Artigo de método

Reprodutível dsRNA Microinjection e Bioassay de oviposição em mosquitos e moscas domésticas

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DOI:

10.3791/58650

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8 de novembro de 2018

 ,  ,  ,  , 
1USDA/ARS Center for Medical, Agricultural, and Veterinary Entomology, 2CMAVE Detachment, Navy Entomology Center of Excellence, 3Lovelace Respiratory Research Institute

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve uma metodologia de microinjeção que temos padronizado e utilizado por vários anos para entregar quantidades específicas de ácidos nucleicos diretamente a hemolinfa de mosquitos e moscas domésticas. Este protocolo resulta em mortalidade de injeção mínima e permite medições de dose correlacionado de fecundidade.

Resumo

DsRNAs sintético, usado para induzir a interferência do RNA, podem ter efeitos fenotípicos dependente de dose. Estes efeitos são difíceis de definir se o dsRNAs são entregues usando um método não-quantitativo. Entrega exata das quantidades conhecidas de ácidos nucleicos ou outros produtos químicos é fundamental para medir a eficácia do composto a ser testado e para permitir a comparação confiável entre compostos.

Aqui nós fornecemos um protocolo de microinjeção reprodutíveis, quantitativa que garante entrega exata de doses específicas de dsRNA, reduzindo a mortalidade normalmente induzida por lesão de injeção. Essas modificações incluem a adição de rodamina B, uma agulha de injeção graduado, e um método de recuperação melhorada emprestada do Isoe e Collins. Esse método permite o cálculo das respostas de dose e facilita as comparações entre compostos. Versões desse método têm sido utilizadas com sucesso em três gêneros de mosquitos, bem como moscas domésticas para avaliar a redução na fecundidade resultante de silenciamento de RNA ribossomal transcrições.

Este protocolo fornece estratégias para reduzir a vários desafios da microinjeção de insetos pequeno. Junto, mecânica entrega de dsRNAs acompanhado de verificação visual, identificação de locais eficazes para a entrega e a inclusão de um período de recuperação pós-injeção certifique-se de lesão baixa mortalidade e dosagem exata. Este protocolo também descreve um bioensaio de oviposição para determinação uniforme de efeitos sobre a fecundidade.

Introdução

Entrega de biomoléculas pequenas, tais como ácidos nucleicos, para dípteros adultos tem provado para ser desafiador em Culicidae e Muscidae. Absorção oral de dsRNAs tem sido relatada para produzir esterilidade (quando alvejando genes exclusivamente expressos em testículos de adultos) e mortalidade (ao direcionamento SNF7 e um coactivator receptores esteroides) em larvas Aedes aegypti1,2 . Mortalidade também tem sido observada que visasse HSP70 em larvas de Musca domestica3. Tais efeitos fenotípicos, no entanto, não resultaram após a alimentação dsRNA para adultos Ae. aegypti em açúcar refeições4,5.

Microinjeção tem sido usada para contornar o midgut aquando da introdução de patógenos ou ácidos nucleicos, desse modo, induzindo uma resposta sistêmica5,6,7,8,9,10 . Existem várias técnicas de microinjeção, envolvendo equipamentos que vão desde aparelhos produzidos in-house que requerem medição visual do volume de injeção para injetores controlados por microprocessador que permitem a entrega automatizada de volume tão baixo quanto 2.3 nL 5 , 9 , 10 , 11. RNA interferência (RNAi) disparadores direcionamento ribosomal mRNAs, perturbar o desenvolvimento ovariano em artrópodes tão diversos como o gado carrapato Rhipicephalus microplus, os mosquitos Aedes aegypti e Culex pipiens, e a mosca doméstica Musca domestica5,9,12,13. Nestes estudos, o rompimento de oviposição de monitoramento foi essencial para determinar a eficácia do inóculo como o fenótipo pode se manifestar como cessação ou redução de progênie. Esta é uma forma de várias gerações fenótipo letal que é um efeito desejado e crítico em muitos dos métodos de controlo biológico não-tradicionais como Wolbachia -infectados introdução de machos (incompatibilidade sexual) e RNAi induzido esterilidade5 ,9,14. Tanto a mortalidade e a fecundidade de rastreamento é necessário para a caracterização e desenvolvimento de biorationals altamente específico (patógenos naturais e/ou derivados naturais)15.

Este protocolo apresenta técnicas de microinjeção detalhadas para adultos mosquitos e moscas domésticas; um processo que muitas vezes não é bem descrito na literatura. Além disso, metodologias de oviposição bioensaio para avaliar adequadamente o dsRNA efeitos sobre dípteros adultos são descritas. Estes protocolos foram desenvolvidos especificamente para o Aedes aegypti e Musca domestica , mas podem ser modificados para outras espécies.

Protocolo

1. preparação inseto

  1. Anestesia os mosquitos por eles de refrigeração a 4 ° C por várias horas ou por 2 min exposição ao CO2 e em seguida, segurando a 4 ° C antes de injeções. Frio anestesiar moscas em 4 ° C 2\u20123 h antes de injeções. Certifique-se de mosquitos e moscas Unidas se oviposição é uma variável de resposta.
    Nota: O método de anesthetization mosquito depende da espécie e estirpe, por exemplo, Culex recuperar muito mais rapidamente do frio anesthetization do Aedes aegypti e, portanto, CO2 nocaute é preferível.
  2. No gelo, cuidadosamente palco mosquitos ou moscas usando fórceps macio para colocá-las ventralmente expostos no microscópio slides ~0.5 centímetros distante. Slides padrão podem conter duas fileiras de 6 mosquitos cada ou 6 – 7 casa voa. Deixe um espaço de 1-1,5 cm na extremidade esquerda ou direita do slide clara de mosquitos ou moscas para auxiliar a manipulação de slide.
  3. Manter slides de insetos encenados a 4 ° C, em grandes pratos de Petri até que esteja pronto para a injeção.
    Nota: Perfurar um furo através da tampa da caixa de Petri ajudará a impedir que insetos sendo perturbado pelo deslocamento de ar quando tampando. Colocação de slides em um par de capilares de vidro, fixado à parte inferior do prato facilitará a remoção da placa de Petri.

2. inseto injeção

  1. Prepare o dsRNA, como descrito por Estep et al 5 e Sanscrainte et al . 9. se livre de contaminantes, dsRNA pode ser quantificado por meio de um espectrofotômetro para medir a absorvância a 260 nm e calcular concentração de RNA em μg/mL como fator uma diluição260 × 40.
  2. Preparar dissecando o microscópio e microinjector sobre uma mesa fria ou um balde de gelo superficial para executar injeções no frio-anestesiados mosquitos e moscas (consulte Etapa 1.1-1.3 e Figura 1).
  3. Puxe os capilares de vidro para uma ponta fina com extrator de agulha (configurações: aquecedor = 15 unidades, solenoide = 4 A).
    Nota: Consulte a Tabela de materiais para detalhes do fabricante.
  4. Coloque a agulha capilar em um microinjector conforme as instruções do fabricante e ponta de agulha de ruptura por beliscar com um par de pinças para produzir um ponto afiado.
    Nota: Tamanhos de abertura de agulha sugeridos são ~ 150 µm para mosquito e ~ 250 µm para mosca.
  5. Defina microinjector para o volume de entrega desejado. Movimento do menisco de alíquotas de nL ~ 50 é facilmente observável e recomendado para alevinos de mosquito. Se disponível, permitem configurações de injeção rápida. Enxague a agulha pelo enchimento e expelir a água livre de nuclease 3 vezes.
  6. Prepare soluções para injeção em uma concentração tal que 100\u2012150 nL fornecerá a dose desejada para mosquitos e 500 vontade nL fornecer desejado dose para moscas domésticas.
    Nota: Sugeridas doses iniciais: 1 µ g para cada mosquito e 5 µ g para cada mosca5,9.
  7. Opcionalmente, para mosquitos, adicione rodamina B (para ajudar na visualização) para soluções em uma concentração final de 3,0 µ g/mL.
    Nota: A tintura será claramente visível por sua cor rosa após injeção através da cutícula quase clara na superfície ventral do cruzamento de tórax/abdome.
  8. Pipete 3 – 4 µ l da solução a injetar em uma superfície limpa (como um pedaço de filme de parafina) e atrair para a agulha de vidro sem chupar no ar. Pressione o botão de inject repetidamente até o líquido começa a dispensar a agulha e Limpe suavemente gotículas com um limpador de tarefa delicada.
    Nota: Enquanto alguns modelos de microinjectors exigem o aterramento a seringa, o injector referenciado na Tabela de materiais não se altera.
  9. Usando um marcador de ponta ultra fina, desenhe cerquilhas ~ 1 mm separados a partir do menisco líquido para a haste da agulha. Isto irá ajudar a visualizar o movimento do menisco e certifique-se de que a solução tenha entrado o mosquito durante a injeção.
  10. Defina o slide de mosquitos ou moscas (como preparado em etapas 1,2 – 1,3) sob a agulha na tabela fria ou gelo (Figura 1). Garantir o campo de visão no microscópio é grande o suficiente para ver o menisco de solução na agulha.
  11. Para mosquitos, alinhe a agulha com o terço médio da mesokatepisternum (Figura 2A) e enquanto órtese o mosquito contra a agulha com pinça colocada no lado oposto, perfure delicadamente a cutícula com a ponta de agulha usando o micrômetro de microinjector.
  12. Para moscas domésticas, alinhe a agulha com a mesopleuron (Figura 2B) e, enquanto apoiando a voar contra a agulha, perfure delicadamente a cutícula com a ponta da agulha.
  13. Suavemente, introduza a agulha o mosquito ou voar o corpo até que a ponta passou através da linha mediana.
    Nota: Inserir a agulha superficial demais muitas vezes resulta na perolização líquida injetada fora o inseto (ver passo 2.15).
  14. Enquanto assistia para o movimento do menisco líquido na agulha, aperte o botão de injetar até a quantidade desejada de líquido tenha sido injectada. Para os mosquitos, se definida como 50,6 alíquotas nL, pressione 2 X para 100 ~ nL ou 3 X por 150 ~ nL. Para moscas domésticas, aperte o botão de injetar até ~ 500 nL tenha sido injetado (i.e., com 69 alíquotas nL, pressione 7 X para 483 nL).
  15. Se o menisco não se move, lentamente, deslizar o mosquito ou voar a agulha enquanto assiste para o movimento do menisco. Se uma parte dos grânulos solução injetada fora a cutícula após remoção da agulha ou se o menisco falha ao mover, descartar o inseto como esta injeção não foi bem sucedida.
  16. Transferi com êxito injetados mosquitos em grupos de 10-15 ou casa voam em grupos de 5 para limpar 3,5 oz segurar copos. Cobrir com tule ou rede e recuperar à temperatura ambiente.
  17. Depois de mosquitos e moscas têm recuperado (1 – 2 h), inverta a cada copo de exploração sobre uma bola de algodão embebida em solução de sacarose 10%.
    Nota: A inversão da Taça em cima da SIDA de algodão de sacarose em sobrevivência, fornecendo fácil acesso a uma refeição de açúcar10.
  18. Enxague a agulha como na etapa 2.5 entre soluções de injeção. Quando feito injetando, descarte usadas agulhas em um recipiente apropriado para objectos cortantes.

3. bioensaio de mortalidade e oviposição de aedes aegypti

  1. Três dias após a injeção, continue a fornecer os mosquitos com 10% de sacarose e registrar o número de mosquitos visivelmente mortos.
  2. Encha uma membrana artificial ≤12 polegadas (tais como embalagem de salsicha de colágeno) com sangue fresco (ou seja, bovinos para Aedes aegypti) e calor de 60 ° C em banho de água quente.
  3. Brevemente secar a membrana rolando em uma papel toalha e deitou-se entre as tampas de tule da 3,5 oz clara segurando copos. Para melhorar a alimentação, spike sangue com 1 mM de ATP após aquecimento como um phagostimulant ou pela alça o chouriço de sangue aquecido com limpa mãos deixar voláteis humanas sobre a superfície da embalagem.
  4. Após a alimentação de sangue, substituir a bola de algodão embebida com 10% de sacarose em cima dos copos de exploração e permitir que os mosquitos descansar por ~ 24 h antes da transferência para copos de oviposição.
  5. Copos de oviposição construção preenchendo claro 3,5 oz copos de bioensaio com ~ 30 mL água deionizada H2O e colocar um pedaço de papel de germinação de sementes (~ 4 cm de largura e 5 cm de comprimento com cristas vertical) na parte inferior da Copa e contra o lado (Figura 3A) . Cobrir com tule ou rede e cortar uma pequena fenda (~ 1 cm) na tampa de tule ou compensação.
  6. Em 24h pós-sangue de alimentação, cortar uma pequena fenda (~ 1 cm) no tampão tule da Copa da exploração e transferir somente as fêmeas individuais que se alimentaram com êxito — com um bolo de sangue visível no abdômen — por aspiração de boca gentil em copos de oviposição (1 fêmea/oviposição cup). Sele o pequeno corte na tampa de oviposição com uma bola de algodão saturada de sacarose 10%.
  7. Segure copos em ~ 27 ° C por 5\u20127 dias permitir que os mosquitos ovipositar totalmente enquanto o rastreamento mortalidade diária. Contagem de ovos em um escopo de dissecação.

4. bioensaio de mortalidade e oviposição de Musca domestica

  1. Três dias após a injeção, continue a fornecer as moscas com 10% de sacarose e registrar o número de moscas mortas visivelmente.
  2. Três dias após a injeção, anestesia moscas, brevemente, colocando um tubo de polietileno dispensando CO2 sobre os copos de exploração até que todas as moscas são imóveis no fundo dos copos.
  3. Transferência voa para uma gaiola limpa, compreendida de um frasco de plástico de 4 L, com uma luva de malha tubular cobrindo a abertura (10 cm, Figura 3B). Fornecer moscas com água e uma mistura de sacarose granulada, leite em pó e secas gema de ovo em um 8: proporção de 8:1 (em volume) por quatro dias, gravação e removendo morto voa diariamente.
  4. Prepare ingredientes secos para o meio fresco de criação larval voar através da mistura de 75% de farelo de trigo com 25% peletizado ração por peso. Adicione água para atingir umidade de 62% (até uma gota de água quase não pode ser espremida para fora).
  5. Preparar uma bola de diâmetro de 2,5 cm de uma mistura 1:1 da mídia larval fresca acima e "usado" voa larval médio (médio em que moscas têm puparam anteriormente). Embrulhe a bola em um quadrado de tecido de algodão preto, aperte levemente até médio líquido escoa através de e, em seguida, usar elásticos para prender o pano no lugar ao redor da bola.
  6. Colocar a bola em um copo de 60 mL e colocá-lo na gaiola voar por 5h (Figura 3B).
  7. Lave os ovos da bola de oviposição e certifique-se de que os ovos são removidos debaixo do dobras no pano. Agite os ovos para perturbar aglomerados e transferi-los para um tubo de centrífuga graduado 20 mL com uma pipeta de transferência.
  8. Espere até que os ovos resolver e anotar o volume dos ovos se estabeleceram no tubo graduado. Adicione água suficiente para trazer o volume até 20 X o volume de ovos se estabeleceram. Registre o volume total de água mais ovos.
  9. Enquanto mistura a suspensão de água e ovo com uma barra de agitação magnética ou agitação vigorosa, use a ponta da pipeta de 1 mL (com a extremidade da ponta cortada) para dispensar a 0,5 mL de suspensão de água e o ovo em um pedaço de pano preto pré-umedecidos numa série de linhas. Conte com o ovo sob um microscópio de dissecação.
  10. Repita a etapa 4.9 mais duas vezes. Se um dos Condes é um outlier grave (ou seja, difere de outras duas acusações por > 35%), fazer uma contagem de quarta e desconsiderar o outlier.
  11. Calcular o número médio de ovos por amostra e multiplique este valor por 2 para obter o número de ovos/mL da suspensão. Multiplique o valor de ovos/mL obtido pelo volume da suspensão da etapa 4.8 ovo. Esta é a estimativa para o número total de ovos postos.

Resultados

Microinjeção de dsRNA em mosquitos

Este método de microinjeção tem sido usado em nosso laboratório para avaliar a expressão gênica, mortalidade e resposta de oviposição para mais de 80 dsRNA gatilhos em vários gêneros de mosquito (Aedes, Anopheles, Culex). Injetar 1 µ g de dsRNA derivado as transcrições ribosomal, RPS6 e RPL26 (ver Estep et al fêmeas da estirpe colônia de Ae. aegypti (ORL1952) 5 para dsRNA métodos de produção e dados de sequência) mostrou significativa redução na expressão relativa (RE) através de oviposição múltiplos ciclos quando comparado aos mosquitos injetados com um dsGFP de controle. Aedes aegypti RE medido após o ciclo de gonotrophic 2nd mostrou redução significativa de expressão RPS6 (P < 0,05) em mosquitos injetados com dsRPS6, conforme determinado pelo teste-t de Student-um entre o controle de dsGFP do mesmo grupo (Figura 4),5 .

Fecundidade foi avaliada das fêmeas individuais usando o bioensaio de oviposição descrito aqui. Após a injeção após 3 dias, os mosquitos foram sangue alimentados, transferido em recipientes individuais de oviposição e permitido colocar até a conclusão. Tamanhos de embreagem média para o primeiro ciclo de gonotrophic foram significativamente reduzidos para ambos os dsRPS6 tratados Ae. aegypti (n = 102 fêmeas, 1,3 ± 0,8 (média ± SE) ovos) e dsRPL26 Tratado (n = 86 fêmeas, 4,0 ± 1,1 ovos) quando comparado com as injeções de dsGFP (n = 79 fêmeas, 49,3 ± 3,5 ovos, Figura 5A). Embreagem avaliação após um segundo ciclo de gonotrophic também mostrou significativamente reduzida de oviposição para ambos os grupos de dsRNA Tratado, mas com tamanho reduzido efeito. Tamanho dos grupos de Ae. aegypti foram variável e, portanto, significa separação foi realizada por teste de Dunn é5. Vinte e quatro horas mortalidade era normalmente 3% ou menos.

Um efeito de dose clara foi observado quando injetar dsRPS6 de 1 µ g para 50 ng no feminino Ae. aegyptie embreagem tamanho variou significativamente quando comparados aos controles de 1 µ g/fêmea dsGFP injetado em todos, mas a dose de dsRPS6 de 25 ng/fêmea (Figura 5B).

Microinjeção de dsRNA em casa voa

Colônia Musca domestica (ORL normal) foram injetados com 5 µ g de dsRNA construções projetadas contra a mosca doméstica transcrições de RPS6 e RPL269. Como foi observado em Ae. aegypti, redução significativa de tanto expressão específica de transcrição (RPS6 e RPL26) e diminuição do tamanho da embreagem foi observadas (Figura 4 e Figura 5A). Redução significativa em RE foi determinada pelo teste t de Student entre o controle de dsGFP do mesmo grupo (P < 0,05) e foi utilizado o teste de Holm-Sidak para determinar a significância entre tamanhos de embreagem para M. domestica de diferentes grupos de tratamento. Dissecações ovarianos mostraram oogénese reduzida em tratamentos dsRPS6 e dsRPL26, enquanto dsGFP alimentado moscas tinha normal vitellogenin deposição recomendados no Tyndale-Biscoe escala9.

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Figura 1: configuração de Microinjection para entregar microvolumes adultos mosquitos e moscas domésticas. As injeções são executadas em insetos frio-anestesiados, encenados em corrediças do microscópio sobre uma mesa fria. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Sites de Microinjection para Ae. aegypti e M. domestica. (A) adulto Ae. aegypti são injetados em um-terço médio do mesokatepisternum. (B) adultos de M. domestica são injetados no mesopleuron. As setas indicam os sítios de injeção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: configuração do bioensaio de oviposição. (A) ensaio de oviposição Ae. aegypti xícaras com papel de germinação de sementes, como um substrato de oviposição, tampado com tule e 10% algodão embebido de sacarose. (B) adulto feminino M. domestica em um recipiente de ensaio de oviposição com comida (A), água (B) e mídia larval (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Expressão relativa de RPS6 Ae. aegypti e M. domestica injetado com dsRNAs espécie-específicos. Aedes aegypti e M. domestica foram injetados com 1 e 5 µ g respectivamente de qualquer controle dsRNA (dsGFP) ou dsRNA projetado contra RPS6 ou RPL26, transcrições de cada inseto. Redução significativa (P < 0,05) de RPS6 expressão foi observada em mosquitos e moscas injetadas com dsRPS6 e pelas moscas injetadas com dsRPL26 (indicado por asteriscos). Barras de erro representam média ± SE e número na coluna base indica o número de indivíduos examinados. Esta figura foi modificada de Estep et al 5 e Sanscrainte et al . 9. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Embreagem média tamanho do Ae. aegypti e M. domestica injetado com dsRNAs espécie-específicos. (A) deposição do ovo foi significativamente reduzida (P < 0,05) em ambos Ae. aegypti e M. domestica após a injeção de 1 e 5 µ g respectivamente de qualquer controle dsRNA (dsGFP) ou dsRNA projetado contra RPS6 ou RPL26 transcrições de cada inseto. Asteriscos indicam diferenças significativas do controle dsGFP do mesmo grupo. Barras de erro representam média ± SE e número na coluna base indica o número de indivíduos examinados. Esta figura foi modificada de Estep et al 5 e Sanscrainte et al . 9. (B) curva de Dose de Ae. aegypti injetado com dsRPS6 de 50 ng/fêmea a 1000 ng/fêmea mostra reduções significativas na fecundidade em comparação com dsGFP injetado coortes (50, 100 e 1000 ng/feminino). Barras de erro representam média ± 95% CI de organismos individuais 36-81 por dose. Pontos com letras representam diferença significativa entre os grupos (P < 0,05) identificado por ANOVA. Esta figura foi modificada de Estep et al 5. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Microinjeção é uma técnica de laboratório valioso para assegurar a entrega do dsRNA ou outros biorationals (i.e., pesticidas, vírus, microsporidia). Enquanto muitos laboratórios executam microinjeção, o montante exacto injetado é frequentemente incerto devido a limitações técnicas do sistema de entrega onde o volume entregue não é diretamente medida11. Concentração e volume entregue são parâmetros críticos que permitem o cálculo de medidas padrão de toxicológicos como CE50 ou IC50 ou definir o mínimo eficaz doses5,16. Isto é especialmente importante em estudos funcionais usando RNAi em insetos adultos, onde entrega alimentando não resulta sempre em exposição sistêmica às partículas desejadas e a dose real atravessando o intestino é claro5.

Enquanto o procedimento de microinjeção pode ser inicialmente desafiador, rápidas melhorias em precisão e velocidade e entrega são obtidas com prática e paciência. Dominar o processo de injeção em si é um investimento de tempo, mas, uma vez realizado, o procedimento produz resultados reproduzíveis e mortalidade de lesão de < 3%. O rácio de injeções bem sucedidas vai aumentar como proficiência aumenta permitindo injeção de 300 mosquitos ou moscas por dia.

Muitos dos desafios da microinjeção são devido a agulha que está sendo usada. Determinar o ponto de interrupção de agulha capilar adequada e ângulo de ponta é um aspecto desafiador do procedimento e requer alguma tentativa e erro para determinar o tamanho de abertura mais eficaz para uma dada espécie. A agulha fina mais úteis para o microinjection mosquito (~ 150 µm) é muito pequena para entregar rapidamente o maior volume injetado moscas enquanto por outro lado, a agulha maior abertura que funciona em moscas (~ 250 µm) causa lesão extensa danos para os mosquitos menores e mortalidade de injeção inaceitável. Uma agulha quebrada com uma ponta romba é muitas vezes difícil de obter através da cutícula sem dano tecidual e aumento da mortalidade. Escalas de insetos ou pedaços de tecido podem obstruir agulhas ao longo de uma experiência, por isso muitas vezes é útil ter várias agulhas puxadas se for necessária sua substituição. Descobrimos que é mais fácil de substituir uma agulha difícil, ao invés de gastar tempo para tentar esclarecer uma agulha encravada ou torcida.

Observando a solução de injeção entrando o inseto é fundamental para que injeções mal sucedidas podem ser removidas (ver passos 2.14-2.15). Adição de rodamina B para soluções de injeção fornece um visual claro para garantir que os insetos frio-encenado receber a dosagem adequada e é especialmente útil durante o treino (consulte a etapa 2.7).

Os métodos de injeção e oviposição bioensaio aqui apresentados com sucesso tem induzido o gene efeitos fenotípicos knockdown e mensuráveis em adultos Ae. aegypti e M. domestica quando usar dsRNAs projetado contra espécie ribosomal transcrições (Figura 4 e Figura 5A). Além disso, a capacidade desse método para entregar com precisão microvolumes indivíduos permite curvas dose-resposta a ser gerado para pequenas quantidades de material (tão baixo quanto 50 ng; Figura 5B). Isso é especialmente útil para métodos como triagem siRNAs ou dsRNAs, como a produção de grandes quantidades destas moléculas pode ser financeiramente inviável.

Esse método pode ser modificado para injetar agentes biológicos (vírus, bactérias, microsporidia) ou pesticidas químicos, depois de garantir que os buffers de entrega são inócuos por injeção. Como o volume de entrega é limitada pelo tamanho do inseto, produzindo concentrado testar soluções é de importância.

Para avaliar adequadamente a eficácia dsRNA, é necessário acompanhar a oviposição como fenótipos letais só podem se manifestar na descendência. Como apresentado aqui, segurando a fêmea Ae. aegypti separadamente após sangue permite para determinação do tamanho da embreagem individuais e ensaios sobre os mesmos indivíduos podem ser feito a jusante de oviposição (i.e., estudos de expressão de gene, gonotrophic adicionais ciclos, nocaute específicas de tecido) para saída reprodutiva se correlacionam com outras medidas tais como a expressão do gene. Como M. domestica geralmente ovipositar em uma resposta do grupo, incitar moscas gravid isoladas para leigos é muito trabalho intensivo e não é prático para um grande número de indivíduos de17. Portanto, um método para determinar o tamanho médio da embreagem é apresentado.

O método de microinjeção aqui apresentado fornece consistente entrega sistêmica para mosquitos e moscas domésticas. Juntamente com a mortalidade e a oviposição rastreamento bioensaios, essas ferramentas versátil podem ser usadas para avaliar os efeitos transcriptional e fenotípicos de pequenas moléculas de RNA, agentes biológicos e pesticidas tradicionais onde entrega oral não é viável.

Divulgações

Todos os autores são empregados ou prestadores de serviços do departamento de agricultura dos Estados Unidos ou o departamento de defesa. Este manuscrito foi produzido durante o curso de deveres oficiais e segundo a lei de domínio público. As opiniões expressadas representam a opinião dos autores e não representam uma posição oficial ou endosso pelo governo dos EUA. Menção de um produto comercial não é uma recomendação para o uso.

Agradecimentos

Os autores graças Hanayo Arimoto (US Navy), Dana Johnson, Lucy Li e Roxie White (USDA-ARS) para ajudarem com a aquisição de dados e análise. Agradecemos também os Drs Pia Olafson (USDA-ARS) e Ke Wu (Universidade da Flórida) para uma revisão crítica do manuscrito e Niklaus Hostettler (Universidade da Flórida) para filmar as imagens do microscópio. Financiamento foi fornecido pelo USDA, o projeto WII - 141C da Marinha e Marine Corps centro de saúde e o programa de proteção de caças de guerra implantado. Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto ou direção do estudo ou desenvolvimento do manuscrito.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
agulha puxando
extrator de pipeta verticalConfigurações Kopf720: aquecedor = 15 unidades, solenóide = 4 amperes
capilares de vidro, 3,5" de comprimento, ID = 0,530 mm ± 25 μ m, OD 1,14 mmWorld Precision Instruments504949capilares para puxar agulhas de vidro
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
estação de microinjetora
Nanolitro 2010Instrumentos de Precisão MundialNANOLITER2010microinjetor
micromanipulador manualWorld Precision InstrumentsKITE-Lmanipulador de KITE à esquerda
suporte magnéticoWorld Precision InstrumentsM9segura micromanipulador
microscópio binocular de zoom estéreo de precisão no suporte de lançaInstrumentos de Precisão MundialPZMIII-BSescopo de dissecação para microinjeções
1.5X objetivaWorld Precision Instruments501377objetiva para luz de microscópio
Anel LEDWorld Precision Instrumentsanelde luz 504134 para microscópio de injeção
mesa de refrigeração de laboratórioBioQuip Products1431mesa de refrigeração para microinjeções
lâminas de microscópioFisher Scientific12-544-1para encenação de insetos durante as injeções
Rodamina B, 98+%Acros OrganicsAC296571000
Nome<strong>EmpresaNúmero de catálogoComentários
bioensaios de oviposição de mosquitos
grande placa de PetriFisher ScientificFB0875714para segurar lâminas de encenação
copo de plástico - 3 1/2 oz.Copos de bioensaio de oviposição de mosquitoTK35da Dart Container Corporation
de tule foscoTecidos de 1103068para bioensaios de oviposição
fonte de sangueadquiridabovina ou viva
1 x invólucro de colágeno comestível transparente de 30mm
Anchor Paper CoSD7615L
aspirador oral com filtro HEPAJohn W. Hock Company612
NomeCompany>Número de catálogo<strong>Comentários
bioensaios de oviposição de moscas
Recipiente de armazenamento de alimentos de plástico de 4 LWalmart555115143
manga de meia de 10 polegadasMedonthego.comfarelo de trigo FS15001H
adquiridonormalmente encontrado em lojas
de ração Calf Manna suplemento de desempenhoValleyVetSupply.com16731ração peletizada para gado
gema de ovo secaBulkFoods.com40506
tecido de algodão pretoadquiridonormalmente na seção de suprimentos artesanais
Copo de 60 mLDart Container CorporationP200-N
tecido localmente tipicamente Papel de germinação de sementes de peso pesado Butcher and Packer 30D02-05 localmente localmente

Referências

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