Um microscópio avançado que permitem rápida e de alta resolução de imagem de ambos, a membrana plasmática isolada e o volume intracelular circundante, será apresentado. A integração de giro do disco e total microscopia de fluorescência de reflexão interna em uma configuração permite experiências de imagens ao vivo em taxas de aquisição elevado até 3.5 s por pilha de imagem.
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Artigo de método
Visualizando a formação de adesão em células por meio de avançados girando a reflexão interna Total disco microscopia de fluorescência
Neste artigo
Resumo
Resumo
Em células vivas, processos tais como a formação de aderência envolvem grandes mudanças estruturais na membrana plasmática e o interior da célula. Para visualizar estes eventos altamente dinâmicos, duas técnicas de microscopia de luz complementares que permitem rápida imagem latente de amostras ao vivo foram combinadas: girando microscopia de disco (SD) para a gravação do volume rápido e de alta resolução e reflexão interna total microscopia de fluorescência (TIRF) para visualização da membrana plasmática e localização exacta. Um protocolo de imagem abrangente e completo será mostrado para guiar a aquisição, calibração de microscópio, formação de imagem e preparação da amostra, resultando em uma série de imagens ao vivo de cor multi SD-TIRF com alta resolução espaço-temporal. Todas as etapas de pós-processamento de imagem necessária para gerar multidimensional datasets de imagens ao vivo, ou seja, o registro e a combinação dos canais individuais, são fornecidas em uma macro auto escrita para o open source software ImageJ. A imagem latente de proteínas fluorescentes durante a iniciação e a maturação dos complexos de adesão, bem como a formação da rede do citoesqueleto de actina, foi utilizado como prova de princípio para esta nova abordagem. A combinação de microscopia 3D de alta resolução e TIRF forneceu uma descrição detalhada destes processos complexos dentro do ambiente celular e, ao mesmo tempo, localização exacta das moléculas da membrana-associado detectado com um alto relação de sinal-para-plano de fundo.
Introdução
Nossos dias, técnicas de microscopia de luz, fornecendo imagens de resolução alta/super no fixo e espécime vivo estão se desenvolvendo rapidamente. Técnicas de super-resolução como estimularam emissão depleção (STED), estruturada iluminação microscopia (SIM) e microscopia de localização de foto-ativação (PALM) ou microscopia direta reconstrução óptica estocástico (Tempestade), respectivamente, são comercialmente disponíveis e permitir a geração de imagens de estruturas subcelulares, mostrando detalhes quase na escala molecular1,2,3,4,
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Protocolo
1. preparação das células
- Dois dias antes do experimento, as sementes de 3 * 105 HeLa ou NIH3T3 células em 2 mL do meio de crescimento cheio por alvéolo de uma placa de cultura de pilha 6-poços. Certifique-se de que as células são tratadas em uma capa de fluxo laminar em todo este protocolo.
- Um dia antes do experimento, prepare os reagentes de transfecção de acordo com as recomendações do fabricante ou um protocolo empiricamente determinado, por exemplo:
- Diluir 1 µ g de RFP-Lifeact e 1 µ g/ml de YFP-vinculina um total de 200 µ l reduzida média de soro. Vórtice o reagente de transfeccao brevemente, adicionar 4 µ l a 200 µ....
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Resultados
Para mostrar o potencial da imagem SD-TIRF, que desenvolveu um ensaio que deveria revelar a organização espaço-temporal de complexos de adesão célula-matriz e sua interação com o citoesqueleto durante a adesão celular. Portanto, aderente HeLa ou, alternativamente, NIH3T3 células foram transfectadas com YFP-vinculina e RFP-Lifeact para 18-24 h, trypsinized e semeado em pratos de fundo de vidro revestido de fibronectina. Estas linhas de célula foram escolhidas para seus pronunciado citoesqu.......
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Discussão
Neste trabalho foi apresentado a primeira implementação bem sucedida da microscopia SD e TIRF em uma configuração adequada para a realização de experiências imagem de célula viva, ou seja, taxas de aquisição elevado, tais como 2 pilhas de imagem SD-TIRF por minuto 3 fase diferente posições, correspondentes a um total de 168 quadros (cerca de 3 quadros por segundo), foram adquiridas. Os microscópios de SD-TIRF alguns que eram anteriormente descrito12,13, .......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos muito a comunidade científica da Universidade Medical Center Hamburg-Eppendorf nos apoiar com amostras para avaliação. Ou seja, agradecemos-Sabine Windhorst NIH3T3 células, Andrea Mordhorst para YFP-vinculina e Maren Rudolph para RFP-Lifeact.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Microscópio e acessórios | |||
| SD-TIRF microscópio | Visitron Systems | ||
| Ti com sistema de foco perfeito | Suporte de microscópio invertido | Nikon | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Unidade de disco giratório em configuração de câmera dupla | |
| iLAS2 | Scanner TIRF/FRAP | da Roper Scientific | |
| Evolve | Câmeras Photometrix | EM-CCD | |
| Estágio PiezoZ | Produtos Eletrônicos | Estágio Z Motorizado | |
| Estágio Bioprecision2 XY | Produtos Eletrônicos | Estágio XY Estágio XY Motorizado | |
| Câmara de incubação superior do palco | Linha ousada Okolab | Temperatura, CO2 e fornecimento | |
| de umidadeCultura de células | |||
| Células de câncer cervical HeLa | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblastos | DSMZ | ACC-59 | |
| salina tamponada com fosfato de Dulbecco (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Tripsina-EDTA 0,05% | Gibco | 25300054 | |
| Meio de Águia Modificado de Dulbecco + GlutaMAX-I (DMEM)Gibco | 31966-021 | ||
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Meio de soro reduzido |
| Soro fetal de bezerro (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicilina/Estreptomicina (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Meio de crescimento completo (DMEM suplementado com 10% FCS e 1% PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfecção reagente |
| Ácido ascórbico (AA) | Sigma | A544-25G | |
| Placa de cultura de células de 6 poços | Sarstedt | 83.392 | |
| Pratos com fundo de vidro | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0,17mm lamínula de vidro |
| Fibronectina, plasma bovino | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer improved chamber | VWR | 631-0696 | |
| Contas TetraSpeck | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmids | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Instituto de Microbiologia Médica, Centro Médico Universitário de Hamburgo Eppendorf, Alemanha | ||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Instituto de Microbiologia Médica, Centro Médico Universitário de Hamburgo Eppendorf, Alemanha | ||
| Software e plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Versão 3 | |
| ImageJ | Versão 1.52c | ||
| Plug-in | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | esta publicação | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | Versão 6.2.2 |
Referências
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780(1994).
- Gustafsson, M. G. L.
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Reimpressões e permissões
