Efeitos de gosto sinalização Abolishment de proteína na inflamação do intestino em um modelo de Mouse de doença inflamatória intestinal

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo para investigar o efeito da anulação dos genes relacionados com gustação sobre respostas imunes em uma de sódio sulfato de dextrano (DSS)-induzidas pelo modelo de mouse (IBD) de doença inflamatória intestinal.

Resumo

Doença inflamatória intestinal (IBD) é um dos distúrbios gastrointestinais imune-relacionados, incluindo a colite ulcerosa e doença de Crohn, que afeta a qualidade de vida de milhões de pessoas em todo o mundo. IBD os sintomas incluem dor abdominal, diarreia e sangramento retal, que pode resultar de interações entre a microbiota do intestino, componentes de alimentos, células epiteliais intestinais e células do sistema imunológico. É de particular importância para avaliar como cada gene chave expressado nas células epiteliais e imunes intestinais afeta inflamação no cólon. Receptores de sabor acoplado à proteína G, incluindo a subunidade α da proteína G-gustducin e outras proteínas de sinalização, foram encontrados nos intestinos. Aqui, usamos a α-gustducin como representante e descrever um de sódio sulfato de dextrano (DSS)-induzido modelo IBD para avaliar o efeito das mutações génicas gustativa na imunidade da mucosa do intestino e inflamação. Este método combina tecnologia de gene nocaute com o modelo IBD quimicamente induzido e, portanto, pode ser aplicado para avaliar o resultado da anulação do gene gustativa, bem como outros genes que podem exuberate ou diminuir a resposta imune induzida por DSS no cólon. Ratos mutantes são administrados com DSS durante um certo período durante o qual seu peso de corpo, fezes e sangramento retal são monitorados e registrados. Em diferentes momentos durante a administração, alguns ratos são sacrificados, em seguida, os tamanhos e pesos de seus baços e dois-pontos são medidos e tecidos do intestino são recolhidos e tratados para histológica e análises de expressão do gene. Os dados mostram que os resultados de nocaute de α-gustducin em perda de peso excessivo, diarreia, sangramento intestinal, dano tecidual e inflamação vs selvagem-tipo ratos. Desde que a gravidade da inflamação induzida é afectada por estirpes de rato, ambiente de moradia e dieta, otimização da duração de concentração e administração de DSS em um experimento piloto é particularmente importante. Ajustando estes fatores, este método pode ser aplicado para avaliar ambos os efeitos antie pro-inflamatórios.

Introdução

As duas principais formas de doença inflamatória intestinal (IBD), (CD) da doença de Crohn e colite ulcerativa (UC) são caracterizadas por condições inflamatórias remitente ou progressivas crônicas do intestino com etiologia multifatorial^1,2 . O desenvolvimento do IBD depende de genéticas, bem como certos fatores ambientais como dieta, uso de antibióticos e importante, infecções patogênicas. No entanto, a etiologia e regulamentares mecanismos moleculares subjacentes IBD não são ainda claras. Daí, numerosos modelos animais quimicamente induzidos de IBD foram construídos e aplicados para delinear a patogênese e ....

Protocolo

Todos os experimentos envolvendo ratos foram revistos e aprovados pelo cuidado de Animal institucional e comissões da Universidade de Zhejiang do uso. É aconselhável usar equipamento de protecção adequado antes de executar este protocolo.

1. preparação dos ratos e DSS

1. Manter os ratos do KO (α-gustducin^{- / -}) e idade-, sexo- e corpo peso-combinadas selvagem-tipo controle (α-gustducin^{+ +}) camundongos C57BL/6 individualmente em gaiolas limpas.
   Nota: Os camundongos nocaute tem sido traçados com camundongos C57BL/6 há mais de 20 gerações e uma quase 100% C57BL/6 genética de fundo.
2. Dissolva 30 g de dex....

Resultados

Foi estabelecido um procedimento IBD DSS-induzida pela administração de 3% DSS em água potável para α-gustducin-nocaute (KO) e ratos de tipo selvagem (WT). Em comparação com camundongos WT, os ratos nocaute exibiram colite mais grave com perda de peso excessivo, diarreia e sangramento intestinal (Figura 1). Após a administração de DSS um dia 7, as diferenças na integridade do tecido foram analisadas usando H & E mancha como o método histológico, e mais gr.......

Discussão

Este método pode ser empregado para quantitativamente determinar o efeito das mutações de genes específicos gustativas na inflamação em um modelo do rato do IBD induzida em DSS. Para aproveitar ao máximo, indução ideal do IBD é um passo fundamental. O desenvolvimento da colite é afetado por vários fatores, incluindo a cepa de rato, ambiente de moradia, microflora intestinal, bem como os genes de interesse. Recomenda-se realizar um experimento piloto com um pequeno número de ratos para testar diferentes doses e duração da.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpo
CD45	BD Biosciences	550539
CD3	BD Biosciences	555273
B220	BD Biosciences	550286
CD11b	BD Biosciences	550282
Ly6G	BD Biosciences	551459
< forte>ReagenteSal de
sódio de sulfato de dextrano (DSS)	MP Biomedicals	2160110
complexo estreptavidina-HRP	BD Pharmingen	551011
H& Kit de coloração E	BBI Life Sciences	E607318
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sangon Biotech	B548117
FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)	Roche	4913850001
MMLV Reverse Transcriptase, GPR	Clontech,TaKaRa	639574
TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit	TaKaRa	9767
BD Seringa de 10 mL	BD Biosciences	309604
Instrumentos e equipamentos
balança
coloração de máquina de qPCR
de fórceps
Software
	Media Cybernetics, Inc.

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