Aqui descrevemos um protocolo para a imunoprecipitação eficiente de cromatina (ChIP) seguido por sequenciamento de DNA do elevado-throughput (ChIP-seq) do tecido adiposo marrom (BAT) isolado de um rato. Este protocolo é apropriado para o mapeamento de modificações do histone e investigando a localização de todo o genoma de proteínas não-histonas de interesse em vivo.
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Artigo de método
Imunoprecipitação da cromatina do tecido de adiposo marrom murino
Neste artigo
Resumo
Resumo
Processos mais celulares são regulados pela modulação transcriptional de programas específicos de gene. Tal modulação é conseguida através das ações combinadas de uma ampla gama de fatores de transcrição (TFs) e cofactores mediando ativação transcricional ou repressão através de alterações na estrutura da cromatina. Imunoprecipitação da cromatina (ChIP) é uma abordagem útil biologia molecular para mapeamento de modificações do histone e criação de perfil de fatores de transcrição/cofactores ligação ao DNA, assim fornecendo um instantâneo das dinâmicas mudanças nucleares ocorridos durante as diferentes processos biológicos.
Para estudar o Regulamento transcriptional no tecido adiposo, amostras provenientes em vitro culturas de células de imortalizado ou linhas de célula primária muitas vezes são favorecidas em ensaios de ChIP por causa da abundância de material começar e reduziram variabilidade biológica. No entanto, estes modelos representam um instantâneo limitado do estado real da cromatina em organismos vivos. Assim, há uma necessidade crítica para protocolos otimizados executar o ChIP em amostras de tecido adiposo derivadas de modelos animais.
Aqui descrevemos um protocolo para eficiente ChIP-seq de modificações do histone e proteínas não-histonas no tecido adiposo marrom (BAT) isolado de um rato. O protocolo é otimizado para investigar todo o genoma de localização das proteínas de interesse e epigenéticas marcadores no morcego, que é um tecido morfologicamente e fisiologicamente distinto entre os depósitos de gordura.
Introdução
Enquanto o tecido adiposo branco (WAT) é especializado para o armazenamento de energia, o tecido adiposo marrom (BAT) dissipa energia na forma de calor devido a sua habilidade para converter carboidratos e lipídios em energia térmica através de desacoplamento mitocondrial1. Por causa desta função especializada, é necessário para a manutenção da temperatura do corpo em condições fisiológicas e em resposta à exposição fria o depósito de morcego. Enquanto mudanças de expressão do gene durante a diferenciação de morcego e após estresse termogênico têm sido muito estudadas in vivo e in vitro, os mecanismos moleculares subjacentes a essas mu....
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Protocolo
As etapas de manipulação de animais do protocolo foram aprovadas pelo cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) da Universidade de Boston.
1. dia 1: Dissecação e preparação de morcego para a imunoprecipitação da cromatina (ChIP)
- Eutanásia em ratos utilizando uma câmara de gás carbônico (CO2) e faz a dissecação imediatamente depois. Pelo de rato de pulverizador com etanol a 70% antes da incisão. Coloque o mouse com as costas virada para cima, em seguida abrir a pele ao longo do pescoço. Localize o taco diretamente sob a pele entre os ombros (interscapulaire; elas aparecem como dois lóbulos, em forma de borbole....
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Resultados
Figura 1: ChIP validação por qPCR. ChIP-qPCR análise de representante GPS2 alvo genes NDUFV1 (à esquerda) e TOMM20 (à direita) no morcego de camundongos WT e GPS2-AKO, mostrando alterações relativas ao nível de metilação de H3K9 e vinculação GPS2 e Pol2. Os gráficos de barras representam a média da amostra de 3 repetições com * p < 0,05 e * * p < 0,01 calculado com .......
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Discussão
O protocolo descrito aqui representa uma ferramenta valiosa para a realização de ChIP de tecidos murino, especificamente otimizados para marrom de tecido adiposo. Um dos maiores desafios na execução de ChIP de tecido está se recuperando de um número suficiente de células durante a preparação da amostra. Corte o taco usando um liquidificador de homogeneizador de tecidos juntamente com esferas de aço inoxidável em vez de um pilão de vidro canônico significativamente reduz o número de células que perderam devido ao tecido i.......
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Liquidificador de Tecidos Bullet Blender | Próxima Aventura | BBX24 | |
| 3.2 mm de Diâmetro | Próximo Anúncio | SSB32 | |
| Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
| 1.5 mL Micro Tubo TPX Plástico | Diagenode | C30010010-5 | |
| Inibidor de protease completa | Roche | ||
| Pasta de Agarose Proteína A | Invitrogen | ||
| Anticorpo GPS2 | Em casa | Policlonal de coelho, anticorpo Ct (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
| Anticorpo Pol2 | Diagenode | C15100055 | |
| anticorpo h3K9me3 | Millipore | 05-1242 | |
| Fast Syber Green Master Mix | Aplicado Biossistema | 4385612 | |
| ViiA7 | Aplicado Biossistema | ||
| TruSeq ChIP Kit de Preparação de Biblioteca | Illumina | IP-202-1012 | |
| HiSeq 2000 | Illumina |
Referências
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. , (2004).
- Cardamone, M. D., et al. Mitochondrial Retrograde Signaling in Mammals Is Mediated by....
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Reimpressões e permissões
