Gravações simultâneas de potenciais de campo corticais Local e Electrocorticograms em resposta a estímulos nociceptivos Laser de ratos movimentando-se livremente

Summary

Desenvolvemos uma técnica que registra simultaneamente tanto eletrocorticografia e potenciais de campo local em resposta a estímulos nociceptivos do laser de ratos movimentando-se livremente. Esta técnica ajuda a estabelecer uma relação direta dos sinais de electrocortical o nível macroscópico e mesoscópica e que facilita a investigação de informação nociceptiva processamento no cérebro.

Abstract

Electrocortical respostas, eliciadas pulsos de calor do laser que seletivamente ativam terminações nervosas livre nociceptiva, são amplamente utilizadas em muitos estudos animais e humanos para investigar o processamento cortical da informação nociceptiva. Estes potenciais de cérebro do laser-evocados (Pels) consistem de várias respostas transientes que são tempo-fechado para o início dos estímulos do laser. No entanto, as propriedades funcionais das respostas a LEP ainda são em grande parte desconhecidas, devido à falta de uma técnica de amostragem que pode simultaneamente gravar atividades neurais na superfície do córtex (i.e., electrocorticogram [ECoG] e couro cabeludo eletroencefalograma [couro cabeludo EEG]) e no interior do cérebro (ou seja, local campo potencial [LFP]). Para resolver esse problema, apresentamos aqui um protocolo animal utilizando ratos andando livremente. Este protocolo é composto por três processos principais: (1) animal preparação e procedimentos cirúrgicos, (2) uma gravação simultânea de ECoG e LFP em resposta a estímulos nociceptivos do laser e extração de dados (3) análise e recurso. Especificamente, com a ajuda de uma casca protetora 3D-impresso, ambos ECoG e LFP eletrodos implantados no crânio o rato está firmemente realizaram juntos. Durante a coleta de dados, pulsos de laser foram entregues na dianteiras do rato através de aberturas no fundo da câmara, quando o animal estava na quietude espontânea. Em curso de ruído branco interpretou o ultra-som gerado pelo laser para evitar a ativação do sistema auditivo. Como consequência, apenas respostas nociceptivos seletivamente foram gravadas. Usando os procedimentos analíticos padrão (por exemplo, filtragem de passa-banda, extração de época e correção de linha de base) para extrair respostas do cérebro relacionadas com estímulo, obtivemos resultados mostrando que Pels com uma alta relação sinal-ruído foram ao mesmo tempo gravado a partir de eletrodos ECoG e LFP. Esta metodologia possibilita a gravação simultânea de actividades ECoG e LFP, que fornece uma ponte de sinais de electrocortical o nível macroscópico e mesoscópica e facilitando a investigação do processamento da informação nociceptiva no cérebro.

Introduction

EEG é uma técnica para registrar potenciais elétricos e atividades cerebrais oscilatório geradas pelas atividades sincronizadas de milhares de neurônios no cérebro. Popularmente é usado em muitos estudos básicos e aplicações clínicas^1,2. Por exemplo, respostas de EEG para laser intenso calor pulsos (ou seja, Pels) são amplamente adotado para investigar o processamento central e periférico de entrada sensorial nociceptiva^3,4,5. Em humanos, Pels consistem principalmente em três deflexões distintas: o componente precoce (N1) que é somatotopically organizado e é provável que refletem a atividade do córtex somatossensorial primário (S1)⁶e os componentes de tarde (N2 e P2) que são centralmente distribuída e mais propensos a refletir a atividade do córtex somatossensorial secundário, insula e o córtex cingulado anterior^7,8. Em anteriores estudos^9,10, demonstrámos aquele rato Pels, amostrado usando ECoG (um tipo de EEG intracraniano) de eletrodos colocados diretamente sobre a superfície exposta do cérebro, também consistem em três distintas deflexões ( ou seja,, somatotopically organizou a N1 e a N2 centralmente distribuído e P2). A polaridade, ordem e topografia dos componentes rato LEP são semelhantes aos humanos Pels¹¹. No entanto, devido a resolução espacial limitada do couro cabeludo EEG e subdural ECoG gravações¹², assim como a natureza imprecisa do EEG fonte análise técnicas¹³, a contribuição detalhada das atividades neurais para os componentes do LEP é muito debatido. Por exemplo, é incerto se e na medida em que S1 contribui para a primeira parte da resposta cortical (N1) eliciada laser estímulos⁶.

Diferente da técnica da gravação nas macroscópicas diretas, nível intracraniana as gravações usando arrays microwire auxiliados por um aparelho estereotáxica e microdrives^14,15 poderia medir atividades neurais (por exemplo, LFPs ) de regiões específicas. LFPs reflectem sobretudo o somatório dos potenciais pós-sinápticos excitatórios ou inibitórios de populações neuronais locais¹⁶. Desde atividades neurais LFP-amostrados refletem processos neuronais que ocorrem dentro de centenas de micrômetros em torno do eletrodo de gravação, esta técnica de gravação é amplamente utilizada para investigar as informações de processamento do cérebro ao nível mesoscópica. No entanto, apenas se concentra em mudanças locais precisas das actividades do cérebro e não pode responder à pergunta de como os sinais de várias regiões são integrados (por exemplo, como componentes LEP são integrados em várias regiões do cérebro).

É interessante notar que a gravação simultânea de um ECoG e corticais LFPs de mover-se livremente ratos poderia facilitar a investigação de informações corticais processamento em ambos macroscópica e mesoscópica níveis. Além disso, esta metodologia oferece uma excelente oportunidade para investigar a extensão a que as atividades neurais das regiões cerebrais predefinidos contribuem para as Pels. De fato, vários estudos anteriores avaliaram a coerência entre espinhos, LFP cortical, e ECoG sinaliza^17,18 e demonstrou que a LFP^19,20 adjacente para o eletrodo de EEG contribui para o formação de respostas relacionadas com estímulo cerebral. No entanto, a técnica existente geralmente é usada para gravar as respostas do cérebro de animais anestesiados, devido a falta de uma casca protetora para evitar que os eletrodos sendo danificado pela colisão. Em outras palavras, a técnica que poderia construir a ponte de electrocortical sinais no mesoscópica (LFP cortical) e macroscópicos níveis (EEG e ECoG) em ratos movimentando-se livremente é ainda insuficiente.

Para resolver este problema, desenvolvemos uma técnica que poderia gravar um ECoG e LFPs corticais em várias regiões do cérebro simultaneamente de ratos movimentando-se livremente. Esta técnica ajuda a estabelecer a relação direta dos sinais de electrocortical o nível macroscópico e mesoscópica e facilitando a investigação de informação nociceptiva processamento no cérebro.

Protocol

No experimento, utilizaram-se ratos Sprague-Dawley macho adulto (pesando 400-450 g). Todos os procedimentos cirúrgicos e experimentais seguiram o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório do institutos nacionais da saúde. Os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de ética de pesquisa no Instituto de psicologia, da Academia Chinesa de Ciências.

1. eletrodo implantação

1. Anestesia o rato em uma câmara com isoflurano 5% e uma taxa de fluxo de ar de 1 L/min antes da cirurgia.
2. Usando um aparelho estereotáxica, fixe a cabeça do rato com seu nariz colocado dentro da máscara anestésica. Administra isoflurano através da máscara anestésica em uma concentração de 2%, com uma taxa de fluxo do ar de 0,5 L/min para manter a profundidade anestésica durante a cirurgia. Observe que a tolerância cirúrgica é alcançada quando o rato não responder ao dedo do pé-beliscar.
3. Aplica a pomada oftálmica nos olhos para evitar a secura da córnea.
4. Raspe a parte superior do couro cabeludo rato usando uma máquina de barbear padrão.
5. Esterilize o couro cabeludo usando o médico Iodofor desinfetante solução e 75% álcool para remover o iodo.
6. Injete lidocaína (2%) no couro cabeludo para analgesia local. Administre atropina (i.p. de 0,2 mL) para inibir respiratória hipersecreção.
7. Fazer uma incisão de aproximadamente 2-3 cm no couro cabeludo com um bisturi. Cortar e remover a parte do couro cabeludo ao longo da linha mediana e expor o crânio. Use o electrocoagulador para parar o sangramento, quando necessário.
8. Marca a localização dos eletrodos de ECoG baseados nas coordenadas predefinidas estereotáxicos (colocadas de acordo com a posição do Bregma) e as localizações dos eléctrodos de referência e o chão sobre a linha média (colocado 2 e 4 mm caudalmente para a Lambda, respectivamente).
9. Furos (diâmetro: 0,5 mm) para os parafusos de ECoG, usando uma furadeira elétrica craniana no crânio dos locais marcados, sem destruir a dura-máter.
10. Conduzir um parafuso de aço inoxidável (diâmetro externo: 0.6 mm), que se conecta ao fio de cobre revestido de isolamento, no furo de aproximadamente 1 mm de profundidade sem penetrar a dura-máter subjacente. Estes parafusos atuam como ECoG, referência e eletrodos de terra durante o experimento.
11. Coloque uma casca protetora base no crânio. Fixe a base com os parafusos adjacentes no crânio usando acrílico dental. Use algodão médico que poderia ser removido posteriormente para proteger a área que se destina a ser utilizada para implantação de fio profundidade de ser coberto.
    Nota: A casca protetora é um produto de polilático de 3D-impressos personalizados, que consiste de três partes: uma base, uma parede e um boné. A parede é coberta por cobre afunilando para construir como uma gaiola de Faraday.
12. Marque os locais dos eléctrodos de fio de profundidade baseados nas coordenadas estereotáxicos predefinidas.
13. Faça pequenos furos (diâmetro: 0,2 mm) no crânio ao redor os sites marcados para implantação de fio e remova cuidadosamente o retalho ósseo para expor a dura-máter. Lave a craniotomia com frequência, utilizando solução salina normal. A Figura 1 descreve o set-up antes da implantação de eletrodos de fio a profundidade.
14. Usando uma agulha, levante e cortar a dura-máter, sem danificar a superfície do neocórtex, vasos e a pia-máter.
15. Abaixar os eletrodos de fio de profundidade para a superfície do neocórtex e, em seguida, lentamente penetram no cérebro para a profundidade de alvo. Frequentemente pare a percorrer os eléctrodos para a resiliência cortical. No presente estudo, a profundidade da ponta do fio é 0,5 mm abaixo da superfície cortical.
16. Sele a craniotomia com uma mistura de cera e parafina óleo para assegurar que os eletrodos de fio de profundidade podem ser movidos para subsequentes manipulações experimentais.
17. Conserte o aparelho de eletrodo usando acrílico dentário no crânio.
18. Cada fio de cobre que se conecta ao parafuso ECoG no canal correspondente no módulo conector da solda. Cobrir os pontos de solda usando argila para evitar o contato de potencial entre os diferentes canais.
19. Montar a parede de casca protetora para a base e soldar os eletrodos de referência e terra para os canais correspondentes.
20. Fixe a tampa para a casca protetora usando fitas para evitar contaminação.
21. Injetar o rato com penicilina (60.000 U, i.p.) imediatamente após a cirurgia para evitar infecções pós-cirúrgicas.
22. Single-casa do rato em uma temperatura e umidade-controlada da gaiola e mantê-lo em um ciclo de dia/noite-12 h após a cirurgia, com comida e água ad libitum pelo menos uma semana antes do experimento LEP.
    Nota: Para gravar simultaneamente ECoG e atividades corticais de LFP, um aparato foi usado aqui que foi montada com dois tipos de eletrodos ligados a um módulo de conexão, que continha vários microdrives anexados para as matrizes de fio de tungstênio. Os pinos de ouro foram usados para conectar os fios de tungstênio para a placa de interface de eletrodo (BEI) do módulo conector pressionando os fios nos furos pequenos de metal sobre o BEI. Dois furos metais o BEI foram soldados com fios de cobre revestidos, e a extremidade aberta de cada fio de cobre foi soldada com o fio de cobre correspondente conectado ao parafuso de ECoG. Os detalhes de fabricação tem sido descrito em outros lugares,²¹.

2. coleta de dados

1. Cócegas o rato pelo menos 1 x por dia durante três ou mais dias consecutivos antes do experimento para garantir que o rato fica familiarizado com o experimentador²².
2. Coloca o rato na câmara de comportamento pelo menos 1 h antes do experimento para garantir que o rato acclimatizes para o ambiente de gravação.
   Nota: A câmara é um cubo de plástico com um comprimento lateral de 30 cm. O fundo da câmara é feito de uma grade de ferro com lacunas ~ 8 mm.
3. Conectar-se a headstage de gravação com o módulo de eletrodo suavemente, para evitar assustar o rato e danificar o módulo do eletrodo.
4. Configurar o gerador do laser, conectar a fibra óptica e ajustar o tamanho de ponto do laser de acordo com o manual do operador do equipamento. Conecte a saída digital do gerador de gatilho para a porta de entrada digital do Conselho de gravação.
   Nota: tenha cuidado para não enrolar a fibra óptica excessivamente para evitar a quebra da fibra. Antes da gravação, certifique-se que os sinais de gatilho são exibidos e gravados pelo software de gravação. Neste protocolo, estímulos de calor radiante são gerados por uma perovskita de alumínio de ítrio infravermelho de neodímio (Nd: YAP) laser com um comprimento de onda de 1,34 μm. O diâmetro do tamanho de ponto do laser é fixado em cerca de 5 mm por lentes de focalização. Um laser He-Ne apontou para a área estimulada, que é definida dependendo do objetivo do experimento. Além disso, a energia do estímulo dos pulsos de laser é determinada de acordo com o projeto experimental. A duração do pulso do laser é 4 ms.
5. Configurar a câmera de vídeo por baixo do canto da câmara experimental para gravar continuamente os comportamentos nociceptivos do rato quando a pata recebe estímulos nociceptivos do laser. Ajuste a posição e a direção da câmera para certificar-se de que os comportamentos nociceptivos são totalmente gravados durante todo o experimento.
   Nota: Uma câmera de alta velocidade dispositivo de carga acoplada (CCD) é altamente recomendada, como ele pode entregar os sinais operacionais à placa principal do sistema de gravação para gravar o tempo de início e a duração do comportamento nociceptivo precisamente. Nociceptivos comportamentos são avaliados pelo experimentador após cada estímulo do laser, de acordo com critérios definidos anteriormente, baseados o movimento animal^23,24, da seguinte maneira: sem movimento (Pontuação = 0), cabeça-girando (incluindo a tremer ou elevar a cabeça; Pontuação = 1), vacilar (ou seja, um pequeno corpo abrupto repuxa movimento; Pontuação = 2), retirada (ou seja, retração de pata do estímulo do laser; escore = 3), movimento lambendo e todo o corpo (Pontuação = 4).
6. Entrega em curso ruído branco (50 dB SPL) através de um alto-falante na parte superior da câmara.
   Nota: Conforme mostrado em anteriores estudos^10,25, estimulação do laser entregada na pele gera ultra-sonografias que podem ser detectadas pelo sistema auditivo de rato. Por esta razão, em curso de ruído branco é jogado durante todo o experimento, para evitar a ativação do sistema auditivo em resposta a ultra-sonografias gerado pelo laser. Este procedimento permite a gravação seletiva de respostas do cérebro relacionadas com a ativação do sistema nociceptivo.
7. Colete os dados eletrofisiológicos de tanto o ECoG e os eletrodos de fio de profundidade, usando o sistema de gravação de acordo com o manual do operador do equipamento.
   Nota: Os sinais de funcionamento da câmera e o gatilho sinais dos pulsos de laser são amostrados simultaneamente com os dados eletrofisiológicos na mesma taxa de amostragem (todos os dados são amplificados e digitalizados usando uma taxa de amostragem de 20.000 Hz), que garante que todos os dados são sincronizadas.
8. Entrega os pulsos de laser para a plantar da pata do rato com as aberturas na parte inferior da câmara.
   Nota: O estímulo do laser só é entregue quando o rato é quietude espontânea por mais de 2 s com base na observação do experimentador, para minimizar a contaminação do sinal dos artefatos relacionados ao movimento. Para evitar a fadiga do nociceptor ou sensibilização, o alvo do feixe de laser é deslocado manualmente após cada estímulo, e o intervalo de interstimulus nunca é menor do que 40 s. ECoG e LFP sinais podem ser gravados várias vezes de cada rato. O rato precisa ser colocado na câmara experimental 1h antes de cada sessão de gravação. Afinal de contas as sessões de gravação, o rato estava anestesiado profundamente e perfundidos transcardially com gelada fosfato salino seguido por paraformaldeído 4%. O cérebro foi removido do crânio e seccionado para identificar as posições de eletrodo.

3. análise de dados

1. Filtre os dados contínuos com um filtro passa-faixa entre 1 e 30 Hz.
2. Época os dados usando uma janela de análise de 3 s, estendido de 1 s antes de 2 s após o início dos estímulos do laser. Correção de linha de base é realizada subtraindo-se a amplitude média dentro do intervalo de prestimulus.
3. Manualmente rejeite as épocas que são contaminadas por artefatos brutos.
4. Calcule as formas de onda LEP em média que são tempo-fechado para o início dos estímulos do laser para cada condição experimental.
5. Calcule que a coerência de transformação wavelet (WTC) de formas de onda LEP gravado a partir de ECoGs e profundidade eletrodos de fio.
   Nota: O WTC é uma técnica para realizar a coerência entre pares de eletrodos em função do tempo e frequência. O WTC entre dois sinais pode ser calculado para qualquer ponto do tempo-frequência, que tem a vantagem de gerar valores de coerência para todo o espectro de frequência-tempo. Os detalhes da metodologia tem sido descrito em outros lugares,²⁶.

Results

No experimento de representante, os dados eletrofisiológicos de cinco ratos foram gravados. O estímulo do laser foram entregues para a pata dianteira direita de cada rato para 20 vezes com > 40 intervalos de interstimulus s. O cérebro do laser-evocadas respostas foram gravadas usando ECoG parafusos e fios de profundidade e os fios de profundidade foram implantados nos córtices somatossensorial primárias bilaterais (S1) e córtices de motor primários (M1).

Discussion

No presente estudo, descrevemos uma técnica para gravar simultaneamente ECoGs e respostas LFP corticais eliciadas por estímulos nociceptivos do laser de ratos movimentando-se livremente. Os resultados mostraram que respostas LEP podem ser claramente detectadas após o início dos estímulos do laser em sinais tanto ECoG e LFP. A gravação simultânea de ECoG e cortical LFP sinais permitirá que os cientistas investigar suas relações para melhor compreender a contribuição das atividades neuronais para os componentes do LEP.

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ratos machos Sprague-Drawley	Vital River
Isoflurane	RWD Ciências da Vida
Sistema anestésico de isoflurano para pequenos animais	RWD Ciências da Vida		Incluindo a máscara de gás de anestesia para ratos
Aparelho estereotáxico	RWD Ciências da Vida
O aparelho com eletrodos			ECoG e LFP combinadosO aparelho é feito em casa, que monta os eletrodos ECoG e de fio de profundidade em um módulo conector
		protetor impresso em 3D	A textura do invólucro é polilática e o invólucro é caseiro e contém três partes: uma base, uma parede e uma tampa. A parede é coberta por velas de cobre para construir como uma gaiola de Faraday
Fios de tungstênio (diâmetro: 50 mm)	California Fine Wires Company		Os eletrodos para gravação cortical LFP
Parafusos de aço inoxidável (diâmetro: 0,6 mm)			Os eletrodos para gravação ECoG
Broca craniana elétrica	RWD Life Science
Broca (diâmetro: 0,5 mm)	RWD Ciências da Vida		A broca é usada para perfurar os furos de parafusos ECoG
Broca (diâmetro: 0,2 mm)	RWD Ciências da Vida		A broca é usada para perfurar os furos de fios de profundidade
Pó arílico dental	SNC dental
Líquido arílico dental	SNC parafina dental
	Fisher Scientific		A mistura é usada para selar a craniotomia para garantir o seguinte movimento de matrizes de micro-fios
Óleo Mineral	Fisher Scientific
Eletrocoagulador	da Bovie medical Corporation
	Intan Technologies		Um sistema de RHD2000 headstage de 32 canais
	Intan Technologies		O sistema de aquisição de dados
Gerador de laser de perovskita de neodímio ítrio e alumínio infravermelho (Nd:YAP)	Engenharia Eletrônica
Matlab R2016b	The MathWorks