Aqui, apresentamos um método de distribuição de vetores de expressão viral no cérebro usando filmes de seda da fibroína. Esse método permite que o alvo entrega de vetores de expressão usando windows cranianas, cônico de fibras ópticas e fibras ópticas revestidas de seda/AAV.
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Artigo de método
Na Vivo Alvo expressão de proteínas de Optogenetic usando seda/AAV filmes
Neste artigo
Resumo
Resumo
A busca da compreensão de circuitos neurais como informações do processo em ordem à saída comportamental de unidade tem sido grandemente ajudadas pela recentemente desenvolvidos métodos ópticos para manipular e monitorar a atividade de neurônios em vivo. Esses tipos de experiências dependem de dois componentes principais: 1) implantáveis dispositivos que fornecem acesso óptico para o cérebro e proteínas 2) sensíveis à luz que fornecem uma leitura da atividade neuronal ou alterar a excitabilidade neuronal. Há um número de maneiras de expressar proteínas sensíveis à luz, mas injeção estereotáxica de vetores virais é atualmente a abordagem mais flexível, porque a expressão pode ser controlado com precisão temporal, genética e anatômica. Apesar da grande utilidade de vetores virais, entregando o vírus para o site de implantes óptico poses inúmeros desafios. Injeções de vírus estereotáxica exigem cirurgias que aumentam o tempo cirúrgico, aumentam o custo dos estudos e representam um risco para a saúde do animal. O tecido circundante pode ser fisicamente danificado pela seringa de injeção e por imunogênica inflamação causada pela entrega abrupta de uma cápsula de alta concentração de vírus. Alinhar as injeções com implantes ópticos é especialmente difícil quando o direcionamento de pequenas regiões profundas no cérebro. Para superar estes desafios, nós descrevemos um método para revestir vários tipos de implantes ópticos com filmes compostos de seda da fibroína e Adeno-associado vetores virais de (AAV). Fibroin, um polímero derivado de Bombyx mori, o casulo pode encapsular e proteger biomoléculas e podem ser transformadas em formas que variam de filmes solúveis a cerâmica. Quando implantado no cérebro, revestimentos de seda/AAV liberar o vírus na interface entre os elementos de óptica e o cérebro circundante, dirigindo a expressão precisamente onde é necessário. Este método é facilmente implementado e promete facilitar grandemente na vivo estudos da função do circuito neural.
Introdução
Na última década tem produzido uma explosão de engenharia proteínas sensíveis à luz para monitoramento e manipulação neural atividade1. Vírus para oferecer incomparável flexibilidade para expressar essas ferramentas optogenetic no cérebro. Em comparação com animais transgénicos, vírus são muito mais fáceis de produzir, transportar e armazenar, permitindo a rápida implementação das ferramentas do mais novos optogenetic. Expressão pode ser alvo geneticamente distintas populações neuronal, e vírus projetados para o transporte retrógrado ainda podem ser usados para direcionar a expressão baseada na conectividade neuronal2.
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Protocolo
Todos os experimentos envolvendo animais foram realizados em conformidade com os protocolos aprovados pela Harvard Comité permanente Cuidado Animal, seguir as orientações descritas no NIH nos guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório. Ratos de C57BL/6 adultos de ambos os sexos (6-15 semanas de idade) foram usados para todos os experimentos.
1. obter aquosa da fibroína de seda
- Preparar ou comprar aquosa da fibroína de seda (5-7,5% p/v).
2. mistura aquosa seda com vetores de expressão de AAV
- Escolha um vetor de expressão de AAV para conduzir a proteína optogenetic ou f....
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Resultados
Para avaliar o sucesso dos filmes de seda/AAV na condução de expressão, nós perfundidos animais 2-3 semanas após o implante e preparado com fatias de cérebro da região de interesse. Imagens de fluorescência das proteínas fluoróforo-tag optogenetic (YFP-ChR2) forneceu uma medida da extensão da expressão (Figura 1). Fibras ópticas típicas (230 µm de diâmetro) pode facilmente acomodar 200 nL de seda/AAV. Com a prática, experimentadores podem alcançar expressão a.......
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Discussão
O uso de seda/AAV para atingir a expressão de proteínas optogentic supera as limitações das abordagens que estão atualmente em uso. Embora muitos estudos com sucesso usam injeções de AAV para expressar proteínas optogenetic, é desafiador para alinhar a expressão para a dica de fibras ópticas, para regiões de todo o comprimento das fibras afiladas e à região de visualização de uma lente de sorriso. Por causa do desalinhamento entre componentes ópticos e optogenetic expressão, estereotáxicos injeções podem não ser confiáve.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores desejam agradecer J. Vazquez para ilustrações, d. Kaplan e C. Preda para reagentes e orientação útil e os laboratórios de Sabatini B. e C. Harvey para a imagem latente na vivo . A microscopia foi viabilizada pela M. Ocana e do centro de imagiologia de neurobiologia, apoiada em parte pelo centro de imagem Neural como parte de um nacional Instituto de doenças neurológicas e Stroke (NINDS) P30 núcleo centro conceder (NS072030). Este trabalho foi financiado pela Fundação da família de Khodadad GVR, Fundação Nancy Lurie marcas e por concessões do NIH, NINDS R21NS093498, U01NS108177 e R35NS097284 de NINDS para W.G.R e por uma comunhão de pós-doutorado de....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Fibroína de seda aquosa | Sigma | 5154-20ML | Fibroína de seda aquosa (5% p/v) para fazer filmes |
| Microinjetor para depositar seda/AAV | Drummond | 3-000-207 | Nanoject III injetor de nanolitros |
| Manipulador para segurar implantes | Narashige | MM-33 | Micromanipulador |
| Estereoscópio para visualizar depósitos de seda | AmScope | SM-6TX-FRL | 3.5X-45X Microscópio de zoom articulada trinocular com anel de luz |
| Câmara de vácuo para armazenar implantes | Ablaze | N/A | Câmara de Desgaseificação a Vácuo de 3,5 Quartos |
| Opcional, suporte de implante para armazenamento | N/A | N/A | Para armazenar fibras ópticas pré-fabricadas, perfure uma grade de furos de ~4 mm de profundidade com um diâmetro um pouco maior que o diâmetro da ponteira em um bloco de plástico. |
| Thorlabs | de fibra óptica | FT200EMT | Ø 200 µ m Core Multimode Fibra óptica para implantes de fibra |
| Virolas | Kientec | FZI-LC-230 | LC Virola de zircônia para implantes de fibra |
| Vários materiais para fabricação de implantes de fibra crônica | Vários | N/A | Para procedimento detalhado, consulte Ung K, Arenkiel BR. Implantação de fibra óptica para estimulação optogenética crônica do tecido cerebral. Jornal de experimentos visualizados: JoVE. 2012(68). |
| Implantes de fibra cônica | Optogenix | Lambda-B | Implantes de fibra cônica |
| Lentes GRIN | GoFoton | CLH-100-WD002-002-SSI-GF3 | Lentes GRIN |
| Pequenas janelas cranianas de vidro | Warner | 64-0726 (CS-3R-0) | Vidro de cobertura redondo pequeno, espessura #0 |
| Janelas cranianas de vidro grandes | Warner | 64-0731 (CS-5R-0) | Vidro de cobertura redondo pequeno, espessura |
| #0Vários materiais para a fabricação de janelas cranianas | Vários | N/A | Para procedimentos detalhados, consulte Goldey GJ et al. Janelas cranianas removíveis para imagens de longo prazo em camundongos acordados. Protocolos da natureza. Novembro de 2014; 9(11):2515. |
Referências
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Tervo, D. G., et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron. 92....
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Reimpressões e permissões
