As células T antígeno-específicos são difíceis de caracterizar ou utilizar em terapias devido sua extremamente baixa frequência. Neste documento, nós fornecemos um protocolo para desenvolver uma partícula magnética que pode ligar para as células T antígeno-específicas para enriquecer estas células e então para expandi-los vários cem para caracterização e terapia.
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Artigo de método
Enriquecer e expandir células raras T antígeno-específicos com nanopartículas magnéticas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Nós desenvolvemos uma ferramenta para enriquecer e expandir as células T antígeno-específicas. Isto pode ser útil em casos como de A) detectar a existência de pilhas de T antígeno-específicas, B) sondar a dinâmica das respostas antígeno-específicas, C) compreender como antígeno-específicos respostas afetam o estado de doença, tais como a auto-imunidade, D) desmistificar heterogêneos respostas de células T antígeno-específicas, ou E) utilizam células antígeno-específicas para a terapia. A ferramenta baseia-se em uma partícula magnética que nós conjugado antígeno-específicas e sinais co-estimulatória de célula T, e que nós chamamos como apresentadoras artificial de células (aAPCs). Consequentemente, uma vez que a tecnologia é simples de produzir, ele pode facilmente ser adotado por outros laboratórios; assim, nosso objetivo aqui é descrever detalhadamente a fabricação e o uso subsequente da aAPCs. Nós explicamos como anexar antígeno-específicas e co-estimulatória sinais para a aAPCs, como utilizá-los para enriquecer para as células T antígeno-específicas e como expandir as células T antígeno-específicas. Além disso, destacaremos considerações com base em informações experimentais e biológicas de nossa experiência com caracterizando as células T antígeno-específicas de projeto de engenharia.
Introdução
Com a ascensão de muitos imunoterapias, há uma necessidade de ser capaz de caracterizar e controlar respostas imunes. Em particular, a resposta imune adaptativa é de interesse devido a especificidade e a durabilidade das pilhas. Recentemente, terapias de células T de receptor de antígeno quimérico foram aprovadas para a terapia do câncer; no entanto, os receptores de antígeno são baseados fora comum célula superfície antígeno CD19, em vez dos antígenos específicos para o câncer1. Além da especificidade, imunoterapias também podem sofrer com a falta de controle e limitada a compreensão da resposta imune dinâmica dentro de câncer ou auto-imunidad....
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Protocolo
Todos os ratos foram mantidos as orientações aprovadas pelo Conselho de revisão institucional da Universidade Johns Hopkins.
1. carregar a proteína de fusão de imunoglobulina dimérica Major complexo de histocompatibilidade (MHC-Ig) com antígeno desejado peptídeo de sequência.
Nota: Se usar o H - 2Kb: Ig e, em seguida, siga o protocolo detalhado no passo 1.1; se usar o H-2Db:Ig e, em seguida, siga o protocolo detalhado no passo 1.2.
- Ativo de carregamento de sequência do peptide em H - 2Kb: Ig.
- Prepare os buffers de necessários. Prepare o buffer de desnaturação, fazendo uma solução de NaCl de 150 ....
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Resultados
Para completar um enriquecimento sucesso e expansão das células T antígeno-específicos, o peptídeo-carregado MHC-Ig e moléculas coestimulatórias devem ser anexadas com sucesso para a partícula aAPC. Baseado nos 3 métodos de fixação de partícula, nós fornecemos alguns dados representativos para um resultado do processo de conjugação bem sucedida (Figura 5a). Com efeito, se a densidade de ligante é muito baixa, então não haverá estimulação eficaz de células T C.......
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Discussão
Nós criamos uma tecnologia de isolamento romance celular de T antígeno-específicos com base em nanopartículas artificial células apresentadoras (aAPCs). Nanopartículas aAPCs peptídeo-carregou MHC na superfície que permite a ligação de pilha de T antígeno-específicas e ativação ao lado de ativação co-estimulatória. aAPCs também são paramagnéticos e assim pode ser usados para enriquecer as células T antígeno-específicas raras usando um campo magnético. Nós temos otimizado e estudou Propriedades de chave de nanopartículas d.......
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Divulgações
Os autores declaram o interesse financeiro concorrentes seguintes: sob um acordo de licenciamento entre NexImmune e The Johns Hopkins University, Jonathan Schneck tem direito a uma parte dos royalties recebidos pela Universidade sobre as vendas dos produtos descritos neste artigo. Ele também foi dos fundadores da NexImmune e é dono de capital na empresa. Ele serve como um membro do Conselho de administração e Conselho Consultivo Científico do NexImmune. Os termos destas disposições foram revistos e aprovados pela The Johns Hopkins University, em conformidade com suas políticas de conflito de interesses.
Agradecimentos
J.W.H. obrigado NIH câncer nanotecnologia centro de treinamento no Instituto Johns Hopkins para nanobiotecnologia, a nacional Science Foundation Graduate bolsa de pesquisa (DGE-1232825) e a Fundação de arcos de apoio à comunhão. Este trabalho foi financiado pelo apoio do National Institutes of Health (R21 de P01-AI072677, R01-CA108835,-CA185819), iniciativa de inovação TEDCO/Maryland e a Fundação de Coulter (JPS).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| DimerX I: Proteína de fusão humana dimérica solúvel recombinante HLA-A2: Ig | Biosciences | 551263 | |
| DimerX I: Camundongo dimérico solúvel recombinante H-2D [b]: Ig | BD Biosciences | 551323 | |
| DimerX I: Camundongo dimérico solúvel recombinante H-2K [b]: Proteína de fusão Ig | BD Biosciences | 550750 | |
| Vivaspin 20 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932362 | |
| Vivaspin 2 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932257 | |
| Microglobulina Humana Purificada Beta 2 | Bio-Rad | PHP135 | |
| nanomag-D-spio, NH2, nanopartículas de 100 nm | Micromod | 79-01-102 | |
| Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µ m | Ocean Nanotech | SN0200 | |
| Anti-Biotina MicroBeads UltraPure | Miltenyi | 130-105-637 | |
| EZ-Link NHS-Biotina | ThermoFisher | 20217 | |
| Sulfo-SMCC Crosslinker | ProteoChem | c1109-100mg | |
| Sigma-Aldrich | I6256 Sigma | ||
| Microplaca de Meia Área de 96 Poços, poliestireno preto | Corning | 3875 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ 1, λ 2, & λ 3 Correntes Leves Clonar R26-46 | BD Biosciences | 553434 | |
| FITC Mouse Anti-Armênio e Hamster Sírio IgG Clonar G192-1 | BD Biociências | 554026 | |
| B6. Camundongos Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (PMEL transgênico) | Jackson Laboratory | 005023 | |
| C57BL/6J (B6 wildtype) Jackson | Laboratory | 000664 | |
| Kit de isolamento de células T CD8a+, camundongo | Miltenyi | 130-104-075 | |
| MS Colunas | Miltenyi | 130-042-201 | |
| LS Colunas | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE | Biolegend | 405203 | |
| N52 ímãs de disco de 0,75 polegadas | K & J Magnetics | DX8C-N52 | |
| APC anti-mouse CD8a Anticorpo, clone 53-6.7 | Biolegend | 100711 | |
| LIVE/DEAD Kit de Coloração de Células Mortas Verdes Fixáveis, para excitação de 488 nm | ThermoFisher | L-34969 |
Referências
- Prasad, V. immunotherapy: Tisagenlecleucel-the first approved Car-t-cell therapy: implications for payers and policy makers. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (1), 11(2018).
- Jenkins, M. K., Moon, J. J.
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Reimpressões e permissões
