Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Visualisering cellulære Gibberellin niveauer ved hjælp af NlsGPS1 Förster resonans energi overføre (FRET) Biosensor

Published: January 12, 2019 doi: 10.3791/58739
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Sainsbury Laboratory, University of Cambridge

Summary

Gibberellin Perception Sensor 1 (GPS1) er den første Förster resonans energi transfer-baseret biosensor til måling af de cellulære niveauer af gibberellin Phytohormoner med en høj spatiotemporelle opløsning. Denne protokol rapporter om metoden til at visualisere og kvantificere cellulære gibberellin niveauer ved hjælp af genetisk kodet nlsGPS1 biosensor i Arabidopsis hypocotyls og roden tips.

Abstract

Phytohormone gibberellin (GA) er en lille, mobile signalfunktion molekyle, der spiller en central rolle i frø spiring, cellulære strækforlængelse og udviklingsmæssige overgange i planter. Gibberellin Perception Sensor 1 (GPS1) er den første Förster resonans energioverførsel (FRET)-baseret biosensor, der giver mulighed for overvågning af cellulære GA niveauer in vivo. Ved at måle forholdet fluorescens emission af nukleare lokaliseret-GPS1 (nlsGPS1), er spatiotemporelle kortlægning af endogent og eksogent medfølgende GA gradienter i forskellige vævstyper muligt på cellulært niveau. Denne protokol vil beskrive hvordan du billede nlsGPS1 emission nøgletal i tre eksempel eksperimenter: steady state, før og efter eksogene gibberellin A4 (GA4) behandlinger, og over en tid-behandlingsforløb. Vi leverer også metoder til at analysere nlsGPS1 emission nøgletal ved hjælp af både Fiji og en kommerciel tre-dimensionel (3-D) Mikrograf visualisering og analyse software og forklare de begrænsninger og sandsynlige faldgruber for at bruge nlsGPS1 til at kvantificere gibberellin niveauer.

Introduction

Plante hormoner spiller en grundlæggende rolle i planternes vækst og udvikling. Disse små, mobile signaling molekyler er typisk reguleret på flere niveauer: biosyntesen, katabolisme og kortere og længere afstande transport1,2,3,4. Forståelsen af hormon signaling veje og downstream transcriptional svar har skærpet gennem årene. Men for at sammenkæde de forskellige cellulære svar af hormon signaling veje med regulerende input lede hormon distributioner, vi brug for spatiotemporelle kvantificering af hormonniveauer på cellulært niveau. FRET-baserede biosensorer, som kan afsløre Phytohormoner kan fremme forskernes evne til at kvantificere hormonniveauer på cellulært niveau. FRET-baserede biosensorer består af en FRET par (donor og acceptor fluorescerende proteiner) knyttet til en sensorisk domæne, der binder en specifikke ligand eller reagerer på en biologisk stimulus. For små molekyle biosensorer udløser ligand bindende en konformationel ændring af domænet sensoriske, der resulterer i en ændring af afstand og/eller orientering mellem de to fluorescerende proteiner af FRET parret. En ratiometric analyse af en FRET biosensor opnås ved spændende donor og måler fluorescens emission forholdet mellem acceptor over donor5,6. Ligand bindende detekteres som en ændring i denne emission forholdet7.

Vi har for nylig udviklet en FRET-baserede biosensor for anlægget hormon GA. GAs er en klasse af hormoner, der kan fremme frø spiring, cellulære strækforlængelse og udviklingsmæssige overgangen fra vegetative til blomstrende faser. NlsGPS1 biosensor er nukleare lokaliseret og giver et spatiotemporelle indblik i GA dynamics i forskellige plantevæv. I Arabidopsis celler, GA binder sig til opløselige receptorer, gibberellin-ufølsom dværg (GID), og komplekset inducerer nedbrydningen af DELLA proteiner, der fungerer som negative regulatorer af GA signalering2. Domænet GA sensoriske af nlsGPS1 består af Arabidopsis GA receptor (AtGID1C) forbundet med en 74-amino syre trunkering af et DELLA protein (AtGAI) og en FRET par bestående af forbedret dimerization varianter af Cerulean som donor fluorescerende proteiner og Aphrodite (et codon-diversificeret Venus) som acceptor fluorescerende protein8. NlsGPS1 biosensor er en høj-affinitet sensor for de bioaktive GA4 (Kd = 24 nM for GA4) og det kan udnyttes i forskellige vævstyper at kortlægge og kvantificere GA forløb. For at undgå fejlfortolkning af Arabidopsis GA niveauer in vivo, har vi også udviklet en nonresponsive variant af nlsGPS1 (nlsGPS1-NR) til brug som en negativ kontrol. NlsGPS1-NN protein bærer mutationer i GA-bindende lomme, der forstyrrer bindingen af GA og mutationer i DELLA protein, der forstyrrer interaktion med GID receptor proteiner7,9. Emission forholdet mønstre eller observerede ændringer i både nlsGPS1 og nlsGPS1-NN linjer kan betragtes artefakter ikke er direkte relateret til GA-bindende begivenheder. Det er også vigtigt at bemærke, at nlsGPS1 binding til GA4 er ikke hurtigt reversibel, og derfor, cellulære nlsGPS1 emission nøgletal bør fortolkes som repræsenterer den højeste nylige koncentration af GA i en given kerne snarere end de real-time steady state niveauer. Som en konsekvens, er en analyse af faldende GA niveauer ikke muligt med nlsGPS1.

Her giver vi en detaljeret protokol for at udnytte en nlsGPS1 biosensor i celler i modellen planten Arabidopsis, ved hjælp af Konfokal imaging-baserede tilgange på en høj opløsning. Protokollen indeholder oplysninger om billedbehandling planterødder og hypocotyls både i steady state og over tid-kurser. NlsGPS1 sensor kunne potentielt blive udnyttet i forskellige vævstyper, samt på tværs af plantearter, at kortlægge og kvantificere GA distributioner.

Protocol

1. præparater

  1. Forberede ½ Murashige og Skoog agar pH 5.7 med ingen saccharose (1 L).
    1. 2,2 g Murashige og Skoog (MS) basal medium i 950 mL i ultrarent vand opløses. Justere pH til 5.7 med 5 M KOH.
    2. Udgør løsningen til en endelige volumen på 1 L med ultrarent vand. Opdele den i to 500 mL flasker, hver indeholdende 1% vegetabilsk agar. Autoklavering ved 121 ° C i 20 min.
  2. Forberede ¼ MS flydende pH 5.7 med ingen saccharose (1 L).
    1. 1,1 g MS i 950 mL i ultrarent vand opløses. Justere pH til 5.7 med 5 M KOH. Udgør løsningen til en endelige volumen på 1 L med ultrarent vand. Opdele den i to 500 mL flasker. Autoklavering ved 121 ° C i 20 min.
  3. Forberede GA4.
    1. Opløse GA4 i ethanol 70% at gøre en endelig koncentration på 100 mM GA4 bestand.
    2. For at forberede brugsopløsning, fortyndes GA4 bestand til 0,1-1 µM i ¼ MS flydende pH 5.7.

2. planternes vækst

  1. Sterilisere Arabidopsis frø.
    1. Arbejde ved hjælp af en kemisk hætte. Alikvot frø (ca. 200 frø) til 2 mL microcentrifuge rør. Brug en markør med klor-resistent blæk og placere rør med åbent låg inde sterilisation fartøj (en stor kasse, der kan forseglet).
    2. Placere et 250 mL bægerglas indeholdende 50 mL i ultrarent vand og 50 mL af natriumhypochlorit løsning indenfor sterilisation fartøj.
    3. Tilføj 3 mL koncentreret saltsyre (HCl) til bægerglasset. Straks forsegle fartøjet og tillade Sterilisation af chlorgas for 6 – 16 h.
    4. Efter unsealing fartøjet, tæt låg af alle microcentrifuge rør i racket og frø. Steriliseret frø kan opbevares tørt indtil tidspunktet for plating.
  2. Så ca 20 steriliseret Arabidopsis frøene på ½ MS agar kvadratiske plader. Forsegle plader med porøst kirurgisk tape og pak dem med aluminiumsfolie. Inkuber dem ved 4 ° C i 1-3 dage for stratificering.
  3. For root imaging, overføre pladerne til vækst kammer i en lodret position i 3 dage med følgende vækstbetingelser: long-dag betingelser (LD, 16 h af lys/8 h af mørke); 120 µmol⋅m-2s-1 lysintensiteten; temperatur på 22 ° C (under lys cyklus) eller 18 ° C (under den mørke cyklus), 65% relativ luftfugtighed (RH).
  4. For mørke-vokset hypocotyl: overføre pladerne til vækst salen for en lys puls af 1 – 4 h at synkronisere spiring. Wrap plader med aluminiumsfolie og placere dem i vækst kammer i en lodret position i 3 dage.

3. Prøvetilberedning

  1. Steady-state målinger (figur 1A)
    1. På et rent objektglas, tilsæt 50 µL af ¼ MS væske (fra nu af betegnes som mock løsning). Forsigtigt overføre frøplanter at udtrykke nlsGPS1 fra pladen til diaset.
    2. Tage en ren coverslip og spot en dråbe af vakuum fedt på hvert hjørne af coverslip. Anbring forsigtigt coverslip over stiklinger og forsigtigt tilføje ekstra mock løsning for at fjerne eventuelle luftbobler.
  2. GA4 behandling: kemisk exchange eksperiment (figur 1B).
    1. Før GA4 behandling, bruge en 20 mL sprøjte fyldt med vakuum fedt (knyttet til en pipette tip) for at tegne et rektangel (længde: 3,5 cm, højde: 2,5 cm) med et ensartet lag af vakuum fedt på et rent glas dias (figur 1B). For at give mulighed for en fin linje af vakuum fedt, skal afpipetteres tip skæres for at have en åbning af 1 mm i diameter.
    2. Tilføje 50 µL af mock løsning til glas dias. Med ren pincet, vælge nlsGPS1 planter og anbring dem forsigtigt på den forlorne løsning. For at forebygge skader, overføre udplantningsplanterne ved at støtte undersiden på kimbladene uden fatte sætteplante med pincet.
    3. Tage en ren coverslip og spot en dråbe af vakuum fedt på hvert hjørne af coverslip. Brug af pincet, placere coverslip i midten af vakuum fedt rektangel. Nu er coverslip forseglet på de to sider svarer til de lange kanter af vakuum fedt rektangel.
    4. Forsigtigt tilføje ekstra mock løsning for at fylde beholderen og fjerner eventuelle luftbobler i reservoir uden at forstyrre seedling(s) inde.
    5. Erhverve billeder før GA4 behandling ved hjælp af en Konfokal mikroskop. Følg instruktionerne, som beskrevet i punkt 4 i denne protokol.
    6. GA4 behandling, skal du fjerne objektglas fra Konfokal scenen. Angiv en timer for 20 min.
    7. Efter igangsætning tidtager, udveksle stødpudeopløsning med ¼ MS væske indeholdende 1 µM GA4. Tilføje GA4 løsning (ca 50 µL) fra venstre side af coverslip og fjerne den foregående (mock) løsning fra højre side. Holde på udveksling løsning at erstatte mock løsningen helt, som tager ca. 10 min. (figur 1B).
    8. Placer glas dias tilbage på stadiet mikroskop. Vent en anden 10 min før erhvervelse efter GA billede.
  3. Oprettet af et tidsforløb for væv af interesse
    Bemærk: Væv af interesse kan for eksempel være hypocotyls eller rødder. Vi udføre rutinemæssigt tidsforløbet for imaging nlsGPS1 biosensor ved hjælp af en kommerciel perfusion system (figur 1 c, se Tabel af materialer) eller en RootChip7,10,11.
    1. Tilføje 200 µL af mock løsning til midten af perfusion kanal af sticky-diaset (Se Tabel af materialer). Forsigtigt pick nlsGPS1 stiklinger og placere dem på den forlorne løsning i den klistrede-dias.
    2. Bruge pincet, blidt sted glas coverslip og ved hjælp af bagsiden af pincet, tryk forsigtigt på de ydre kanter af coverslip, således at det danner et stærkt bånd med den klistrede materiale i periferien af den klæbrige-dias.
    3. Ved hjælp af to albue Luer Tilslut stik (med en indre diameter [ID] 0,8 mm) og silikone slange (med en ID af 0,8 mm), sticky-diaset til en 20 mL sprøjte og en outlet container indsamling udstrømning løsning. Brug Luer lock stik (med en ID af 0,8 mm) til at tilslutte sprøjten til silikoneslanger.
    4. Tryk forsigtigt på sprøjten indeholdende den forlorne løsning manuelt for at lade nok løsning passere gennem salen, således at der er nogen tilbage i salen luftbobler. Placer og hold sprøjten på den programmerbare sprøjte pumpe.
    5. Angiv parametrene pumpe, der er specifikke for sprøjten bruges (dvs.., diameter og volumen) sammen med strømningshastigheden ifølge manualen forsynet med pumpen.
      Bemærk: En gennemstrømningshastighed på 1-3 mL/h blev brugt i denne protokol, og dette kan ændres efter de eksperimentelle krav. Iværksætte kurset tid ved at starte pumpen.
    6. GA4 behandling under et tidsforløb (figur 1 c), stoppe perfusion af afbryde pumpen og ændre i sprøjten med en ny én indeholdende ¼ MS væske suppleret med GA4. Fortsæt med Konfokal imaging som vist i næste afsnit.

4. mikroskopi

Bemærk: Vi udføre Konfokal laser mikroskopi.

  1. Erhverve billeder ved hjælp af en Konfokal mikroskop udstyret med lasere for at udføre FRET billeddannelse.
    Bemærk: For nlsGPS1, er varianter af cyan fluorescerende proteiner (FFP) og gul fluorescerende proteiner (YFP) afbildet. I denne protokol bruges kommercielle mikroskoper (Se Tabel af materialer, der er opført som mikroskop 1 og 2) med 10 x eller 20 x tør 0,70 harmonisk sammensatte PLANLÆGGER APO mål.
  2. For mikroskopet 1, brug 448 nm og 514 nm bølgelængde lasere til at ophidse den fælles fiskeripolitik og YFP, henholdsvis. Erhverve sekventielle scanninger. Sæt detektorer (fx HyD SMD) til at registrere 460 – 500 nm for den fælles fiskeripolitik (donor emission) og 525-560 nm for YFP (FRET emission) efter excitation af den fælles fiskeripolitik. Ved hjælp af en anden rækkefølge, sætte en detector til at opdage 525-560 nm for YFP (YFP emission) efter excitation af YFP.
    Bemærk: Denne YFP fluorescens anvendes som et udtryk, samt i segmentering kerner, for at generere overflader ved hjælp af en kommerciel 3D-Mikrograf visualisering og analyse software.
  3. For mikroskopet 2, brug 440 nm og 514 nm bølgelængde laser linjer til at ophidse den fælles fiskeripolitik og YFP, henholdsvis. Erhverve to spor. Til spor 1, indstille detektorer (e.g., ChS) til at registrere 464-500 nm for den fælles fiskeripolitik (donor emission) og 526-562 nm for YFP (FRET emission) efter excitation af den fælles fiskeripolitik. For Track2, indstille en detector til at opdage 526-562 nm for YFP (YFP emission) efter excitation af YFP.
    Bemærk: Denne YFP fluorescens anvendes som et udtryk, samt i segmentering kerner, for at generere overflader i 3D-visualisering og analyse software.
  4. Erhverve billeder ved hjælp af et format af 512 x 512 pixel og en opløsning på 12 bits.
  5. Gevinsten skal justeres til en empirisk bestemt værdi, der giver mulighed for et godt signal samtidig ikke mætte pixels. Gevinsten skal ikke ændres mellem den fælles fiskeripolitik og FRET emission over eksperimentet. Indstil pinhole til 1 luftige enhed (AU). Placer IBIDI sticky-slide på stadiet af en Konfokal mikroskop, og Fortsæt med imaging som tidligere vist.
  6. I mikroskopet 1-software, mens i en aktiv live scan, udnytte glød over/under placeret øverst til venstre side af billedet i skærmstørrelse Bestem undereksponering og mætning af det pågældende område. I mikroskopet 2 software, udnytte Rækkevidde indikator beliggende på den nederste side af skærmbilledet billedet for at bestemme undereksponering og mætning af det pågældende område. For enhver kvantitativ billedanalyse, bør der ingen pixel mætning.
  7. Indstille z-stakke med et skridt nummer 1 μm. Trin størrelse kan reduceres til en øget z-beslutning eller øget for en øget hastighed af erhvervelse eller til at øge antallet af positioner/prøver, der kan være afbildet. For den automatiserede tidsforløb, indstille tiden sammen med z-stakke (xyzt tilstand fra fanen erhvervelse mode) for at erhverve billederne med faste tidsintervaller.

5. billede analyse ved hjælp af Fiji

Bemærk: Med ImageJ (Fiji) er det muligt at behandle billeddiagnostiske data og fremstille todimensionale (2D) billeder af nlsGPS1 emission forholdet i Arabidopsis frøplanter. Eksempler på billeder, se figur 2A, 2 C, 2E, 2 Gog 3A. ImageJ er det muligt at finde hver kommando af denne protokol, ved hjælp af søgefunktionen. Trykke på mellemrumstasten og L på computerens tastatur. Et nyt vindue åbnes; Skriv den ønskede kommando i søgefeltet.

  1. Træk fil (enten .lif eller .lsm filer) til Fiji (billedet J) og åbne billeder som hyper-stack.
  2. I hovedmenuen skal du vælge billede > stak > Z projekt og vælg Sum skiver til at indfange alle pixel i stedet for kun de dygtigste pixel som Max projektion.
  3. I hovedmenuen skal du vælge proces > Subtraher baggrund og sæt den rullende kugle radius til 50 pixel. Fravælge nogen andre muligheder og behandle alle tre billeder. Dette trin fjerner baggrunden ved hjælp af den "rullende bold" algoritme.
    Bemærk: 50 pixels var empirisk besluttet på at medtage kerner som forgrund.
  4. I hovedmenuen skal du vælge billede > farve > Split kanaler. Tre nye vinduer åbnes: C1-SUM (fælles fiskeripolitik kanal); C2-SUM (FRET kanal), og C3-SUM (YFP kanal).
  5. Vælg vinduet C3-SUM og fra hovedmenuen, Vælg proces > filtre > Gaussian Blur og anvende en Gaussian Blur på 1 for at nedsætte støje.
  6. I hovedmenuen skal du vælge billede > Juster > Lysstyrke/kontrast og vælg auto.
  7. I hovedmenuen skal du vælge proces > Øge kontrasten, og sæt mættede = 0,35.
  8. I hovedmenuen skal du vælge billede > Type > 8-bit og konvertere stakkene i et 8-bit billede.
  9. I hovedmenuen skal du vælge billede > Juster > Auto-Local tærskel. I Auto-Local tærskel, Vælg følgende parametre: Phansalkar metode, radius = 15, parameter 1 = 0, parameter 2 = 0og hvide stak. I dette trin bruges YFP stakke til at lave en binær maske.
  10. Vælg vinduet C2-SUM og fra hovedmenuen, Vælg proces > filtre > Gaussian Blur og anvende en Gaussisk sløring af 1.
  11. Vælg vinduet C1-SUM og fra hovedmenuen, Vælg proces > filtre > Gaussian Blur og anvende en Gaussisk sløring af 1.
  12. Vælg proces for at oprette emission forholdet stak fra de to kanaler i hovedmenuen > Billede regnemaskine. I det nye vindue, der vises, Vælg C2-summen som billede 1, Vælg opdele som operatør, og vælg C1 summen som billede 2.
  13. Sørg for at vælge Opret et nyt vindue og 32-bit-format. Et nyt vindue vises navngivne Resultatet af C2-summen.
  14. I hovedmenuen skal du vælge billede > opslagstabel > LUT 16_colors.
  15. I hovedmenuen skal du vælge proces > Billede regnemaskine. I det nye vindue, der vises, skal du vælge Resultat af C2-summen som billede 1, Vælg formere sig som operatør, og vælg C3-summen som billede 2. I dette trin ganges YFP binære maske med YFP/fælles fiskeripolitik stakken til at vise kun pixels i YFP kontrol kanal.
  16. I hovedmenuen skal du vælge proces > matematik > opdele og sæt værdien til 255. I det nye vindue, der åbnes, skal du vælge Ja til at analysere alle billederne i stakken. Et nyt billede vises navngivne Resultatet af resultatet af C2-summen.
  17. I hovedmenuen skal du vælge billede > Juster > Lysstyrke/kontrast og vælg Auto.
  18. I hovedmenuen skal du vælge proces > Øge kontrasten, og vælg Type mættet = 0,35.
  19. I hovedmenuen skal du vælge billede > Juster > Lysstyrke/kontrast, og minimum og maksimum værdier at fange GA distribution. Valgfrit trin: fra hovedmenuen, Vælg analyser > værktøjer > Kalibrering Bar og Vis LUT-kalibrering bar, og gemme Resultatet af resultatet af C2-SUM som en .tiff.
  20. For at få de værdier af emissionen nøgletal, hovedmenuen, Vælg analyser > sat måling og vælg mener grå værdi og standardafvigelsen.
  21. Vælg rektangel form fra værktøjslinjen og tegne en region af interesse (ROI). Fra hovedmenuen, Vælg analyser > foranstaltning. Et nyt vindue vil rapportere gennemsnitsværdien fra den valgte ROI.
  22. Kopiere og indsætte de opnåede værdier i regnearket software (fx Excel eller OriginPro) og gøre enten et histogram for et før og efter GA4 behandling eksperimentere eller en linjegraf for et tidsforløb eksperimentere.

6. billede analyse ved hjælp af 3D-visualisering og analyse Software

Bemærk: Fordelen ved at bruge den valgte software (Se Tabel af materialer) er at segmentere objekter (f.eks. kerner) og oprette 3D-billeder fra en Konfokal z-stak. Eksempler på billeder, se figur 2B, 2D, 2F, 2 Hog 3B.

  1. Åbn softwaren og importere fil (enten .lif eller .lsm filer).
  2. Segment kerner baseret på kontrollen YFP emission kanal ved hjælp af overflader guiden. De segmenterede objekter kaldes "overflader". Denne segmentering trin tillader analyse af alle voxels i en kerne som ét objekt samtidig fjerne baggrunden fra voxels uden for kernen.
  3. I overflader guiden, skal du indstille baggrunden subtraktion (lokale kontrast) 3 µm og tærskel til standard. Maske den fælles fiskeripolitik emission (donor excitation donor emission [DxDm]) og FRET emission (donor excitation acceptor emission [DxAm]) kanaler baseret på de overflader, der er oprettet ved hjælp af YFP emission (acceptor excitation acceptor emission [AxAm]) kanal.
  4. Brug forlængelse XT betyde intensitet forholdet for at beregne forholdet mellem donor excitation acceptor emission divideret med donor excitation donor emission (DxAm/DxDm) mellem de gennemsnitlige intensitetsværdier af de enkelte flader i de to kanaler.
    Bemærk: Denne udvidelse er tilgængelig online for download.
  5. For at farve de enkelte flader med nlsGPS1 emission ratio, Vælg farve kodning med statistikker, der er repræsenteret som et farveikon til hjulet. Vælg betyde intensitet ratio som statistik type.
  6. Eksportere nøgletal af individuelle værdier fra den tabel, som findes under ikonet statistik .
  7. Kopiere og indsætte værdierne i et regneark og gøre enten et histogram for før og efter GA4 behandling eksperimenter eller en lineær graf for gang kursus eksperimenter.

7. statistisk analyse

Bemærk: Se finde 3D til en beeswarm og box plot af nlsGPS1 emission nøgletal.

  1. Åbn softwaren og indsætte emission forholdet mellem kerner overflader som Y kolonner.
  2. Vælg kolonnerne af interesse og statistik > Statistik beskrivelse > normalitet test at vide om prøverne er normalt fordelt. Køre normalitet test og et nyt vindue vil åbne og rapportere resultaterne.
  3. Hvis prøverne er normalt fordelt, bruge t-test som statistiske test. Vælg statistik > hypotesetest > t-test med dobbelt stikprøve på rækker og køre t-test.
  4. Hvis prøverne ikke er normalt fordelt, Vælg statistik > statistik hypotesetest > to stikprøver tester for variansen at vide om afvigelsen mellem prøverne, der ikke er signifikant forskellig.
  5. Hvis afvigelsen ikke er væsentligt forskellige, skal du bruge den Mann-Whitney U test som statistiske test. Vælg statistik > Ikke-parametrisk Test > Mann-Whitney test og Kør testen.
  6. Hvis afvigelsen er væsentligt forskellige, skal du bruge Kruskal Wallis ANOVA test som statistiske test. Vælg statistik > Ikke-parametrisk Test > Kruskal Wallis ANOVA test og Kør testen.

Representative Results

Med nlsGPS1, er det muligt at måle cellulære GA4 niveauer i væv imødekommenhed over for fluorescens imaging, herunder roden tips og mørke-vokset hypocotyls (figur 2). I Arabidopsis rod er nlsGPS1 emission forholdet gradient betegnende for lav GA niveauer i zonerne meristematic og division og høje GA i de sene brudforlængelse zone (figur 2A og 2B). Derimod blev en emission forholdet gradient ikke observeret i nlsGPS1-NN rødder, hvilket tyder på, at den endogene GA graduering ikke er en artefakt (figur 2 c og 2D). En nlsGPS1 emission forholdet gradient blev også dannet i mørke-vokset hypocotyls, med lave niveauer i kimbladene og apikale krog og høje niveauer i hypocotyl (figur 2E og 2F) hurtigt elongating basal regionen. Derimod blev en emission forholdet gradient ikke observeret i nlsGPS1-NR hypocotyls (figur 2 g og 2 H). I både Arabidopsis rødder og mørke-vokset hypocotyl celler, endogene GA ophobning korreleret med cellulære brudforlængelse sats.

Derudover ophobes eksogent medfølgende GA4 fortrinsvis i zonen brudforlængelse sammenlignet med division zonen af Arabidopsis rod (figur 3), der angiver, at nlsGPS1 kan bruges til at studere endogene og eksogene GA mønstre.

Under gang kursus eksperimenter, nlsGPS1 frøbedsplanter var placeret i klæbrig-slide kamre og perfunderet med ¼ MS væske, efterfulgt af en behandling med 0,1 µM GA4 i 30 min. Videoen viser en hurtigere ophobning af eksogene GA4 i rodzonen brudforlængelse sammenlignet med division zonen (Video 1).

Figure 1
Figur 1: prøve forberedelse til Konfokal imaging. Disse paneler viser en skematisk gengivelse af prøveforberedelse for (A) en steady-state eksperiment, (B) før og efter eksogene GA4 behandlinger, og (C) en behandling tid kursus eksperiment ved hjælp af Sticky-dias (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: GA farveforløbet i Arabidopsis rødder og mørke-vokset hypocotyls. To-dimensionelle billeder af (A) nlsGPS1 og (C) nlsGPS1-NN rødder blev analyseret ved hjælp af ImageJ software, og tre-dimensionelle billeder af (B) nlsGPS1 og (D) nlsGPS1-NN blev analyseret ved hjælp af en kommerciel tredimensionale billede analyse software. Begge analyser viste en endogen GA4 gradient i Arabidopsis rødder. To-dimensionelle billeder af (E) nlsGPS1 og (G) nlsGPS1-NN mørke-vokset hypocotyl blev analyseret ved hjælp af ImageJ software, og tre-dimensionelle billeder af (F) nlsGPS1 og (H) nlsGPS1-NN blev analyseret ved hjælp af den kommercielle tre-dimensionelle billede analyse software. Begge analyser viste en endogen GA4 gradient i mørke-vokset hypocotyls. LUT bar viser falsk farvning af nlsGPS1 emission nøgletal. YFP billeder er rapporteret som udtryk kontrolelementer. Hypocotyl billeder er anskaffet ved hjælp af to fase positioner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: de eksogene GA gradient i rødder. De første to paneler viser (A) to-dimensionelle og (B) tre-dimensionelle billeder af en nlsGPS1 rod før og 20 min efter behandlingen af eksogene GA4 (1 µM). YFP billeder er rapporteret som udtryk kontrolelementer. Sidste to paneler show (C) middelværdien og standardafvigelse og (D) beeswarm og box plot af nlsGPS1 emission nøgletal for kerner af zonen brudforlængelse (den region, som er defineret med en hvid ramme). I zonen brudforlængelse nlsGPS1 emission forholdet var signifikant højere efter GA4 behandling (Mann-Whitney U test, *** P-værdi < 0,0001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Video 1
Video 1: Perfusion forsøget med nlsGPS1 root bruger sticky-slide. Denne video viser tredimensionale billeder af nlsGPS1 perfunderet med ¼ MS væske og behandlet med 0,1 µM GA4 i 30 min. I kurset tid imaging blev erhvervet hver 10 min for 3 h med følgende intervaller: 30 min af mock løsning (ramme t = 1, t = 2, t = 3), 30 min GA4 behandling (ramme t = 4, t = 5, t = 6), 2 h mock så lution (ramme t = 7 til t = 18) løsning. Forud for erhvervelsen, var prøven perfunderet med mock løsning for 2 h. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Discussion

FRET-baserede GA biosensor nlsGPS1 giver en kvantitativ metode for at rapportere og måle GA hormon gradienter i flercellede planter. FRET-baserede biosensorer kan kvantificere dynamics med en forbedret spatiotemporelle opløsning over direkte påvisning af massespektrometri og indirekte måling af transcriptional journalister eller signalerer-protein-nedbrydning-baserede metoder12, 13. Høj opløsning cellulære imaging i forskellige vævstyper kan give meningsfuld indsigt i GA biologi og gnist nye hypoteser om regulering og funktion af GA ophobninger i en flercellet kontekst. F.eks. overvågning af ændringer i nlsGPS1 biosensor i specifikke GA biosyntetiske, catabolic og transport mutanter samt i spatiotemporally induceret perturbationer, kunne være meget informative at teste specifikt hvordan GA gradienter er etableret i rod og adresse root celle svar til GA forløb. Sensoren kunne anvendes i andre model og afgrøde arter for at teste bevarelse af de mekanismer, der styrer kontrolelementet GA-medieret af frø spiring, cellulære strækforlængelse og blomstrende.

De kritiske trin i de FRET-baseret afbildning af nlsGPS1 biosensor er, at 1) pixels ikke bør være mættet under de kvantitative FRET analyse, 2) imaging parametre såsom "detektor gevinst" skal holdes konstant til donor-emission (DxDm) og acceptor emission (DxAm) erhvervelser, 3) kontrol nlsGPS1-NN linjer bør anvendes til at udelukke artefakter, og 4) prøver skal være parat til at minimere drift og focal-change spørgsmål. Derudover er de miljøforhold, som prøver dyrkes vigtigt at styre da GA niveauer er følsomme miljøforhold som lys varighed og lysintensitet14,15,16 ,17. En afgørende begrænsning af denne type analyse er, at en høj signal-støj-forholdet er nødvendig for billedbehandling på grund af stigningen i støjen iboende i ratiometric imaging. Således nlsGPS1 imaging vil ikke være nyttigt for væv og organer, der ikke er indstillet til ratiometric Fluorescens mikroskopi ved hjælp af cyan og gul fluorescerende proteiner – for eksempel dybere væv hvor fluorescerende proteiner registreres dårligt. På den anden side foretrækkes ratiometric udlæsninger ofte over intensiometric udlæsninger, fordi en intern kontrol er nyttigt at udelukke artefakter som følge af ændringer i biosensor udtryk, stabilitet, lysstyrke eller sporbarhed i en given celle, væv , eller tilstand. For eksempel ÆRGRE biosensor billedbehandling og image analyser er også blevet brugt til at studere en bred vifte af ligander i en række væv5,6,18,19,20,. Imaging eksperimenter og billede analyser rapporteret her kan ændres så de passer til ny Billeddannende metoder, såsom lys ark mikroskopi, der kunne give ny indsigt i, for eksempel, dybere rod-vævstyper.

De første generation nlsGPS1 biosensor er en høj-affinitet sensor, der giver en høj opløsning kort over GA forløb, der kan også rapportere om intracellulære stigninger i GA efter eksogene GA behandlinger. En af de nuværende begrænsninger af nlsGPS1 er, at sensoren er ikke hurtigt reversible og således rapporter på steady-state GA niveauer men sandsynligt, på den maksimale seneste GA koncentration i opløsningen af interesse. Den præcise omsætning sats for sensoren er også ikke kendte, og dette, kombineret med lav reversibilitet, er til hinder for påvisning af endogene GA udtynding, der kunne ske inden for få minutter til få timer i nogle vævstyper. Det er også vigtigt at bemærke, at nlsGPS1 har en høj affinitet for GA4 (Kd = 24 nM) sammenlignet med andre GA former (GA3 Kd= 240 nM, GA1Kd = 110 nM) når imaging andre bioaktive GAs 7. fremtidige generationer af GA biosensorer kan blive manipuleret til at øge reversibilitet samtidig opretholde høj affinitet eller at udstille forskellige særlige kendetegn for de forskellige forløber, bioaktive, eller catabolite GAs. 

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde har modtaget støtte fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EUs Horisont 2020 forskning og innovation program (grant aftale n ° 759282).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
nlsGPS1 Col0 Arabidopsis seeds NASC N2107734
nlsGPS-NR Col0 Arabidopsis seeds NASC N2107735
Gibberellin A4 (GA4) Sigma G7276 dissolve in EtH 70% , and keep at -20 °C
sodium hypochlorite solution (Bleach) Fisher S/5040 HSRA 064
Hydrogen cloride HCl Sigma 31434
Micropore tape 3M 1530-1
ibidi sticky-slide Ibidi 81128 Luer 0.1 for root imaging
ibidi sticky-slide Ibidi 80168 Luer 0.2 for hypocotyl imaging
glass coverslip for sticky slides Ibidi 10812
Elbow Luer Connectors Ibidi 10802
silicone tubing Ibidi 108401
Luer Lock Connector Ibidi 10826
programmable syringe pump World Precision Instruments AL-1000
Vacuum grease Sigma 18405
Murashige and Skoog Basal Salts Duchefa M0221
Agar plant, 1 kg Melford P1001
Microscope slide ground edges, 76 mm x 26 mm, 1.0 mm to 1.2 mm thick Fisher Scientific 12383118
Cover slip No.1 1/2 glass 22 mm x 22 mm Fisher Scientific 12363138
Luer-slip Syringe 20 mL Fisher Scientific 10785126
3M Micropor Surgical Paper Tape Fisher Scientific 12787597
Potassium Hydroxide, 500 g Sigma Aldrich 221473-500G-D
Absolute Ethanol Fisher Scientific 10428671
Forceps Watchmaker 5 StSteel Scientific Laboratory Supplies INS4340
Scissors, 125 mm, stainless steel Fisher Scientific 12338099
Fitting reducer 0.5 to 1.6 Ibidi 10829
Leica SP8 Confocal laser microscope 1
Zeiss LSM 780 Confocal laser microscope 2
Imaris Bitplane 3D visualization and Analysis software
Fiji image analysis software
OriginPro Origin Lab Statistical Analysis Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Binenbaum, J., Weinstain, R., Shani, E. Gibberellin Localization and Transport in Plants. Trends in Plant Science. 23 (5), 410-421 (2018).
  2. Sun, T. Gibberellin Metabolism, Perception and Signaling Pathways in Arabidopsis. The Arabidopsis Book. 6, 0103 (2008).
  3. Rieu, I., et al. Genetic Analysis Reveals That C19-GA 2-Oxidation Is a Major Gibberellin Inactivation Pathway in Arabidopsis. The Plant Cell Online. 20 (9), 2420-2436 (2008).
  4. Regnault, T., et al. The gibberellin precursor GA12 acts as a long-distance growth signal in Arabidopsis. Nature Plants. 1, 15073 (2015).
  5. Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors. Annual Review of Plant Biology. 63 (1), 663-706 (2012).
  6. Walia, A., Waadt, R., Jones, A. M. Genetically Encoded Biosensors in Plants: Pathways to Discovery. Annual Review of Plant Biology. 69 (1), 497-524 (2018).
  7. Rizza, A., Walia, A., Lanquar, V., Frommer, W. B., Jones, A. M. In vivo gibberellin gradients visualized in rapidly elongating tissues. Nature Plants. 3 (10), 803-813 (2017).
  8. Rizzo, M. A., Springer, G., Segawa, K., Zipfel, W. R., Piston, D. W. Optimization of pairings and detection conditions for measurement of FRET between cyan and yellow fluorescent proteins. Microscopy and Microanalysis. 12 (3), 238-254 (2006).
  9. Ueguchi-Tanaka, M., et al. GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1 encodes a soluble receptor for gibberellin. Nature. 437, 693-698 (2005).
  10. Grossmann, G., et al. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip. Journal of Visualized Experiments. (65), 34290 (2012).
  11. Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
  12. Brunoud, G., et al. A novel sensor to map auxin response and distribution at high spatio-temporal resolution. Nature. 482, 103-106 (2012).
  13. Wang, N. N., Shin, M. C., Li, N. The GUS reporter-aided analysis of the promoter activities of Arabidopsis ACC synthase genes AtACS4, AtACS5, and AtACS7 induced by hormones and stresses. Journal of Experimental Botany. 56 (413), 909-920 (2005).
  14. Alabadi, D. Gibberellins Repress Photomorphogenesis in Darkness. Plant Physiology. 134 (3), 1050-1057 (2004).
  15. De Lucas, M., et al. A molecular framework for light and gibberellin control of cell elongation. Nature. 451 (7177), 480-484 (2008).
  16. Strasser, B., Sanchez-Lamas, M., Yanovsky, M. J., Casal, J. J., Cerdan, P. D. Arabidopsis thaliana life without phytochromes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (10), 4776-4781 (2010).
  17. Feng, S., et al. Coordinated regulation of Arabidopsis thaliana development by light and gibberellins. Nature. 451, 475-479 (2008).
  18. Choi, W. G., Swanson, S. J., Gilroy, S. High-resolution imaging of Ca2+, redox status, ROS and pH using GFP biosensors. Plant Journal. 70 (1), 118-128 (2012).
  19. Lanquar, V., et al. Dynamic imaging of cytosolic zinc in Arabidopsis roots combining FRET sensors and RootChip technology. New Phytologist. 202 (1), 198-208 (2014).
  20. Krebs, M., Schumacher, K. Live cell imaging of cytoplasmic and nuclear Ca2+ dynamics in Arabidopsis roots. Cold Spring Harbor. 2013 (8), 776-780 (2013).

Tags

Udviklingsmæssige biologi spørgsmålet 143 planter biokemi Life sciences Life Sciences (generelt) gibberellin Phytohormone Spatiotemporal udvikling af anlægget celle vækst Biosensor FRET
Visualisering cellulære Gibberellin niveauer ved hjælp af NlsGPS1 Förster resonans energi overføre (FRET) Biosensor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rizza, A., Walia, A., Tang, B.,… More

Rizza, A., Walia, A., Tang, B., Jones, A. M. Visualizing Cellular Gibberellin Levels Using the nlsGPS1 Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor. J. Vis. Exp. (143), e58739, doi:10.3791/58739 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter