Artigo de método

Efeito de proteínas fluorescentes na fusão parceiros usando Polyglutamine ensaios de toxicidade em levedura

DOI:

10.3791/58748

⸱

28 de novembro de 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Western Ontario, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Western Ontario

Neste artigo

Resumo

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Este artigo descreve os protocolos para avaliar o efeito de proteínas fluorescentes na agregação e toxicidade de misfolded polyglutamine expansão para a avaliação rápida de uma proteína fluorescente recentemente descaracterizada no contexto dos repórteres fluorescentes.

Resumo

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Para a investigação de localização da proteína e tráfico utilizando imagens de células vivas, pesquisadores muitas vezes dependem de sua proteína de interesse para um repórter fluorescente de fusão. A lista em constante evolução de proteínas fluorescentes geneticamente codificadas (FPs) apresenta aos usuários com várias alternativas quando se trata de projeto de fusão fluorescente. Cada FP tem propriedades específicas de ópticas e biofísicas que podem afetar as propriedades bioquímicas, celulares e funcionais das fusões fluorescentes resultantes. Por exemplo, vários FPs tendem a formar oligómeros inespecíficos que são susceptíveis de impedir a função do parceiro de fusão. Infelizmente, apenas alguns métodos existem para testar o impacto de FPs sobre o comportamento do repórter fluorescente. Aqui, descrevemos um método simples que permite a avaliação rápida do impacto da FPs usando polyglutamine (polyQ) ensaios de toxicidade em brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae. Huntingtina expandido PolyQ proteínas estão associadas com o aparecimento da doença de Huntington (HD), onde a huntingtina expandida agrega em oligômeros tóxicos e corpos de inclusão. A agregação e a toxicidade do polyQ expansões em levedura são altamente dependentes as sequências flanqueando a região polyQ, incluindo a presença de etiquetas fluorescentes, proporcionando uma plataforma experimental ideal para estudar o impacto do FPs sobre o comportamento de seus parceiro de fusão.

Introdução

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Desde a caracterização inicial da proteína verde fluorescente (GFP) de Aequorea victoria1, uma variada gama de FPs geneticamente codificado foram desenvolvidos, permitindo que biólogos da célula localizar e rastrear simultaneamente múltiplos eventos/proteínas celulares na vida células2,3. FPs são derivadas de vários organismos, de água-viva de coral e, portanto, a exibição Propriedades biofísicas específicas que desviam-se extensivamente para além de seu respectivo espectro fluorescente. Essas propriedades incluem o brilho, fotoestabilidade e uma tendência para oligomerize, entre outros,2,4. Selecionar monomérico FPs é um aspecto importante na seleção de uma marca adequada ao projetar um repórter fluorescente, a fim de minimizar interações inadequadas e alterações da função do parceiro fusão e maximizar a eficiência de repórter para uma dado compartimento celular4,5,6. Enquanto as boas práticas agrícolas, ao longo do tempo, sido evoluiu para minimizar o efeito de adicionar a tag fluorescente para a fusão parceiro5,7,8, como novas variantes FP executam em relação ao GFP continua a ser difícil de avaliar.

Existem alguns métodos para caracterizar o comportamento de FPs. A maioria deles envolve testar propriedades biofísicas de FPs usando abordagens bioquímicas, tais como ultracentrifugação e gel filtração protocolos9,10,11,12. Tais métodos têm a limitação do uso de FPs purificada em solução, oferecendo pequeno insight sobre seu comportamento nas células intactas. O desenvolvimento do retículo endoplasmático liso organizado (OSER) ensaio oferece uma avaliação quantificável da tendência de FPs' a oligomerize em vida células13 , testando a capacidade de FPs Blumental de reorganizar os túbulos do retículo endoplasmático em Espirais OSER14. Esta técnica com êxito pode detectar alterações entre monoméricas e oligoméricas variantes de GFP e outros FPs. No entanto, baseia-se principalmente na superexpressão em células transfectadas transitoriamente, e a quantificação e análise de imagens podem ser demorados, a menos que a técnica é adotada como uma coleção de dados automatizada e fluxo de trabalho de análise.

A fim de complementar essas abordagens, estabelecemos um ensaio que se beneficia do efeito de etiquetas fluorescentes sobre a toxicidade e a agregação de expansões polyQ no fermento15,16. A expansão do trecho com mais de 36 polyQ repete dentro o primeiro exon de codificação do gene que da proteína huntingtina (Htt) está associada com a doença de Huntington17,18. A expressão de expandido Httex1 em resultados de levedura em um forte agregação da proteína Htt misfolded acoplada a um defeito grave de crescimento. Curiosamente, estes fenótipos são fortemente influenciados pelas sequências flanqueando o trecho polyQ, incluindo FPs15,16. Isso foi racionalizado que as diferentes propriedades de FPs diferencialmente podem afetar polyQ toxicidade no fermento. De fato, comparado ao GFP-como FPs, proteínas fluorescentes vermelhas e suas formas evoluídas mostraram uma reduzida toxicidade e agregação16. Este manuscrito fornece um protocolo detalhado para avaliar o efeito da próxima geração de FPs na toxicidade polyQ e agregação em levedura. Este ensaio permite uma análise rápida e potencialmente alto teor de variantes FP que pode ser usado em paralelo com anteriormente caracterizada técnicas para caracterização ideal de novo FPs e pode avaliar qual o seu desempenho em comparação com as boas práticas agrícolas.

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Protocolo

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1. geração de novo fluorescente etiquetado Httex1 repórteres para uma expressão em levedura

Nota: Esta secção foi modificada o protocolo por Jiang et al . 16 e Albakri et al . 19.

  1. Desenho de primers para amplificar a sequência de codificação da proteína fluorescente ou interesse pelo PCR. O primer para a frente deve incluir uma sequência de líder para ajudar a enzima de restrição durante a digestão (GATC), seguida por um site de restrição SpeI (ACTAGT) e 20 bases a jusante do ATG (excluindo ATG) do gene da proteína fluorescente de interesse. O primer reverso deve incluir a sequência de líder (GATC), seguido de um sítio de restrição de SalI (GTCGAC) e o complemento de reverso de 20 bases montante do códon de parada da sequência FP (incluindo paragem).
  2. Utilizando os primers desenhados na etapa 1.1, realizar a reação de PCR usando um thermocycler com as seguintes configurações: calor para 95 ° C por 1 min e ciclo a 95 ° C por 30 s, 60 ° C por 30 s e 72 ° C por 2 min por kB de produto do PCR. Realização de 18 ciclos é amplo.
  3. Execute a reação de PCR em um gel de agarose (0,5% no Tris-Acetato-EDTA). Lá deve uma única banda correspondente ao tamanho do produto esperado. Isole o fragmento usando um kit de purificação de gel.
  4. O protocolo emprega um vetor deex1 Htt carregando 25 (não tóxico) e 72 (HD-associado, exibindo uma forte agregação) polyQ repete. Digerir ambos os fragmentos PCR e o vetor com enzimas de restrição SpeI e SalI por 3 h a 37 ° C.
  5. Purifica o vetor digerido, executando-o em um gel de agarose, como na etapa 1.3.
  6. Purifica o fragmento digerido do PCR usando um kit de purificação de PCR.
  7. Ligam o fragmento resultante de PCR digerido e p415 -GAL1-bandeira-25/72QpolyQ plasmídeos1 usando T4 ligase (1 h à temperatura ambiente). Use uma reação de 10 µ l (1 µ l da enzima T4, 1 µ l de tampão de X 10, 6 µ l de fragmento do PCR e 2 µ l de vetor).
  8. Transformar a 2 µ l de reação da ligadura em 50 µ l de Escherichia coli-células competentes e incube-os em gelo por 30 min. Então, calor-choque as células a 42 ° C por 30 s. adicionar 1 mL de mídia de consequência SOC e incubam a 37 ° C, durante 1 h em um shaker. Placa de 200 µ l da reação em um prato de LB-ágar contendo 100 ampicilina µ g/mL. Incube a placa a 37 ° C durante a noite.
  9. Selecione três colônias bacterianas individuais, cultivá-las durante a noite em 3 mL de LB-caldo contendo 100 ampicilina µ g/mL a 37 ° C em uma coqueteleira e extrair o plasmídeo de DNA usando um kit de purificação de plasmídeo.
  10. Verifique o plasmídeo por digestão de 500 ng de DNA usando enzimas de restrição SpeI e SalI durante 1 h a 37 ° C e a reação de executar em um gel de agarose (0,5% no Tris-Acetato-EDTA). Deve haver duas bandas com os tamanhos certos do vetor (~ 7 kb) e o insert (tamanho varia de acordo com o gene de interesse). Em seguida, verifique se o plasmídeo de sequenciação.
  11. Transforme ascende a p415 -GAL1-, plasmídeos - polyQ-FP debandeirapara a cepa de levedura W303 seguindo um protocolo de transformação de fermento padrão2.

2. ensaio da mancha

  1. Raia o fermento clona escriturada 25Q/72Q com o FP de interesse em uma placa de ágar contendo meios de seleção de levedura (sintética completa-SC sem leucina) com glicose como fonte de carbono. Ao mesmo tempo, também marcam a 25Q/72Q-ymsfGFP para servir como controle positivo.
    Nota: 25Q/72Q construções que não contêm uma etiqueta fluorescente não são tóxicas e podem servir como controle negativo.
  2. Incube as placas a 30 ° C, durante 2-3 d.
  3. Selecione até três colônias única da placa.
  4. Inocule 5ml de SC suplementado com 2% de glicose como fonte de carbono.
  5. Pelota 200 µ l de cada cultura durante a noite e lavar 3x com estéril de água destilada.
  6. Ressuspender as células em mídia de SC contendo 2% de galactose como fonte de carbono para induzir a expressão de polyQ fusões. Incube a galactose mídia durante a noite a 30 ° C em um rotador de tubo. Como um controle, repita este passo usando meios que contenham glicose.
  7. Na manhã seguinte, equalizar as densidades de célula a densidade óptica em 600 nm (OD600) de 0,2 em 100 µ l de mídia SC em uma placa de 96 poços estéril.
  8. Prepare quatro diluições quíntuplo de cada amostra com água esterilizada por pipetagem 20 µ l da amostra anterior até 80 µ l de mídia no poço próximo.
  9. Use um fermento fixando a ferramenta para manchar as células em placas seletivas (contendo glicose ou galactose) e incube a 30 ° C para d 2.
  10. As placas da imagem com um dispositivo de documentação de imagem.

3. quantificação do crescimento celular em cultura líquida

  1. Prepare as culturas de células, seguir passos 2.1-2.5 do presente protocolo.
  2. Medir o OD600 usando um espectrofotômetro.
  3. Dilua as células de uma OD600 de 0,1 em 300 µ l de mídia em uma placa de 96 poços.
  4. Execute cada amostra em triplicado.
  5. Incube a placa em uma placa leitor/incubadora com agitação capacidades. Definir o número de amostras, a temperatura de 30 ° C, a absorvância em 600 nm, comprimento dos experimentos de 24 h e os intervalos de medição, a 15 min e selecione o modo de agitação contínuo.
  6. Criar a curva de crescimento e quantificar a área sob a curva usando software de gráfico científico. O GraphPad Prism 7 é recomendado. Cole os dados em uma mesa XY com três valores de replicar. A curva de crescimento será mostrada na pasta gráficos no lado esquerdo. Para quantificar a área sob a curva, selecione analisar no canto superior esquerdo e clique em área sob a curva em análises XY.

4. fluorescente microscopia

  1. Prepare as culturas de células, seguir passos 2.1-2.5 do presente protocolo.
  2. Diluir as células 10 x em crescimento media e transferência 200 µ l de cada amostra a câmaras de imagem de 8 poços.
  3. Imagem das células usando um microscópio confocal, equipado com um objetivo X plano Aprochromoat 63 (1.4 at) à temperatura ambiente.
    Nota: O uso de um microscópio confocal é opcional. Também pode ser empregado um microscópio fluorescente padrão de campo amplo.
  4. Ajuste a potência de pinhole e laser para aquisição de imagem ideal. Uma vez que os agregados de 72Q são muito mais brilhantes do que o sinal 25Q difusa, muitas vezes é necessário usar uma configuração diferente de aquisição entre os plasmídeos diferentes para evitar a saturação do sinal fluorescente.
  5. Processe as imagens usando o ImageJ20 ou outro software de processamento de imagem. Neste passo, a percentagem de células que exibição agregado pode ser calculado manualmente é desejada.

5. dot Blot

Nota: No presente protocolo, borrão do ponto é usado para examinar os níveis de expressão de proteínas. Prepare as culturas de células, seguir passos 2.1-2.5 do presente protocolo.

  1. Gere o lisado de proteína usando contas de vidro em tampão de lise (EDTA 1 mM, 100 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl; 5% glicerol, 1mm ditiotreitol [TDT]). Adicione inibidores da protease, fluoreto de phenylmethylsulfonyl de 4 mM (PSMF) e cocktail, diretamente antes da utilização do inibidor da protease. 5 mL de cultura durante a noite de pelotas e Resuspenda-lo em 200 µ l de grânulos de vidro e 200 µ l de tampão de Lise. Vórtice de 30 s por 12 rodadas. Centrifugar a 12.000 x g a 4 ° C por 10 min e recolher o sobrenadante.
  2. Mancha uma quantidade igual de proteínas totais em uma membrana de nitrocelulose, usando um aparelho de microfiltração. Prewet da membrana com PBS e montar o aparelho. Conectar a uma fonte de vácuo e verifique se que os parafusos estão apertados. Ligue o aspirador de pó e deixe o filtro de amostra através da membrana por gravidade.
  3. Bloquear a membrana em PBS - 0.05% Tween/5% gordura de leite.
  4. Incubar a membrana com anticorpo antibandeira primário durante a noite a 4 ° C. Recomenda-se o anticorpo monoclonal antibandeira M1.
  5. Lavar a membrana 3 x por 10 min cada com PSB - 0,05% Tween.
  6. Incube a membrana com um anticorpo secundário fluorescente etiquetada (anti-mouse IgG) por 1h à temperatura ambiente em PBS - 0.05% Tween/5% gordura de leite.
  7. Lave a membrana 3 x 10 min com PSB - 0,05% Tween.
  8. Imagem-blot utilizando um sistema de documentação de immunoblot.

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Resultados

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FPs têm diferentes propriedades biofísicas, incluindo sua tendência a oligomerize, que podem afetar o comportamento dos seus parceiros de fusão no contexto dos repórteres fluorescentes. Este protocolo descreve um método simples onde várias FPs pode ser fundido a expansões polyQ tóxicos. Desde polyQ toxicidade é altamente dependente as sequências flanqueando o estiramento polyQ15, este ensaio permite uma comparação rápida e direta de repórteres de fusão polyQ fluore...

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Discussão

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Neste artigo, vários ensaios para medir a agregação de Httex1 polyQ expansões e seu efeito sobre o crescimento de levedura foram utilizados como modelo para estudar como diferente fluorescente proteínas alteram seus parceiros de fusão no contexto dos repórteres fluorescentes . Usando uma variante GFP (ymsfGFP) como um controle positivo, mostramos que isso detecta alterações significativas de toxicidade polyQ e agregação entre diferentes etiquetas fluorescentes e permite uma comparação direta e rápida do desemp...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Este estudo é suportado por uma subvenção de funcionamento de institutos canadenses para pesquisa em saúde para M.L.D. e paixao O trabalho aqui apresentado é suportado por um prêmio de John R. Evans líder fundo da Fundação Canadense para a inovação e um fundo correspondente do fundo de investigação do Ontário para paixao Y.J. é suportado por um MSc para bolsa de doutorado transferência do reitor da escola de Schulich M edicine e odontologia na Universidade de Ontário ocidental. S.D.G. é suportado por uma bolsa de doutorado do Canadá ALS.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
5-alfa E. coli competente (alta eficiência)New Englanfd BiolabC2987
SpeI-HFNew Englanfd BiolabR3133Enzimas de alta fidelidade são preferidas
SalI-HFNew Englanfd BiolabR0138Enzimas de alta fidelidade são preferidas
AgaroseFisher ScientificBP160
LB-AgarFisher ScientificBP1425
LB-BrothFisher ScientificBP1426
AmpicilinFisher ScientificBP1760
PfuUltra DNA polimerase de alta fidelidadeAgilent Technologies600382
Espectrofotômetro de microplacas EPOCH2BioTek Instruments incEPOCH2TC
Yeast Pin ReplicatorV& P Scientific inc.
Gerador de imagens SPIS& P Robótica Inc.spImager-M
Zeiss LSM 800 confocal com AryScanCarl Zeiss MicroscopiaLSM 800
Câmaras de imagem Lab-Tek de 8 poçosAparelho Fisher Scientific12565470
Bio-DotBio-Rad1706545
Chemi Doc XRS+Bio-Rad1708265
anticorpo anti-FLAG M1Sigma-AldrichF3040
Anticorpo secundário anti-camundongo IgG alexa 555 de cabraThermo A32727
Kit MiniPrep de plasmídeoFisher ScientificK0503
Kit de extração de gel de plasmídeoFisher ScientificK0831
Kit de purificação de PCRFisher ScientificK0702
PrizmGraphPadN/A
TAE (Tris-acetato-EDTA)Fisher ScientificBP13354
VP407AH

Referências

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