Novo processo de impressão 3D Decellularized matrizes

Summary

Este protocolo descreve a produção de filamento policaprolactona (PCL) com microesferas de (PLA) de ácido polilático incorporado que contêm matrizes decellularized (DM) para impressão 3D estruturais de engenharia de tecidos construções.

Abstract

Bioprinting 3D visa criar andaimes personalizados que são biologicamente ativos e acomodar o tamanho desejado e geometria. Um backbone de termoplástico pode fornecer estabilidade mecânica semelhante ao tecido nativo enquanto agentes biológicos oferecem pistas composicionais de células progenitoras, levando a sua migração, proliferação e diferenciação para reconstituir os tecidos originais / órgãos^1,2. Infelizmente, muitos compatível com impressão 3D, polímeros biorreabsorvível (tais como o ácido polilático, PLA) são impressas em temperaturas de 210 ° C ou superior - temperaturas que são prejudiciais para produtos biológicos. Por outro lado, policaprolactona (PCL), um tipo diferente de poliéster, é uma matriz, material para impressão 3D que tem uma temperatura de impressão mais suave de 65 ° C. Portanto, foi hipotetisado que decellularized da matriz extracelular (DM) contido dentro de uma barreira PLA termicamente protetora poderia ser impresso dentro do filamento PCL e permanecem na sua conformação funcional. Neste trabalho, osteocondrais reparação foi a aplicação para a qual foi testada a hipótese. Como tal, cartilagem porcina foi decellularized e encapsulada em ácido polilático (PLA) microesferas que então foram extrudadas com policaprolactona (PCL) em filamento para produzir construções 3D através de fundidos modelagem de deposição. As construções com ou sem as microesferas (PLA-DM/PCL e PCL(-), respectivamente) foram avaliados para diferenças nas características da superfície.

Introduction

Técnicas de engenharia de tecido atual para aplicações clínicas tais como reconstrução de osso, cartilagem, tendão e ligamento usam autoe aloenxertos para reparar tecidos danificados. Cada uma dessas técnicas é de executada rotineiramente como um "padrão ouro" na prática clínica, pela primeira colheita do tecido do doador do paciente ou uma partida de fetos morta e em seguida, colocando o tecido do doador para o local do defeito². No entanto, estas estratégias são limitadas pela morbidade local doador escassez local doador para grandes defeitos, risco de infecção e a dificuldade em encontrar enxertos que correspondem a geometria desejada. Além disso, estudos têm mostrado que usado para a reconstrução de aloenxertos reduziram propriedades mecânicas e biológicas, quando comparado com o tecido nativo³. Com estas considerações em mente, os engenheiros de tecido recentemente giraram para três dimensional bioprinting (3D) para produzir personalizadas, complexas geometrias que são biologicamente ativos e projetado para acomodar o tamanho do defeito e forma ao fornecer suficiente Propriedades mecânicas até remodelar biológica é completa.

Idealmente, um andaime 3D-impresso consistiria de um backbone de polímero que pode manter a estabilidade mecânica necessária do tecido nativo enquanto os biologics incorporados oferecem sinais bioquímicos ao redor de células, levando à sua migração, proliferação, diferenciação e produção de tecido^2,5. Infelizmente, a maioria das construções que contêm componentes biológicos são feitas com gel ou polímeros que são demasiado fracos para suportar forças na vivo vividas por tecidos alvo para reconstrução de auto/aloenxerto. Outros polímeros tais como o ácido polilático (PLA) são biorreabsorvível, 3D para impressão e estruturalmente som, mas são impressos em temperaturas igual ou superior a 210 ° C - tornando-se impossível para ser impresso co durante a fabricação de produtos biológicos. Policaprolactona (PCL) é outro FDA-desmarcada, biorreabsorvível polímero que pode ser 3D imprimido em uma temperatura mais baixa (65 ° C), que se tornou cada vez mais popular na fabricação de implantes de paciente específico com morfologias complexo^{5,6 ,7,8,9}. No entanto, a maioria dos bioprinters usando tecnologia pneumática impossibilitam a impressão PCL a temperaturas mais baixas, onde atividades biológicas podem ilesos. Até à data, a integração destes polímeros com auto/aloenxertos em um romance printable biomaterial ainda tem de ser realizado. Na ausência de um material, uma abordagem de engenharia de tecidos verdadeiro para reconstrução de tecidos é improvável. Portanto, temos procurado combinar PLA, PCL e decellularized matrizes aloenxerto (DM) para utilizar as vantagens de cada material para fabricar uma construção viável capaz de reconstruir tecidos complexos. Este processo seria fornecer resistência mecânica inicial necessária para resistir a forças na vivo e a estabilidade térmica para acomodar fabricação aditiva em uma construção que induz a formação do tecido desejado.

Em uma recente tentativa de abordar os obstáculos acima mencionados, nós mostramos que é viável para encapsular a matriz extracelular da cartilagem decellularized dentro de uma barreira PLA termicamente protetora que pode ser extrudada dentro de filamentos PCL, mantendo a capacidade de DM para influenciar as células circundantes de host². Isso inspirou-na procurar abordagens clinicamente eficazes para reconstrução de tecidos. No estudo atual, nós utilizamos a tecnologia de plataforma para construir andaimes de tudo-em-um que incluem PLA, DM e PCL (PLA-DM/PCL).

Nosso objetivo é melhorar a eficácia e a utilidade dos enxertos usando a técnica de biofabrication romance proposto com mais precisão recapitular tecido nativo, para, finalmente, usá-los em várias aplicações.

Protocol

1. obtenção e pré-processamento de microesferas

1. Microesferas de produzir com a matriz desejada encapsulado (PLA-DM)².
   Nota: É imperativo que as microesferas são de tamanho uniforme. Por esta razão, é essencial peneirar os microesferas antes de usar. Apesar de encapsulamento e decellularization matriz tem sido detalhados em anteriores Publicações², segue um breve resumo do processo.
   1. Primeiro, colha cartilagem plugues de suínos membros posteriores. Decellularize da cartilagem em uma série de lavagens com 0,05% tripsina/0.5 mm tetrassódico etilenodiaminotetracético ácido (EDTA), Dulbecco modificada do águia médio (DMEM) e 1,5% de ácido peracético e 2,0% Triton X-100 para 4 h com lavagens de água destilada antes e após cada etapa².
   2. Escorra a matriz decellularized, congelá-lo, lyophilize, triturar e dissolver-se solução de pepsina. Após a dissolução, misture a solução de pepsina com PLA que foi dissolvido em diclorometano.
   3. Adicione a mistura de gota a gota em um álcool polivinílico 3% em solução aquosa. Centrifugar as microesferas resultantes, enxaguar, dreno e lyophilize novamente.
      Nota: Para obter detalhes completos sobre o processo de ver o protocolo publicado anteriormente no².
2. Peneire as microesferas.
   1. Certifique-se de que todas as placas de peneira foram cuidadosamente limpos e secos antes da utilização. Se necessário, limpar peneiras usando limpador ultra-sônico para garantir que todas as esferas são retiradas da peneira.
   2. Monte o agitador de peneira com o 106 criva µm no topo, bandeja do 53 µm após isso e a peneira bandeja na parte inferior.
   3. Coloque microesferas secas na bandeja da peneira superior e coloque a tampa na bandeja superior. Ligue o peneiramento grosso de 8 a 10 min. repetir na multa por 8 a 10 min.
      Nota: Os tempos de peneira podem precisar ser aumentado ou diminuído dependendo do lote.
   4. Cuidadosamente, retirar as placas de peneira um por um e colocá-los de cabeça para baixo em um papel de grande pesar. Bata nos lados suavemente para garantir que a maioria das esferas caíram fora da peneira e no papel.
   5. Descartar as esferas de grandes dimensões (> 106 µm) e esferas subdimensionadas (< 53 µm). Adicione esferas que estão na faixa de tamanho de 53 a 106 µm para um tubo de centrifugação rotulados com o tipo e o lote número, em seguida, coloque no congelador-20 ° C até nova utilização.

2. controle da qualidade microesfera avaliações

Nota: Consulte a Figura 1.

1. Realize a avaliação macroscópica/visual para verificar que as microesferas são uniformes e esférico, com presentes não agregados.
2. Avalie as microesferas usando uma varredura micrografia eletrônica (SEM).
   1. Por isso, microesferas de lugar para um SEM o chuck e salpicar o casaco com ouro-paládio em atmosfera de argônio usando um sputter coater para uma espessura de 4 nm.
   2. Observar as características da superfície, morfologia e diâmetros das microesferas usando um 10 kV acelerando a tensão e uma distância de trabalho de 10 mm para garantir que a produção e peneiramento das microesferas foi bem sucedida.

3. o filamento criação para impressão 3D

1. Medir e registrar a massa das microesferas obtidas as etapas 2 e 3; pelo menos 25 g é necessária.
2. Adicione o pó de policaprolactona (PCL) para as microesferas para uma relação de peso de 1:4 de microesferas para PCL.
3. Misture a mistura de pó em um misturador de rolamento miniatura a 20 rpm por 5 min e depois virar o recipiente e misture a 20 rpm para um adicional 5 min (ver Figura 2).
4. Muitos extrusoras comercialmente disponíveis (consulte a Tabela de materiais) tem jaquetas isolantes porque as suas temperaturas de trabalho pretendido são para filamentos de deposição fundida tradicional modelagem (FDM). Modificar a extrusora (se necessário), removendo o material de isolamento e usá-lo em combinação com fãs de área de trabalho (que soprar ar ambiente para a extrusora e filamentos extrudados) usar da extrusora a baixas temperaturas.
   Nota: Desktop fãs que soprar ar ambiente para arrefecer a extrusora e filamentos são úteis para este procedimento.
5. Instalação a instalação de equipamentos para extrusão. Veja a Figura 3.
   1. Instalação da extrusora para que sua saída é ~ 60 cm a partir da entrada para o spooler, com um caminho direto para a entrada de spooler da tomada da extrusão.
      Nota: O spooler pode opcionalmente ser Erguido 3-4 polegadas do banco se encontra-se que o filamento está se inclinando a ponto de tocar a bancada.
   2. Coloque um ventilador desktop ~ 15 cm desde a jaqueta de aquecimento e direccioná-la para a jaqueta de aquecimento para oferecer resfriamento com ar ambiente em toda a produção de filamento. Coloque um segundo ventilador aproximadamente a meio caminho entre a extrusora e spooler e direccioná-la para o extrudate para ajudar a refrigerar o filamento com ar ambiente.
   3. Ajuste o posicionamento conforme necessário durante todo o processo.
6. Definir a extrusora modificada aquecimento elemento a 52 ° C, o desktop ventiladores de refrigeração e deixe o instrumento vir ao equilíbrio de 20 a 30 min.. Certifique-se de que o bocal adequado é anexado para a extrusora.
7. Pouco antes do início, encha o funil da extrusora com a mistura de microesfera/PCL da etapa 3.3. Ative o spooler e o trado de extrusora para iniciar a extrusão do filamento.
8. Quando o filamento inicial é extrudado, manualmente puxar o extrudate da tomada da extrusão com fórceps e alimentá-lo para o spooler do filamento.
9. O filamento desejado levará algum tempo para sair o spooler. Utilizando bobinas separadas ou fita, marca claramente quando a composição de filamento aparece visualmente uniforme.
10. Acompanhar de perto o processo e modificar parâmetros conforme necessário. Ajuste a temperatura da extrusora, velocidade de extrusão do eixo helicoidal e velocidade de spooler para obter um filamento de diâmetro de 1,75 mm, medida por pinças. Ajuste os fãs conforme necessário para esfriar o filamento corretamente para evitar cortes transversais de filamento não circular. Misture e volte a encher o depósito de lixo, se necessário.
    Nota: Muita atenção é necessária durante este processo de obtenção de filamento adequado para posterior impressão 3D. Os parâmetros acima irão mudar dependendo das condições ambientais, o nível de preenchimento e a uniformidade da mistura no funil e a dinâmica de termodinâmica e fluxo dos lotes específicos de PCL e microesferas.
11. Continue expulsando até todo o pó tem sido utilizado e o funil está quase vazio. Adicione o pó PCL (sem microesferas) para o funil para expulsar a mistura de microesfera que está atualmente na extrusora. Continue adicionando pó PCL para o depósito de lixo até não mais microesferas são visíveis no extrudate.
12. Certifique-se de rotular e separam o filamento que contém as microesferas na concentração desejada, como quando o filamento é arrefecido é mais difícil de distinguir o filamento uniforme de filamento não-uniforme.
13. Continuar até que haja pó mínimo deixada no funil de extrusão e, em seguida, desligue o spooler, trado de extrusora, elemento de aquecimento da extrusora e fãs.

4. impressão com o filamento

1. Desenha uma geometria da forma desejada e formulário usando um software de desenho auxiliado por computador. Em seguida cortar o modelo e ditar o toolpath usando software de corte que é compatível com a máquina de impressão 3D sendo usada.
2. Carrega o filamento da etapa 3 para qualquer impressora padrão do FDM, equipado com bicos padrão do diâmetro desejado (normalmente de 0,4 mm). Começa a impressão (normalmente a 65-70 ° C e 300 mm/min velocidade linear), como o filamento personalizado é camada por camada depositada pela máquina.
3. Certifique-se de uma atenção especial para a primeira camada e ajuste as configurações conforme necessário para obter uma boa qualidade de impressão.
   Nota: Podem ser feitos ajustamentos para a velocidade de impressão, impressão da temperatura, temperatura de plataforma, multiplicador de extrusão e outros parâmetros. Referir-se a impressora e o guia de solução de problemas de corte do fabricante para obter assistência adicional.

5. avaliação do controle da qualidade

1. Coloque as construções impressas SEM mandris e salpicar o casaco com ouro-paládio em atmosfera de argônio usando um sputter coater para uma espessura de 4 nm.
2. Observar ao microscópio usando um 10 kV acelerando a tensão e uma distância de trabalho de 10 mm para verificar as características da superfície e a presença ou ausência de microesferas, se aplicável.

6. teste funcional das construções de impressas

Nota: A fosfatase alcalina (FAL ou ALP) pode ser usada como um substituto para a matriz de decellularized para determinar se proteínas encapsuladas são biologicamente ativas, após o processo de produção do filamento. ALP é usado porque ela catalisa uma reação de um substrato, p-nitrofenil fosfato, para mudar de incolor a amarelos subprodutos, p-nitrofenol e fosfato inorgânico, mas somente se ALP é a conformação funcional.

1. Imprimir uma geometria (n = 3) que tem uma massa final de pelo menos 400 mg com o filamento de microesfera ALP (PLA-ALP/PCL) usando parâmetros de impressão idênticos como os andaimes de PLA-DM/PCL. Também de impressão PCL-única (PCL(-)) andaimes de mesma geometria como os andaimes de PLA-ALP/PCL. Mergulhe-os em 1 mL de tampão de Tris-HCl e incubar por 24 h a 37 ° C e 110 rpm rotação para permitir a difusão de enzima.
2. Adicionar 1 mL de fosfato p-nitrofenil de 1 mg/mL, dissódico hexa-hidratado em Tris-HCl. Incubar a 37 ° C, 110 rpm para um adicional h 10. ler a absorbância sobrenadante no 415 nm.

Results

Depois de peneirar, microesferas devem aparecer uniformes e ser livre de agregados. Sob SEM, as microesferas peneiradas podem ter pequenos poros em sua superfície, mas caso contrário vão ser esférica e Lisa, como mostrado na Figura 1. Todos os filamentos extrudados devem ser de diâmetro uniforme e seção transversal circular. Um filamento que contém microesferas (PLA-DM/PCL) terá um ligeiramente mais fosco terminar enquanto um PCL-only (filamento PCL(-)) ficar...

Discussion

Ambos decellularized matrizes e 3D impresso PCL andaimes independentemente foram mostrados para permitir a adesão e proliferação de células, validando seu uso para osteocondrais reparar^10,11,12. O uso da matriz decellularized em abordagens de engenharia para reparação tecidual tem sido um assunto de muito interesse e sucesso no recente passado^2,3,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Máquina de peneira	Haver & Boecker Tyler	Ro-Tap RX 29-E Peneira Pura
90 um	Fisherbrand	170328156	No. 170
Peneira 53 um	Fisherbrand	162513588	No. 270
Peneira 106 um	Fisherbrand	162018121	No. 140
Revestidor por pulverização catódica	Leica	n/a
Microscópio Eletrônico de Varredura	Hitachi, EUA	n/a
Filabot EX2	Filabot.com	FB00061
Filabot Spooler	Filabot.com	FB00073
CAPA 6506	Perstorp	24980-41-4
Solução salina tamponada com fosfato, PBS	Gibco	10010023
Comfort Zone	de 6",	n/a
Banho de água ultrassônico	Cole Parmer	SK-08895-13
Dreamer	FlashForge	n/a
Mixer de Bateria	Feito sob medida	n/a	Equipamento similar: https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&persist=true&ip= no& gclid=CjwKCAjw- dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 dTjsraEsBGfhMEH7ytx LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ ixoC9GwQAvD_BwE
Micro Balance	Mettler Toledo, Fisher Scientific	01-913-851
Simplify3D	Simplify3D	n/a
SolidWorks	SolidWorks	n/a
Microesferas	Produzido internamente, veja simultaneamente submissão JoVE submissão
p-nitrofenil fosfato, sal dissódico, hexahidrato	Millipore	4876-5GM
Fosfatase, alcalina	Roche Diagnostics GmbH	10 713 023 001
Leitor de Absorbância	Tecan	Sunrise
Tris-HCl Buffer	Sigma-Aldrich	T6455-100ML
Agitador aquecido	Novo Brunswick Scientific	Excella E24