Artigo de método

Uma abordagem imparcial de amostragem TEM seções em neurociência

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DOI:

10.3791/58745

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13 de abril de 2019

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1Department of Cell Biology, Histology and Embryology, Gottfried Schatz Research Center, Medical University of Graz, 2Department of Pharmacology, Otto Loewi Research Center, Medical University of Graz, 3Division of General Neurology, Department of Neurology, Medical University of Graz, 4Institute of Pathology, Medical University of Graz, 5Department of Pathology, Medical Faculty, Otto von Guericke University Magdeburg

Neste artigo

Resumo

Nós introduzimos um romance de fluxo de trabalho para investigações de microscopia eletrônica do tecido cerebral. O método permite ao usuário examinar características neuronais de forma imparcial. Para a análise elementar, apresentamos também um script que automatiza a maior parte do fluxo de trabalho por amostragem aleatória.

Resumo

Investigações sobre as características ultra-estruturais de neurônios e suas sinapses só são possíveis com microscopia eletrônica. Especialmente para estudos comparativos das mudanças na densidade e distribuições de tais características, um protocolo de amostragem imparcial é vital para resultados confiáveis. Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho para a aquisição de imagens de amostras de cérebro. O fluxo de trabalho permite a amostragem aleatória uniforme sistemática dentro de uma região do cérebro definidos, e as imagens podem ser analisadas usando um disector. Esta técnica é muito mais rápida do que o exame aprofundado das seções seriais mas ainda apresenta uma abordagem viável para estimar as densidades e distribuições de características de ultra-estrutura. Antes da incorporação, seções manchadas vibratome foram usadas como referência para identificar a região do cérebro sob investigação, processo que ajudou acelerar a preparação da amostra global. Esta abordagem foi utilizada para estudos comparativos, investigando o efeito de um ambiente enriquecido-habitação em vários parâmetros ultra-estruturais no cérebro do rato. Baseado no uso bem sucedido de fluxo de trabalho, adaptamos para efeitos de análise elementar de amostras de cérebro. Nós aperfeiçoamos o protocolo em termos do tempo de interação com o usuário. Automatizar todas as etapas demoradas através da compilação de um script para o software de código aberto SerialEM ajuda o utilizador a focar o trabalho principal de adquirir os mapas elementares. Como o fluxo de trabalho original, nós pagamos a atenção à abordagem imparcial de amostragem para garantir resultados confiáveis.

Introdução

Em microscopia eletrônica, muitas vezes é desafiador, para amostra representativas regiões em seções. Nós, como um observador, são muitas vezes tendenciosa para olhar para regiões específicas, atraídas a nossa atenção à conspícuas características da amostra, impedindo uma amostragem bem distribuída, imparcial. Viés de amostragem só pode ser evitado se cada parte da região de interesse Obtém a mesma chance de acabar em uma micrografia eletrônica1. É possível evitar o viés de amostragem sem uma solução de software, por exemplo, empurrando o trackball do microscópio manualmente sem olhar para a imagem, a fim de selecionar regiões de amostragem onde para o palco. Mas, estritamente falando, isto não é um procedimento aleatório, porque, consciente ou inconscientemente, o usuário pode ter uma influência sobre o movimento do palco, e, além disso, isto não é uma forma sofisticada de selecionar regiões de amostragem. Amostragem aleatória torna-se especialmente importante se pares de seções são usadas para avaliar o número de estruturas em um determinado volume, por exemplo, para stereology1, que exige que pares de seções, uma distância conhecida separada. Também seria possível olhar apenas para uma única seção e estimar o número de estruturas específicas2, mas com essa abordagem os investigadores tendem a superestimar a densidade numérica de estruturas maiores, a menos que as estruturas são muito pequenas em comparação com a espessura de corte. Abordagens alternativas são para reconstruir volumes de tecido do seriais seções e, assim, obter os dados desejados3. Mas isto é muito demorado e não uma abordagem viável para estudos comparativos (maiores).

Para superar esses problemas, nós desenvolvemos um fluxo de trabalho que permite que o pesquisador selecione automaticamente amostras para obtenção de micrografias de elétron no espaçamento regular dentro de seções ultra-finas. A posição de micrografias da elétron é aleatória, permitindo que a amostragem imparcial. A abordagem é adequada tanto para determinar a densidade numérica de estruturas (por exemplo, sinapses dentro de um determinado neurópilo volume4,5) e as dimensões das características estruturais (por exemplo, a largura da fenda sináptica, ou o diâmetro do densidade pós-sináptica4,,5).

O fluxo de trabalho usa um ponto aleatório feito por amostragem (RPS) software (escrito em Java script usando software de criação de scripts fornecido com nosso microscópio) que calcula automaticamente as posições de grade dentro de uma região predefinida de interesse em uma seção ultra fina. O software RPS move o palco o microscópio de elétron para estes pontos predefinidos, para que uma micrografia eletrônica pode ser feita em cada ponto. Primeiro, o usuário define uma região de interesse dentro da seção fina. Em seguida, o software RPS calcula as posições de grade dentro desta região. A x / y coordenadas da posição do primeira são criadas aleatoriamente, e as posições restantes são colocadas em intervalos de grade regular em relação à primeira posição. Porque cada parte da região de interesse tem a mesma chance de ser examinado, isto permite a coleta de dados mínima. Esta abordagem de amostragem também é chamada de amostragem aleatória uniforme sistemática (ver referências6,7 para mais detalhes).

Para a determinação da densidade numérica de estruturas, trabalhamos com pares de seções que estão separados a uma distância conhecida. Depois de obter uma micrografia eletrônica da primeira seção em uma das posições predeterminadas, software TEM seção Serial (parte do pacote de software fornecido com nosso microscópio de elétron) move-se para o ponto correspondente na segunda seção, a fim de obter uma micrografia eletrônica da localização correspondente. Isto é repetido para cada localização na grade pré-determinada. Em nossa abordagem, um disector é usado para contar o número de partículas em cada par de elétron-micrografias8,9. Um disector consiste em um par de quadros contando, uma para cada seção8,9. A densidade numérica de objetos é determinada por apenas contando objetos visíveis na primeira seção (ou seção de referência), mas não na segunda seção (ou seção de pesquisa). Isto permite estimar a densidade numérica de objetos em uma maneira rápida e eficiente de8,9. Além em seções única, bidimensionais características estruturais podem ser medidas.

Nós aplicamos este fluxo de trabalho com sucesso para avaliar as diferenças em números de sinapse no hipocampo de ratos expostos ao ambiente enriquecido (EE) em relação ao ambiente padrão (SE) habitação condições4,5, de condições de alojamento e também para avaliar as diferenças ultraestrutural entre ratos de tipo selvagem (WT) e o neuropeptídeo Y (NPY) KO ratos mantidos sob SE e EE5. Nosso objetivo foi olhar especificamente para as características estruturais dos neurônios, tais como a densidade sináptica numérica, os comprimentos da zona activa em cortes transversais e da densidade pós-sináptica, a largura da fenda sináptica e o número de vesículas sinápticas, a fim de avaliar as mudanças na conectividade neuronal e ativação entre as diferentes condições experimentais. Além disso, estávamos interessados na densidade numérica das vesículas densas-núcleo (DCV) em neurônios para determinar a quantidade de neuropeptídeos armazenados em uma determinada área do cérebro.

Baseado no sucesso da nossa abordagem para os estudos descritos acima, no nosso próximo passo, adaptámos o nosso fluxo de trabalho para selecionar áreas para análise elementar imparcial dentro de amostras de cérebro humano. Isto foi feito de ferro, imagem, que é armazenado em moléculas de ferritina em neurônios e células gliais. Por isso, compilamos um script que nos permitiu automatizar a maioria das operações para um processo de seleção aleatória de seções do cérebro em uma área definida.

Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comité de ética no Ministério Federal de ciência e pesquisa da República da Áustria (BMWF-80.104/2-BrGT/2007 e BMWF-66.010/0037-II/3b/2013), ou Comissão de ética da universidade médica de Graz, número 28-549 ex 15/16 e realizado de acordo com a Directiva do Conselho das Comunidades Europeias de 24 de novembro de 1986 (86/609/CEE) e a Directiva do Parlamento Europeu e do Conselho de 22 September2010 (2010/63/UE). As experiências com animais foram concebidas e realizadas de forma a que o número de animais utilizados foi minimizado.

1. dissecção e fixação do tecido

  1. Eutanásia em ratos (21 semanas velho, feminino de camundongos C57BL/6J e C57BL/6N ratos, camundongos machos WT e NPY KO em um misto C57BL / 6:129 / SvJ (1:1) fundo respectivamente) através da injeção de 150 mg/kg de pentobarbital intraperitonealmente.
  2. Remover o cérebro do crânio e imediatamente cortá-los ao meio (separando a esquerda do hemisfério direito) - usando um bisturi.
  3. Imediatamente, coloque as metades em recipientes de vidro com 2% de formaldeído e glutaraldeído 2,5% em 0.1 M cacodylate buffer (CH3)2AsO2Na·3H2O, pH ajustado para 7,4 com 1m de NaCl), pH 7,4 a 4 ° C.
    Atenção: Os fixadores são tóxicos e devem ser manuseados com grande cuidado. Usar somente com luvas de proteção e sob a coifa.
  4. Corrigir as metades do cérebro por 2 dias a 4 ° C e enxaguar a mesma reserva pelo menos 24 h, também a 4 ° C. O volume da reserva deve ser em aproximadamente dez vezes o volume de amostra.

2. identificar a região de interesse dentro do cérebro, comparando Vibratome seções com referência seções do Mouse cérebro Atlas10

  1. Coloque a amostra do cérebro para um vibratome. Certifique-se de que a orientação do cérebro está correta (neste caso, uma orientação coronal foi escolhida para o hipocampo).
  2. Guarnição até atingir a região de interesse (ROI) no cérebro. As seções em uma grande espessura de corte (ex., 100 µm) até a parte do cérebro com a região de interesse é alcançada e jogar fora a cada seção.
  3. Começa a cortar as seções de vibratome com 20 µm de espessura no início da parte do cérebro com o ROI e colocar as seções de vibratome sobre uma lâmina de vidro. Mancha-los (Nissl mancha), colocando as seções em acetato de Tionina 0.05% em tampão de acetato de sódio, pH 4.2 durante 1 min (Figura 1Ai).
  4. Compare as seções manchadas com o atlas do cérebro de rato usando um microscópio de luz e continuar manchando até se atingirem as coordenadas do cérebro desejado e corte.

3. a obtenção de uma amostra de região para a incorporação de

  1. Tão logo a área direita é identificada, inicie uma seção de corte em 150 µm de espessura com o vibratome.
  2. Microdissect esta seção de vibratome com uma lâmina de barbear ao microscópio estéreo. Corte as partes em torno do ROI. A seção deve ter um tamanho adequado para as próximas etapas de preparação para a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) (não maior que 1 x 1 mm2).

4. TEM preparação - incorporação, ultra-fino de corte e coloração

  1. Incorporação
    1. Pós-correção para 2h em tetróxido de ósmio de 2% na temperatura de quarto (RT). Use um volume para cobrir a amostra com pelo menos 10 vezes o volume da amostra, mas evitar o uso de fixador em excesso para evitar desnecessária de resíduos tóxicos.
      Cuidado: tetróxido de ósmio é altamente tóxico e deve ser tratado com muito cuidado. Usar somente com luvas de proteção e sob a coifa.
    2. Desidrata-se usando álcoois EM grau nas etapas de 20 min. Use um volume maior do que na etapa anterior (50%, 70%, 80%, 96% e 100% de etanol).
    3. Coloque-se em óxido de propileno para 40 min no lugar do RT. em uma mistura de propileno óxido/incorporação de resina (1:2) por 2 h no RT e pernoite de 1:3 a 4 ° C.
      Cuidado: Óxido de propileno é altamente tóxico e deve ser tratado com muito cuidado. Usar somente com luvas de proteção e sob a coifa.
    4. Incorpore as amostras em 100% resina, alterando a resina 2 vezes após 60 min e uma vez após 90 min (todos a 45 ° C).
    5. Finalmente, colocar as amostras em moldes adequados e deixe a resina polimerizar a 90 ° C por 3 dias (Figura 1tudo).
  2. Aparar e Set Sectioning em um ultramicrotome.
    1. Apare o bloco, garantindo que os lados são tão suaves quanto possível para as seções de aderir ao outro (Figura 1Aiii).
    2. Produzir 55 nm ultra-fino seriais seções (deve ser prata cinza) usando um ultramicrotome. Usar uma grade de slot (slot largura 1 x 2 mm) revestido com pioloform (Figura 1Aiv).
  3. Counterstain seções ultra-finas nas grades slot usando acetato de uranilo 2% por 30 min e citrato de chumbo por 30 s a RT (este é o método de microscopia eletrônica de varredura padrão11).
    Cuidado: Acetato de uranilo é altamente tóxico e deve ser evitado qualquer contacto directo. Lidar apenas com luvas de proteção. Nitrato de chumbo é tóxico se ingerido ou inalado e deve ser tratado com muito cuidado.

5. imagem de ROIs correspondentes na referência e seções de look-up na temperatura com pacotes de Software

  1. Examine as seções da grelha com a temperatura usando uma ampliação baixa (dependendo do tamanho das seções) para orientação e para avaliar a qualidade das seções.
  2. Inicie o software (um pacote de Software de análise de imagem TEM, ou TIA, fornecido com microscópio) para gerar imagens virtuais das seções, armazenando os pontos dos cantos das seções. Isso permite que o software encontrar as posições correspondentes do ROI em cada seção.
    1. Vá para a seção e escolher Inserir para adicionar os pontos de canto para a seção de referência e consulta. Siga as instruções da janela pop-up. Comece com a seção de referência e depois continuar com a seção de pesquisa. Verifique se as bordas da secção que são paralelas à seção seguinte como pontos 1 e 2 (Figura 1Bi) são inseridas.
    2. Visualize a seção de referência em pequeno aumento para identificar a região de interesse e mover o estágio de microscópio usando TIA na seção de referência para vários pontos de canto do ROI para criar uma estrutura de tópicos do ROI.
    3. Grave as coordenadas do polígono resultante usando software RPS . Para isso, pressione Adicionar coordenadas na caixa de diálogo do software RPS em cada ponto do polígono que é necessário delinear o ROI na seção (Figura 1Bii).
    4. Definir e digite um tamanho adequado para as áreas de amostragem e as distâncias entre as áreas no RPS software (no estudo apresentado, o tamanho das áreas de amostragem é 7 µm e a distância entre eles é de 20 µm, resultando em pelo menos 20 áreas de amostragem dentro do ROI). Pressione Calcular Raster, então o software gera coordenadas da área de amostragem de forma aleatória sistemática uniforme para as posições de micrografia dentro do polígono (Figura 1Biii).
      Nota: Para melhor orientação, polígono e as áreas de amostragem dentro do polígono podem ser exibidas pelo software do RPS (Figura 1Biv).
  3. Armazene os pontos de amostragem na seção de referência e consulta usando o software de RPS e TEM seção Serial software. Estas são as coordenadas das montagens que são depois registradas11.
    1. No software do RPS, pressione ir para a próxima posição para passar a fase de microscópio para x / y coordenadas de cada área na seção de referência de amostragem. Vá para a localização e Inserir para importar essas coordenadas no software na seção de referência. Repita isto para todas as coordenadas.
    2. Para espelhar as coordenadas da seção de referência para a seção de look-up, vá para a seção e clique em ir para seção. Digite o número da seção look-up (geralmente ' 2') na janela de diálogo.
    3. Para a gravação das montagens (ver próximo passo), alternar entre a seção de referência e consulta, como descrito antes e alterar a posição na seção com o local e vá para o númerode referência. Escolha a próxima coordenada na janela de diálogo.
    4. Para as montagens SerialEM em cada amostragem coordenar, vá ao menu arquivo e escolher a Nova montagem do menu drop-down. Selecione o número de telhas e percentagem de sobreposição na janela de diálogo. Para o presente estudo, uma ampliação de 5000 X é suficiente para reconhecer as características sinápticas sob estudo, mas limitado campo de visão da câmera CCD necessário fazer montagens de fotos 2 x 2. As montagens são feitas com o SerialEM.
    5. Antes de gravar cada montagem, reajustar o foco (ou, se possível, active a opção de foco automático do software de gravação). Escolha a pasta para salvar o arquivo de montagem e iniciar a gravação da montagem pressionando Iniciar no submenu à esquerda na SerialEM de montagem.

6. analise as imagens TEM com ImageJ para documento características ultra-estruturais.

Nota: Para isso, é importante criar uma pilha de imagem alinhadas da seção de referência e consulta.

  1. Converter os pares de imagem com ImageJ imagens de pilha em um arquivo de pilha e alinhar as imagens com StackReg (tem que ser instalado a partir de BIG-EPFL http://sites.imagej.net/BIG-EPFL/; no presente caso, o algoritmo afim foi usado). Para obter as densidades numéricas de celulares características estruturais, a macro custom-made do ImageJ Disector gera um quadro de contagem com um tamanho de 5,5 x 5,5 µm colocados aleatoriamente sobre a imagem com um ângulo aleatório.
  2. Iniciar a macro Disector (local no menu ImageJ depende o diretório onde ele é salvo) e definir os parâmetros (tamanho do quadro de contagem, número de segmentos) como necessário (Figura 1Cii).
  3. Conte o número de sinapse/µm2 usando o Disector. Conte cada sinapse dentro do quadro de contagem que é visível na seção de referência, mas não é visível na seção de pesquisa. Omitir as sinapses que se cruzam com os dois 'proibido linhas' do disector; Mas contar sinapses nas oposto 'linhas de aceitação'. Para isso, use a Ferramenta multiponto localizada no Toolsbar no ImageJ (Figura 2, Figura 2B).
  4. Para medir parâmetros de sinapse, selecione apenas as sinapses com uma fenda sináptica orientada na seção transversal (na seção referência; dentro os mesmo quadros de imagem usados para o disector).
    1. Iniciar o plugin ObjectJ no ImageJ no menu suspenso(Figura 2)através de Plugins | Analisar. Abra um novo projeto caixa de diálogo ObjectJ suspensa. Isto irá abrir uma janela que permite ao usuário para estruturas de contorno e mark com Ferramenta de marcador (Figura 2B, círculo vermelho). Os parâmetros sinápticos utilizados para os experimentos apresentados aqui são descritos nas etapas a seguir.
    2. Medir o comprimento da membrana pré-sináptica e pós-sináptica densidade desenhando uma linha ao longo da estrutura usando a Ferramenta de marcador (Figura 2B, círculo vermelho).
    3. Obter a largura média da fenda sináptica desenhando um polígono abrange tanto a membrana pré e pós-sináptica, com os lados retos paralelos e midway uma linha segmentada, equidistante de ambas as membranas.
    4. Para determinar o número de vesículas ancoradas, conte todas as vesículas que têm uma distância máxima da membrana pré-sináptica de um diâmetro de vesículas ou menos.
    5. Para determinar o número de vesículas desencaixados, conte essas vesículas com uma distância máxima de diâmetro de uma vesícula de encaixado ou outras vesículas desencaixados na mesma sinapse.

7. produzir cortes semifinos para microscopia de luz de características macroscópicas de documento (no presente caso o número de células) dentro da mesma ROI como escolhido para a investigação TEM.

  1. Imediatamente depois de cortar as seções ultra-finas para temperatura, corte duas seções semi finas, 0,5 µm de espessura e imediatamente adjacentes uns aos outros. Coloque sobre uma lâmina de vidro e manchá-las usando a solução de azul de toluidina 0,5%. Coloque uma lamínula sobre as seções (com DPX médio de montagem, que consiste de distyrene, um plastificante (fosfato tricresílico) e xileno). Essas duas seções são usadas para contar o número de células.
  2. Fotografe as seções semi finas na ampliação baixa usando um microscópio de luz.
    Nota: As estruturas sob investigação devem ser identificáveis nas imagens. No presente estudo, a ampliação de 20 X foi usado para identificar corpos celulares. Se necessário, várias imagens podem ser costuradas em conjunto com uma software de processamento de imagem.
  3. Alinhar os pares de duas seções consecutivas semi finas com uma software de processamento de imagem (ex., ImageJ).
    Nota: As diferenças de rotação e tamanho (pode ocorrer devido a artefatos de compressão introduzidos pelo processo de corte) devem ser ajustadas para uma cobertura perfeita das duas seções.
  4. Marca a fronteira do ROI na imagem de microscopia de luz. O ROI deve corresponder o ROI usado para as imagens de temperatura. Para este efeito, carregar as imagens no ImageJ e escolha a seleção do polígono a Toolsbar (Figura 2).
  5. Gerar uma grade ao longo de toda a imagem usando o ImageJ abrindo Analyze | Ferramentas | Grade e definir os parâmetros conforme necessário.
  6. Calcular a área e o volume do polígono do número de pontos de grade dentro da área de interesse e seção a espessura (Volume = NCS * umGS * hST ; NCS = contados cruzar seções; UmGS = tamanho da grade; hST = espessura de corte).
  7. Conte o número de núcleos de corpos de células dentro do ROI se eles só estão presentes em uma seção. Escolher o Toolsbar Ferramenta multiponto no ImageJ e marcar as células. Depois de contar as células em cada seção, calcular o número de células por volume (figure-protocol-1; Cdensidade = densidade celular; Ccontagem = contagem de células).
  8. Grave todas as medições na janela de Resultados de ObjectJ (Figura 2C). Exportação e salvá-los para utilização futura.

8. usando o SerialEM Script para otimizar a análise elementar em amostras de cérebro em combinação com DigitalMicrograph (DM, fornecido com filtro de imagem).

  1. Ajuste de imagem (GIF) de filtro.
    1. Carregar a amostra para a temperatura e ir para um buraco na amostra para a afinação de GIF usando o trackball ou joystick do microscópio.
    2. Alternar para Energia filtrada TEM (EFTEM) em/ou software de DM DM e selecione câmera CCD no DM.
    3. Escolher a ampliação para a análise elementar (a ampliação depende da estrutura/área de interesse, no presente caso, a ampliação é definida de 76 k até 125 k). Definir o tempo de exposição a 0,001 s e começar a exibição.
    4. Focar o feixe cuidadosamente até que as bordas podem ser vistas e centralize o feixe na imagem. Reduza a abertura C2/o objectiva até que as bordas da abertura são visíveis e centralize o feixe com o trackball para o feixe.
    5. Desfocar o feixe (em torno de C2 46,2%, tempo de exposição de ajuste deve ser em torno de 0,05 s) e encontrar o zero pico de perda (ZLP) pressionando o botão de postal . Inicie o procedimento de ajuste pressionando o botão Full tune .
  2. Obter pontos aleatórios de aquisição.
    1. Volte ao TEM modo de imagem e selecione a câmera e verificar o foco na ampliação de 10 k (ajustar o eixo z e conjunto de desfocagem para zero).
    2. Selecione o LM 75 X ampliação e verifique se a câmera não está inserida (caso contrário não pode ser controlado pelo software SerialEM).
    3. Inicie o SerialEM e abra um novo projeto.
    4. Abra o navegador. Verifique as configurações para a câmera na Camara e controles de Script (para Visualização e registro) e começar a exibição (câmera é inserida automaticamente).
    5. Para fazer um canto mapa da seção ultra-fino, escolher Adicionar pontos na janela navegador.
      1. Defina os pontos de canto nas bordas de uma seção ultra fina. Mova o palco para um ponto de canto, mantendo pressionada a tecla de rato direita. Quando é atingido um canto da seção, adicione um ponto de canto com a esquerda-clique do mouse. Repita o procedimento para adicionar mais 3 pontos de canto. Certifique-se que, na janela Navegador caixa C para pontos de canto está marcada para os pontos armazenados.
      2. Para iniciar a montagem de canto (preferível na ampliação 75 LM), ir ao navegador em SerialEM-barra de menu e escolha Montaging & grades e Montagem de canto de configuração do menu drop-down.
        Nota: O melhor encaixe configurações para os parâmetros de registro escolhidos é exibido. Altere-os se necessário. No caso presente, apenas a porcentagem de sobreposição foi alterada para 20%.
    6. O seção/ROI na imagem de montagem de estrutura de tópicos. Escolha Adicionar polígono na janela navegador e delinear a seção com múltiplas direito-cliques de mouse. Escolha Adicionar grade de pontos no menu drop-down de navigator e definir uma distância entre os pontos (a distância depende da pergunta experimental; ex., 10 µm, Figura 3).
    7. Siga os comandos de script. Digite o número de pontos da grade, como mostrado no navegador e digite o número de pontos de aquisição (EG., 20).
    8. Defina o limite de iluminação para que o script pode evitar barras da grade. Siga os comandos de script e mover o palco manualmente para cobrir o campo de visão por um quarto com um grade-bar. De acordo com o valor exibido, digite um valor de limite de iluminação (deve ser maior que o valor exibido).
    9. Espere até que seleccionam-se os pontos para a aquisição e a rotina de cozedura está acabada.
      Nota: Isto leva muito tempo e pode ser durante a noite; o script envia o microscópio em modo de espera depois de terminar a cozedura de rotina; a rotina de cozedura é importante para estabilizar as seções com o feixe de elétrons.
  3. Energia filtrada análise elementar TEM (EFTEM)
    1. Escolher o modo EFTEM em TIA/DM e selecione câmera CCD no DM.
    2. Centro do feixe e siga os comandos de script que irão mover o palco para cada coordenada de amostragem.
      Nota: O usuário será solicitado se o palco deve ser movido para a próxima coordenada.
    3. Alinhar o pico perda zero (ZLP) e conjunto C2 ~ 46,2%.
    4. Defina a energia em 60 eV (neste caso, o valor é definido para a deteção da borda Fe M), fenda no tempo 10 eV e exposição em 0.4 s. Insert a fenda e conjunto C2 ~ 43,9%.
    5. Começar a exibição e focar a imagem.
    6. Conjunto C2 para 46,2%, alinhar ZLP e conjunto C2 volta para 43,9%.
    7. Adquira mapa elementar com configurações específicas de elementais.
      Nota: As configurações padrão podem ser usadas na caixa de diálogo de aquisição, mas é aconselhável testar estas antes, se possível; exemplo de filtrado imagens são mostradas na Figura 4.
    8. Conjunto de C2 para 46,2% e adquirir o mapa de espessura.
    9. Repita para todos os pontos de determinada aquisição (passo 8.3.2-8.3.12).
    10. Siga as instruções do script e obter o única elétron micrografias ou montagens de pontos de aquisição. Escolha a ampliação para que todas as (ultra-) informações estruturais são visível/identificáveis.
    11. Salvar o arquivo LOG, navigator e janela de resultados e remover a fenda.
    12. Fechar a válvula, retire a amostra e encerre a temperatura.

Resultados

Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho para selecionar as áreas de temperatura de forma automática e imparcial. O usuário seleciona a área de interesse dentro de uma seção ultra fina sob a temperatura e usa várias soluções de software para o fluxo de trabalho, incluindo o nosso software RPS que automaticamente calcula as coordenadas de 20 áreas de amostragem dentro da área de interesse. Em seguida, o palco TEM é movido para cada área de amostragem para a fotografia. Isso é possível tanto para a análise de seções única e para a análise de pares de seções, uma distância conhecida, que permite a seleção de áreas para geração de imagens sem o viés do investigador.

Este fluxo de trabalho provou ser valioso quando documentar características ultra-estruturais em54,seções do cérebro do rato. Nesses estudos, a camada de células polimorfo de giro do pectínea (DGpl) analisou-se como uma área de interesse. Nosso método revelou adequado para examinar o DG, porque uma secção coronal da DG dorsal (Bregma −1.3) se encaixa em uma seção ultra fina e seus contornos são facilmente reconhecidos em baixa ampliação. Se outras regiões do cérebro eram para ser examinado, seria importante verificar seu tamanho e características distintivas antes de planejar os experimentos.

Aplicar o fluxo de trabalho descrito aqui mostrou que a habitação EE aumenta a largura da fenda sináptica significativamente na DGpl4, em respeito às condições de habitação padrão. Além disso, o número de vesículas de núcleo denso foi diminuiu significativamente no animais alojados em EE4, indicando as alterações do agregado familiar de neuropeptídeos. Quando ratos do KO WT e NPY eram mantidos sob condições EE, o número de neurônios/µm³ no DGpl aumentou, enquanto a densidade de DCV diminuiu em relação à habitação-SE5. Em contraste, nocaute NPY resultou em um aumento significativo das vesículas sinápticas na piscina Reserva (vesículas sinápticas desencaixadas) independente da habitação condições5. O efeito de EE na largura da fenda sináptica inverteu-se no grupo NPY KO, resultando em uma diferença significativa entre alojados em EE WT e NPY KO ratos5. Tomados em conjunto com estudos comportamentais de WT e NPY animais nocaute realizada sob ambos os tipos de condições de habitação, isso indica um papel crucial de NPY os efeitos neurobiológicos da EE5.

Para poder visualizar o ferro armazenado no cérebro humano, um script foi compilado por SerialEM software para escolher aleatoriamente os pontos de aquisição de dentro de uma seção inteira ultrafino, com o objectivo de obter uma energia filtrada micrografia eletrônica em cada um destes pontos . Após carregar a seção para o microscópio de elétron, o script realizada a estabilização da seção (i. e., a rotina de 'espécime cozinha') durante a noite. O script então selecionados aleatoriamente um número de pontos predefinidos pelo usuário daqueles marcados com uma grelha na Figura 3. Por produzir uma micrografia de teste e verificar seus níveis de cinza, o script verificado se os pontos escolhidos foram localizados em uma parte visível da seção, rejeitando os pontos que desembarcaram nas barras da grade. Maior parte do fluxo de trabalho foi tratada pelo script com interação mínima do usuário. No entanto, não foi possível gravar automaticamente micrografias de energia filtrada (com esta configuração), como não havia muito pouca luz para a rotina de focagem automática de SerialEM. Portanto, nós mudamos a DM software assim que o script do palco para cada ponto, ajustado o foco manualmente e fez uma imagem EFTEM de ferro. Um exemplo de uma imagem de ferro EFTEM do cérebro humano post mortem é mostrado na Figura 4.

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Figura 1. Ilustração de fluxo de trabalho. (A) as principais etapas da preparação da amostra são mostradas (no sentido da seta): seções de vibratome (i), embedding(ii), cortar seções semi finas e ultrafinas (iii) e pegando pares de seções ultra-finas em grelhas de cobre (iv). (B) uso de tanto do fornecedor microscópio software e software de RPS feitos sob medida para criar coordenadas de área de amostragem que determinam os locais de gravação. Os pontos de canto das seções são armazenados no software microscopia e o ROI é descrito (identificado com a ajuda das seções semi finas) (i); uma grade de áreas de amostragem é gerada sobre o ROI, uma mudança aleatória (seta vermelha) é introduzida em x e y. O turno é menor que a distância entre as áreas de amostragem, (setas pretas), para que em vez dos quadrados pretos, que não têm nenhuma mudança, os quadrados azuis, que são deslocados aleatoriamente, são usados para determinar os locais de gravação (ii); áreas de amostragem apenas dentro das fronteiras do ROI (desenhado como quadrados pretos e azuis) são utilizadas para gravação. Micrografias são feitas na seção de referência (quadrados pretos) e em locais correspondentes na seção de pesquisa (quadrados azuis) (iii). (C) uma micrografia é feita em cada área de amostragem em uma ampliação suficiente; uma montagem que consiste de várias imagens mescladas é feita se necessário (no caso, 2 x 2 imagens foram fundidas juntos) (i); um quadro de contagem é gerado e mostrado como uma sobreposição na imagem, estruturas dentro do quadro e nas 'linhas de aceitação' (quadro tracejado linhas) serão contadas, mas não aqueles nas 'linhas proibidas' (linhas de frame contínuo) (ii). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2 . Medir parâmetros ultra-estruturais em um par de seções ultra-finas com um quadro de contagem imparcial. (A) visão geral do windows ImageJ usado para contagem e análise de estruturas celulares. Lado esquerdo mostra a micrografia eletrônica com o quadro de contagem como uma sobreposição. Do lado direito: interface de usuário do ImageJ (retângulo azul) com o menu drop-down (topo) e a barra de ferramentas (abaixo); o editor de objeto de ObjectJ (retângulo verde); a janela de Ferramentas de ObjectJ (retângulo laranja) onde as ferramentas de medição podem ser selecionadas e a janela de resultados ObjectJ (retângulo preto) onde todas as medições são documentadas. (B) detalhe de um mostrando as sinapses marcadas sobre a micrografia eletrônica (sinapses em ambas as seções - setas; sinapse apenas sobre as seção de pesquisa-pontas de seta). Aqueles são marcados usando a ferramenta multiponto (círculo vermelho) da barra de ferramentas no ImageJ. (C) os nomes e parâmetros de medição das características sinápticas são definidos usando as Ferramentas de ObjectJ. A Ferramenta de marcador e a característica de interesse são selecionados e o contorno desenhado na imagem pela esquerda-rato-cliques ao longo da estrutura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3. Seleção de áreas para mapeamento elementar dentro um ROI para microscopia eletrônica de transmissão energia filtrada de amostragem. SerialEM é usado para selecionar uma região de interesse e sugerir um elevado número de áreas de amostragem em um espaçamento regular (rosa cruzes nas imagens A e B). Em seguida, um script seleciona aleatoriamente áreas de amostragem (a partir destas coordenadas predefinidas) para aquisição. Áreas de amostragem com iluminação pobre são rejeitadas para evitar barras de grelha e as paradas do roteiro, assim como 20 áreas de amostragem bem iluminados foram selecionadas dentro do ROI. (A) visão geral de toda a área de interesse, delineado por um polígono, com um elevado número de áreas de amostragem possível marcados com x. (B) detalhe de A, mostrando as áreas de amostragem antes de seleção aleatória. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4. Exemplo de aquisição de mapa elemental (EFTEM). (A) Micrografia TEM campo claro da área em torno do ponto de aquisição. Uma área selecionada aleatoriamente foi usada para obter um mapa elementar e é marcada por um retângulo preto. (B) EFTEM pre-borda da imagem de janela na área selecionada aleatoriamente. (C) EFTEM pós-borda da imagem de janela na mesma área. (D) mapa elementar de ferro da mesma área (M-edge). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O fluxo de trabalho apresentado aqui permite que o pesquisador obter dados sobre as características ultra-estruturais de forma imparcial. Isto é muito menos demorado do que as investigações de volume de seções seriais. Vários aplicativos diferentes são usados para atingir esse objetivo. Em primeiro lugar, nosso software feito sob medido do RPS (para detalhes sobre a disponibilidade, favor contatar o autor correspondente) é usado para introduzir um estágio aleatório-shift para selecionar as coordenadas da área de amostragem. Isto permite uma amostragem sistemática uniforme do ROI. Em seguida, para a contagem de estruturas específicas, adaptamos o método disector, onde 2 seções consecutivas com distância conhecida são comparadas, em uma forma nova, em comparação com anteriores estudos13,14,15 como usamos nossos feito por software RPS para amostragem aleatória uniforme sistemático. Isso economiza tempo em comparação com 3D-reconstruindo toda volumes das seções de seriais. O software feito sob medido do RPS é desenvolvido especificamente para um tipo de microscópio, que é um fator limitante para a reprodução de fluxo de trabalho. Uma alternativa deste software específico seria um aplicativo que permite a execução de scripts e é compatível com outros modelos de microscópio.

Com sucesso, usamos esta abordagem para nossos estudos comparativos4,5. Em seções ultra-finas de tecido neuronal, a área de interesse foi delineada e imagens foram tomadas por amostragem sistemática uniforme dentro desta área. Deve notar-se que a área de interesse, a camada de polimorfo de giro do pectínea, é uma área bastante pequena para investigar o que pode ser benéfico para a nossa abordagem. Dentro de um disector colocado aleatoriamente, foram avaliados o número de DCV e várias características ultra-estruturais de sinapses no DGpl de ratos adultos alojados em SE e EE, bem como adulto WT ratos contra ratos adultos de nocaute NPY. Usando nossa abordagem, os dados coletados mostraram alterações em alguns dos parâmetros investigados. Estes resultados confirmaram os de outros estudos semelhantes em animais juvenil2.

Uma desvantagem do uso experimental de fluxo de trabalho pode ser que esta abordagem multi-aplicação não é ideal em termos de facilidade de utilização, como os usuários precisam para se sentir confortável com interfaces de usuário diferentes (no nosso caso, a interface do usuário, TEM seção Serial o RPS software e software de SerialEM). Aprendendo a lidar com todos os aplicativos de maneira eficiente é demorado e deve ser levado em conta. No entanto, investir o tempo para aprender a usar este fluxo de trabalho ainda é claramente favorável ao longo do tempo que é necessário para analisar toda volumes com serial seção TEM. O método de usar uma disector colocado por amostragem sistemática uniforme na área de interesse é suficiente para apresentar dados fiáveis1 sem a necessidade de investigar uma quantidade elevada de seções/volume.

Para maximizar o resultado em nossos estudos, foi vital para cuidar durante a preparação da amostra, bem como a preservação do tecido e as estruturas não é apenas crucial para a avaliação das características estruturais, mas também para identificar a área de interesse sem ambiguidade. Um fator crucial e talvez outra desvantagem desse método, é que uma alta qualidade dos pares de seções ultra-finas é necessária: não deve haver furos ou rugas que cobrem a área sob investigação em qualquer das seções, e a espessura de corte deve ser mantida homogênea. O pesquisador tem que ser bem treinados em Ultramicrotomia. Também tem que ser tomado quando da imagem latente as seções na temperatura, como as seções são sensíveis aos danos do feixe de elétron e podem facilmente se rasgar. Além disso, é importante escolher o número de áreas de amostragem no ROI. Dependendo do objetivo experimental, a ampliação das micrografias da elétron deve ser definido cuidadosamente. Para nossas experiências especificamente, contando as sinapses no sistema nervoso central, 20 regiões de interesse em uma seção com a área de 30.25 µm2 são ótimos. É aconselhável treinar o pessoal bem em reconhecer as características em questão (no nosso caso as sinapses, características sinápticas e DCV) para obter resultados fiáveis. A fim de identificar as sinapses, as vesículas sinápticas devem ser identificáveis e isso requer uma resolução de pelo menos 10 nm. Por isso, uma ampliação de 5000 X foi ideal, mas deve notar-se que a ampliação depende de parâmetros de hardware, tais como o tipo e a posição das câmeras e precisaria ser adaptado para outros tipos de microscópio e/ou câmera. Também tem de se notar que o protocolo usa aplicativos específicos para um TEM e que os usuários com outros modelos tem que considerar as diferenças na configuração.

Acreditamos que nosso fluxo de trabalho pode ser adaptado para muitas outras aplicações, não só em neurociência, mas em um amplo campo de ciências biológicas e também a ciência de materiais (quando a alta resolução de um TEM é necessário) sempre que a questão de pesquisa exige um sistemático uniforme amostragem aleatória e a quantidade de amostras a analisar pede uma maneira eficiente de tempo de análise. Por exemplo, estamos atualmente interessados em Localizar lojas de ferro no cérebro humano. Por isso, recentemente nós adaptamos nosso fluxo de trabalho, para permitir a análise elementar de seções ultra-finas em áreas escolhidas aleatoriamente. A fim de minimizar o número de aplicativos que são necessários para o fluxo de trabalho, tivemos como objetivo aplicar usando o software de SerialEM só, porque pode ser programado para mover a fase pré-definir pontos que podem ser selecionados de forma aleatória. Nós criamos scripts personalizados para controlar a temperatura, com o objectivo de automatizando o fluxo de trabalho totalmente. Isto provou ser viável exceto a focagem automática no modo de imagem filtrado, que não deu resultado satisfatório. Assim, usamos software de DM para focar e para a obtenção de imagens energia filtrada.

Em resumo, apresentamos soluções de software que ajudam na obtenção de micrografias de elétron de uma forma imparcial.

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Financiado pelo número de projeto de fundo de ciência austríaco, FWF, P 29370 B27

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
PentobarbitalSigmaAldrichP3761
FormaldeídoMerck10400510001kg
GlutardialdeídoScience ServicesE 1621025%; 100ml;
Tampão de cacodilatoMerckC4945250g; Ácido dimetilarsínico trihidrato de
sódio Acetato de tionina/CeristainMerck861340
ácido acéticoMerck10006310001 L
Hidróxido de sódioMerck10649510001 kg, pellets
tetraóxido de ósmioScience ServicesE 1911010x1g
TAAB resina de incorporaçãoScience ServicesTAT001500g
DMP-30Science ServicesTAD024100g
DDSAScience ServicesTAD025500g
Acetato de uranila di-hidratadoPlano GmbH19481esgotado, 25g
Ultrastain 2Leica16707235Citrato
chumbo Solução azul de toluidinaAgar ScientificAGR172710g
PiolofórmioPlano GmbHR127510g Pó
ProylenoxideSigmaAldrich82320-1L1L
DPX Meio de embutirPlano GmbHR1320Meio de embutir para seções semifinas em lâmina de vidro, 50 ml
Vibratome, Leica VT 1000Leica Microsystems, Viena, Áustria
Leica Ultracut UCT, ultramicrotomLeica Microsystems, Wetzlar, Alemanha
Tecnai G2 20FEI, Eindhoven, Holanda
Câmera grande angular MegaviewOlympus Soft Imaging Solution, Mü nster, Alemanha
E.U. 1000 câmera digitalGatan, Pleasanton, EUA
TEM Imaging Analysis SoftwareFEI, Eindhoven, Holanda
FEI Serial Section SoftwareFEI, Eindhoven, Holanda
Fiji, ImageJ 1.52eInstituto Nacional de Saúde, EUA
SPSS 20.0SPSS Inc., Chicago, IL, EUA
SerialEMRegentes da Universidade do Colorado
RPS (amostragem de ponto aleatório) software 0.9afeito
Disector v1.0.2 (macro ImageJ)feito sob medida
EFTEMSerialEM (script SerialEM)feito sob medida
de grau EM de sob medida

Referências

  1. Howard, V., Reed, M. Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy. , BIOS Scientific Publishers. Oxford. (1998).
  2. Nakamura, H., Kobayashi, S., Ohashi, Y., Ando, S. Age-changes of brain synapses and synaptic plasticity in response to an enriched environment. Journal of Neuroscience Research. 56 (3), 307-315 (1999).
  3. Landers, M. S., Knott, G. W., Lipp, H. P., Poletaeva, I., Welker, E. Synapse formation in adult barrel cortex following naturalistic environmental enrichment. Neuroscience. 199, 143-152 (2011).
  4. Reichmann, F., et al. A novel unbiased counting method for the quantification of synapses in the mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 240, 13-21 (2015).
  5. Reichmann, F., et al. Environmental enrichment induces behavioural disturbances in neuropeptide Y knockout mice. Scientific Report. 6, 28182(2016).
  6. Mayhew, T. M. Taking Tissue Samples from the Placenta: An Illustration of Principles and Strategies. Placenta. 29, 1-14 (2008).
  7. Ferguson, S., Steyer, A. M., Mayhew, T. M., Schwab, Y., Lucocq, J. M. Quantifying Golgi structure using EM: combing volume-SEM and stereology for higher throughput. Histochemistry and Cell Biology. 147, 653-669 (2017).
  8. Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. Journal of Microscopy. 134 (2), 127-136 (1984).
  9. Gundersen, H. J., et al. The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96 (10), 857-881 (1988).
  10. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier/Academic Press. (2008).
  11. Lewis, P. R., Knight, D. P. Staining Methods for Sectioned Material. , Elsevier/North-Holland Biomedical Press. (1988).
  12. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J Struct Biol. 152 (1), can be downloaded from http://bio3d.colorado.edu/SerialEM 36-51 (2005).
  13. Rampon, C., Tang, Y. P., Goodhouse, J., Shimizu, E., Kyin, M., Tsien, J. Z. Enrichment induces structural changes and recovery from nonspatial memory deficits in CA1 NMDAR1-knockout mice. Nature Neuroscience. 3 (3), 238-244 (2000).
  14. Xu, X., Ye, L., Ruan, Q. Environmental enrichment induces synaptic structural modification after transient focal cerebral ischemia in rats. Experimental Biology and Medicine. 234 (3), 296-305 (2009).
  15. Lonetti, G., et al. Early environmental enrichment moderates the behavioral and synaptic phenotype of MeCP2 null mice. Biological Psychiatry. 67 (7), 657-665 (2010).

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