Artigo de método

Visualizando a formação de adesão em células por meio de avançados girando a reflexão interna Total disco microscopia de fluorescência

DOI:

10.3791/58756

⸱

21 de janeiro de 2019

 , 
1UKE Microscopy Imaging Facility, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um microscópio avançado que permitem rápida e de alta resolução de imagem de ambos, a membrana plasmática isolada e o volume intracelular circundante, será apresentado. A integração de giro do disco e total microscopia de fluorescência de reflexão interna em uma configuração permite experiências de imagens ao vivo em taxas de aquisição elevado até 3.5 s por pilha de imagem.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Em células vivas, processos tais como a formação de aderência envolvem grandes mudanças estruturais na membrana plasmática e o interior da célula. Para visualizar estes eventos altamente dinâmicos, duas técnicas de microscopia de luz complementares que permitem rápida imagem latente de amostras ao vivo foram combinadas: girando microscopia de disco (SD) para a gravação do volume rápido e de alta resolução e reflexão interna total microscopia de fluorescência (TIRF) para visualização da membrana plasmática e localização exacta. Um protocolo de imagem abrangente e completo será mostrado para guiar a aquisição, calibração de microscópio, formação de imagem e preparação da amostra, resultando em uma série de imagens ao vivo de cor multi SD-TIRF com alta resolução espaço-temporal. Todas as etapas de pós-processamento de imagem necessária para gerar multidimensional datasets de imagens ao vivo, ou seja, o registro e a combinação dos canais individuais, são fornecidas em uma macro auto escrita para o open source software ImageJ. A imagem latente de proteínas fluorescentes durante a iniciação e a maturação dos complexos de adesão, bem como a formação da rede do citoesqueleto de actina, foi utilizado como prova de princípio para esta nova abordagem. A combinação de microscopia 3D de alta resolução e TIRF forneceu uma descrição detalhada destes processos complexos dentro do ambiente celular e, ao mesmo tempo, localização exacta das moléculas da membrana-associado detectado com um alto relação de sinal-para-plano de fundo.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nossos dias, técnicas de microscopia de luz, fornecendo imagens de resolução alta/super no fixo e espécime vivo estão se desenvolvendo rapidamente. Técnicas de super-resolução como estimularam emissão depleção (STED), estruturada iluminação microscopia (SIM) e microscopia de localização de foto-ativação (PALM) ou microscopia direta reconstrução óptica estocástico (Tempestade), respectivamente, são comercialmente disponíveis e permitir a geração de imagens de estruturas subcelulares, mostrando detalhes quase na escala molecular1,2,3,4,5,6. No entanto, essas abordagens ainda limitados aplicabilidade para experiências de imagens ao vivo, em que grandes volumes precisam ser visualizado com múltiplos frames por segunda velocidade de aquisição. Variedades de processos altamente dinâmicos, regulamentados através da membrana plasmática, por exemplo, endo- / exocitose, adesão, migração ou sinalização, ocorrem com alta velocidade dentro de grandes volumes de celulares. Recentemente, a fim de preencher esta lacuna, uma técnica de microscopia integrado foi proposto girando chamado disco-TIRF (SD-TIRF)7. No detalhe, microscopia TIRF permite especificamente isolar e localizar a membrana plasmática8,9, enquanto SD microscopia é um dos mais sensíveis e rápido viver técnicas de imagem para a visualização e acompanhamento das organelas subcelulares na citoplasma10,11. A combinação de ambas as técnicas de imagem em uma única instalação já foi realizada no últimos12,13, no entanto, o microscópio aqui apresentado (Figura 1) finalmente cumpre os critérios para realizar experimentos de SD-TIRF de imagens ao vivo os processos acima mencionados em 3 frames por segunda velocidade. Desde que este microscópio é comercialmente disponível, o objetivo deste manuscrito é descrever em detalhes e fornecer ferramentas open source e protocolos para aquisição de imagens, registro e visualização associada a microscopia SD-TIRF.

A instalação é baseada em um microscópio invertido ligado a varredura duas unidades através de portas independentes - porta esquerda está ligada à unidade SD e porta traseira para a unidade do scanner para TIRF e foto-ativação/branqueamento experimentos. Lasers de até 6 (405/445/488/515/561/640 nm) pode ser usado para a excitação. Excitação e detecção do sinal de fluorescência, ou um 100 x / óleo NA1.45 ou 60 x / óleo NA1.49 objetivo TIRF, respectivamente, têm sido empregadas. A luz emitida é dividida por um espelho dicroico (561 nm-passe longo ou 514 nm long-pass) e filtrado por vários filtros passa-banda (55 nm de largura centrada em 525 nm, 54 nm de largura centrada em 609 nm para fluorescência verde e vermelha, respectivamente) colocado na frente da cam CCD EM dois épocas. Por favor, note que os detalhes mais técnicos sobre a instalação estão listados na Zobiak et al 7. na configuração TIRF, a unidade de SD é movido para fora o trajeto da luz dentro de cerca de 0,5 s para que as mesmas duas câmeras podem ser usadas para a deteção, permitindo a comutação rápida entre as duas modalidades de imagem em comparação com cerca de 1 s, o que foi relatado no passado13 < /C2 >. Este recurso permite a aquisição simultânea de canal duplo, assim, 4 canais SD-TIRF imagem no anteriormente velocidade incomparável e precisão pode ser executada. Além disso, o alinhamento entre imagens SD e TIRF é desnecessário. Alinhamento de imagem entre as duas câmaras, no entanto, deve ser verificada antes de iniciar o experimento e corrigidos, se necessário. No seguinte protocolo, uma rotina de correção de registro foi implementada em uma macro auto escrita do ImageJ. Além disso, a macro foi principalmente projetada para permitir uma visualização simultânea do SD - e datasets TIRF apesar de sua dimensionalidade diferente. O software de aquisição não fornecer esses recursos.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. preparação das células

  1. Dois dias antes do experimento, as sementes de 3 * 105 HeLa ou NIH3T3 células em 2 mL do meio de crescimento cheio por alvéolo de uma placa de cultura de pilha 6-poços. Certifique-se de que as células são tratadas em uma capa de fluxo laminar em todo este protocolo.
  2. Um dia antes do experimento, prepare os reagentes de transfecção de acordo com as recomendações do fabricante ou um protocolo empiricamente determinado, por exemplo:
    1. Diluir 1 µ g de RFP-Lifeact e 1 µ g/ml de YFP-vinculina um total de 200 µ l reduzida média de soro. Vórtice o reagente de transfeccao brevemente, adicionar 4 µ l a 200 µ l DNA e vórtice novamente. Incube a mistura de Transfeccao para 15-20 min à temperatura ambiente.
    2. Adicione a mistura de transfeccao toda gota a gota diretamente para as células. Misture agitando a placa e colocá-lo de volta para a incubadora.
  3. No dia do experimento, prepare a amostra para a geração de imagens ao vivo:
    1. Prepare uma 10 µ g/mL solução de fibronectina em PBS para revestir a superfície de vidro de um prato de fundo de vidro de 35 mm. Use somente alta qualidade 0,17 mm as lamelas de vidro para um desempenho ideal TIRF e evite pratos de plástico inferior. Deixe a solução na superfície do vidro por 30 min à temperatura ambiente, então remova-o e deixe o prato deixe secar naturalmente.
    2. Diluir uma solução de grânulos multi fluorescente 0.1 µm com uma densidade de 1,8 x 109 partículas por mL de água destilada e adicionar a solução para 30-60 s para a superfície de vidro revestido de fibronectina. Imediatamente remover a solução e deixe o prato deixe secar naturalmente.
      Nota: Este passo é necessário somente se o avião TIRF deve ser encontrado antes da semeadura de células e/ou adquirir uma imagem de referência de 2 cores para registro de imagem baseada em talão.
    3. Preparar uma solução de 0,1 M de ácido ascórbico (AA) e diluir para uma concentração final de 0,1 mM em um meio (AA-médio). Coloque a solução em banho maria a 37 ° C.
      Nota: Use otimizado fluorescência meio de cultura celular se possível, tais como phenolred-livre e (ribo) flavin-reduzida e médias. AA é um agente antioxidante que pode reduzir efeitos fototóxicos durante a geração de imagens ao vivo14. Nós temos testado com sucesso neste ensaio, ou seja, mais células apareceram saudáveis sob as condições aplicadas do que sem adição de AA. No entanto, o pH do meio foi reduzido por 0,17 unidades de pH.
    4. Lavar as células com 2 mL de PBS, adicionar 250 µ l do Trypsin-EDTA e espere até que as células são totalmente separada (2-3 min em uma incubadora de 37 ° C). Ressuspender as células cuidadosamente 1ml pré aquecido AA-médio com uma pipeta e adicioná-lo ao mL 4 AA-médio em um tubo de cultura de células de 15 mL. Coloque a suspensão de células com uma tampa um pouco aberta na incubadora conjunto para 37 ° C e 5% CO2 nos arredores do microscópio.
    5. Adicionar 1 mL pré-aquecido AA-médio para o prato fundo de vidro e coloque-o no suporte do microscópio pré-aquecido (ver parágrafo seguinte).

2. ao vivo imagens

  1. Inicie o controle ambiental do microscópio para alcançar uma estável a 37 ° C, 5% de CO2 e atmosfera úmida.
    Nota: Aqui, uma câmara de incubação superior pequeno palco tem sido usada que permitido configurações estáveis dentro de cerca de 15 min. de incubadoras maiores precisará de mais tempo para alcançar condições estáveis.
  2. Corrigi todas as configurações de aquisição no microscópio antes de aplicar a suspensão de células:
    1. Definir o intervalo de tempo de 30 s e a duração de 60-90 min. activar a função de focagem automática do autofoco baseado em hardware para cada ponto do tempo (valor "1").
    2. Ajuste a exposição da câmera e ganho, bem como a potência do laser para cada canal. Alto ganho de níveis, tempo de exposição baixo e do laser de baixa potência são recomendáveis para reduzir a toxicidade de foto.
      Nota: Os dados aqui apresentados foi adquiridos com exposição de 200 ms, ganho de nível 500 e 20% do laser de potência igual a intensidades de excitação de 0.5 W/cm ² para 488 nm e 1 W/cm ² para 561 nm, respectivamente.
    3. Defina a z-pilha para os canais de disco giratório para 10 µm com espaçamento de 0,4 µm. Desactivação da z-pilhas para os canais TIRF. Defina o deslocamento inferior para "0", ou seja, o avião mais baixo será a posição do foco da ferragem autofoco.
    4. Active a função de multi-ponto "posições de estágio".
      Nota: Até 3 posições podem ser gravadas em um intervalo de tempo de 30 s.
  3. Encontrar os grânulos fluorescentes com iluminação epi-fluorescente para a ocular ou na tela do computador, em seguida, ativar um canal TIRF e definir o ângulo de iluminação para um valor que indica a iluminação TIRF. Ativar o foco automático pressionando o botão no painel do microscópio e ajustar o foco com a roda de deslocamento. Adquirir um conjunto de dados 2-cor, ou seja, TIRF-488 e TIRF-561, para registro de imagem baseada em grânulo subsequentes (ver ponto 3.1).
    1. Opcional: Para garantir iluminação TIRF, adicione alguns microlitros de suspensão de grânulos multicolor fluorescente livremente flutuante (ver ponto 1.3.2.). Ativar a exibição ao vivo de um canal de TIRF e aumentar o ângulo de iluminação. Os grânulos não-aderente desaparecerá para além do ângulo crítico, garantindo uma correta TIRF iluminação8.
  4. Misturar a suspensão celular novamente invertendo o tubo fechado-2 - 3 vezes e aplicar 1 mL das células para o prato de imagem.
  5. Rapidamente encontre células transfectadas-duplo com baixa iluminação nível de epi-fluorescente. Centralize as células na visualização de câmera ao vivo usando a iluminação de campo claro e marque a posição. Encontrar mais 1-2 pontos de interesse e salvá-los para a lista de posições.
    Nota: No início, as células facilmente podem desanexar devido ao movimento de palco, portanto, definir posições de 4-5 e re-Verifique tudo antes de iniciar a aquisição de imagens. Em seguida, descarte o 1-2 posições.
  6. Inicie a aquisição de dados, clicando no botão "Sequência".

3. pós-processamento de a imagem no ImageJ

  1. A fim de gerar uma hyperstack sem registro em FIJI15, uma macro denominada "SD-TIRF_helper" foi escrita que pode ser aplicado a conjuntos de dados o timelapse de SD-TIRF canal 2-4. Salve o arquivo "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" em a FIJI sub-pasta "macros" e execute a macro clicando no comando de menu "Plugins > Macros > executar...".
    1. Se os canais de cor precisam de correção de registro, selecione a opção e criar uma nova referência de registro baseado em grânulo (arquivo de ponto de referência) ou usar um arquivo existente que foi criado antes.
      Nota: O plugin de turboreg16 será aplicada às imagens de referência de grânulos de fluorescência. Instale o plugin no software de FIJI, de acordo com as orientações gerais para as instalações do plugin.
    2. Importar os dados com o importador de bio-formatos e escolher hyperstack como uma opção de visualização. Carregar o conjunto de dados de imagem, selecione a série SD na primeira etapa e a série TIRF na segunda etapa. FIJI exibirá os dados classificados por canal e fase de posição, ou seja, normalmente todos os SD-canais e todos os canais-TIRF mostram-se como um hyperstack para todas as posições de estágio que foi seleccionada.
      Nota: Importação de dados é possível a partir de vários tipos de arquivo, por exemplo, TIFF-série ou plataforma-dependente arquivo tipos tais como * nd. O tipo de arquivo não pode ser reconhecido apenas se ele não foi exportado pelo software de aquisição como independente, menos compressão formato TIFF.
    3. Aplica a correção de registo para os respectivos canais carregando o arquivo Marcos pré-determinado.
    4. Selecione a tabela do Look-up de cor desejada (LUT) para todos os canais SD - e TIRF e mesclá-las em um hyperstack único, multi-dimensional.
      Nota: Durante o processamento dos canais TIRF, um número de aviões-z com zero valores de intensidade é adicionado no topo o plano de fundo que corresponde com o número de aviões-z no dataset SD. Este passo é importante para a visualização de hyperstack o final. Esta metodologia está correta, desde a profundidade da iluminação TIRF (menos de 200nm7) é menor que o tamanho de z-passo da pilha SD (400 nm).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para mostrar o potencial da imagem SD-TIRF, que desenvolveu um ensaio que deveria revelar a organização espaço-temporal de complexos de adesão célula-matriz e sua interação com o citoesqueleto durante a adesão celular. Portanto, aderente HeLa ou, alternativamente, NIH3T3 células foram transfectadas com YFP-vinculina e RFP-Lifeact para 18-24 h, trypsinized e semeado em pratos de fundo de vidro revestido de fibronectina. Estas linhas de célula foram escolhidas para seus pronunciado citoesqu...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste trabalho foi apresentado a primeira implementação bem sucedida da microscopia SD e TIRF em uma configuração adequada para a realização de experiências imagem de célula viva, ou seja, taxas de aquisição elevado, tais como 2 pilhas de imagem SD-TIRF por minuto 3 fase diferente posições, correspondentes a um total de 168 quadros (cerca de 3 quadros por segundo), foram adquiridas. Os microscópios de SD-TIRF alguns que eram anteriormente descrito12,13, ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos muito a comunidade científica da Universidade Medical Center Hamburg-Eppendorf nos apoiar com amostras para avaliação. Ou seja, agradecemos-Sabine Windhorst NIH3T3 células, Andrea Mordhorst para YFP-vinculina e Maren Rudolph para RFP-Lifeact.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Microscópio e acessórios
SD-TIRF microscópioVisitron Systems
Ti com sistema de foco perfeitoSuporte de microscópio invertidoNikon
CSU-W1 T2YokogawaUnidade de disco giratório em configuração de câmera dupla
iLAS2 Scanner TIRF/FRAPda Roper Scientific
Evolve Câmeras PhotometrixEM-CCD
Estágio PiezoZProdutos EletrônicosEstágio Z Motorizado
Estágio Bioprecision2 XYProdutos EletrônicosEstágio XY Estágio XY Motorizado
Câmara de incubação superior do palcoLinha ousada OkolabTemperatura, CO2 e fornecimento
de umidadeCultura de células
Células de câncer cervical HeLaDSMZACC-57
NIH3T3 fibroblastosDSMZACC-59
salina tamponada com fosfato de Dulbecco (PBS)Gibco14190144
Tripsina-EDTA 0,05%Gibco25300054
Meio de Águia Modificado de Dulbecco + GlutaMAX-I (DMEM)Gibco31966-021
OptiMEMGibco31985070Meio de soro reduzido
Soro fetal de bezerro (FCS)Gibco10500064
Penicilina/Estreptomicina (PenStrep)Gibco15140148
Meio de crescimento completo (DMEM suplementado com 10% FCS e 1% PenStrep)
TurboFectThermoFisher ScientificR0531Transfecção reagente
Ácido ascórbico (AA)SigmaA544-25G
Placa de cultura de células de 6 poçosSarstedt83.392
Pratos com fundo de vidroMatTekP35G-1.5-10-C35mm, 0,17mm lamínula de vidro
Fibronectina, plasma bovinoThermoFisher Scientific33010018
Neubauer improved chamberVWR631-0696
Contas TetraSpeckThermoFisher ScientificT7279
Plasmids
RFP-LifeactMaren Rudolph, Instituto de Microbiologia Médica, Centro Médico Universitário de Hamburgo Eppendorf, Alemanha
YFP-VinculinAndrea Mordhorst, Instituto de Microbiologia Médica, Centro Médico Universitário de Hamburgo Eppendorf, Alemanha
Software e plugins
VisiViewVisitron SystemsVersão 3
ImageJVersão 1.52c
Plug-inhttp://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/
Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm"esta publicaçãohttps://github.com/bzobiak/ImageJ
VolocityPerkinElmerVersão 6.2.2
Ludl Ludl Solução Turboreg

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780(1994).
  2. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
  3. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
  4. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  5. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  6. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
  7. Zobiak, B., Failla, A. V. Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane. Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).
  8. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).
  9. Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy. Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).
  10. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  11. Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).
  12. Trache, A., Lim, S. -M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024(2009).
  13. Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
  14. Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  17. Partridge, M. A. Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading. Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).
  18. Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. G., Sheetz, M. P. Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
  19. Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. Actin and α-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner. Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).
  20. Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions. Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).
  21. Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
  22. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).
  23. Chen, B. -C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
  24. Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).
  25. Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Spinning Disk MicroscopyTIRF MicroscopyLive Cell ImagingAdhesion FormationCytoskeletal NetworkFluorescent ProteinsImage RegistrationMicroscope CalibrationSample PreparationMulti Color Imaging

Artigos relacionados