona	Millipore-Sigma	R8875	Componente do protocolo de estresse mitocondrial
2-desoxiglicose	Millipore-Sigma	D6134	Componente do protocolo de glicólise
punções de biópsia de pele de 1 mm com êmbolo	Integra-Miltex	33-31AA-P/25 Ferramenta de	tecido retiniano explantante
Dumont Mini-Fórceps Ferramentas Retas	de Ciências Finas	11200-10 Ferramenta de	explante de tecido retiniano
Dumont Medical # 5/45 Fórceps - Angular 45 graus	Ferramentas de Belas Ciências	11253-25 Ferramenta de	explante de tecido retiniano
Dumont # 7 Fórceps - Ferramentas de	Ciências Finas	11271-30	Ferramenta de explantação de tecido retiniano
Quant-iT Picogreen dsDNA Kit de ensaio	Fisher Scientific	P7589	Ensaio de normalização
de carregamentoBase Trizma (Base Tris)	Millipore-Sigma	T6066	Componente do tampão de lise
Triton X-100 (éter terc-octilfenílico de polietilenoglicol)	Millipore-Sigma	X100	Componente do tampão de lise
0.5M EDTA pH 8.0	Ambion	AM9262	Componente do tampão de lise
C57BL/6J camundongos	Laboratórios Jackson	Linhagem 000664	animais
Gnat1-/- e Gnat1+/+	Vladimir Kefalov, PhD; Escola de Medicina da Universidade de Washington	Animais