Células B de zona marginal (MZBs) respondem à força de cisalhamento do fluxo por reorientar seu caminho de migração o fluxo. Este protocolo mostra como gravar e analisar a migração usando uma unidade de fluidics, bomba, sistema de imagem de microscópio e software livre.
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Artigo de método
Análise de cisalhamento induzida pelo fluxo de migração de murino Marginal Zone B células In Vitro
Neste artigo
Resumo
Resumo
Células B de zona marginal (MZBs) são uma população de células B que residem nas zonas marginal esplênica rato que envolvem os folículos. Para alcançar os folículos, MZBs deve migrar da força de cisalhamento do fluxo de sangue. Apresentamos aqui um método para analisar essa migração de MZB fluxo induzido in vitro. Primeiro, MZBs são isolados do baço de rato. Em segundo lugar, MZBs são liquidadas no integrina ligands em slides de câmara de fluxo, expostos ao fluxo de cisalhamento e fotografadas sob um microscópio durante a migração. Em terceiro lugar, imagens de MZBs a migração são processadas usando a célula automática MTrack2 plugin de rastreamento para ImageJ, e as faixas de célula resultante são quantificadas utilizando a ferramenta de quimiotaxia Ibidi. Os dados de migração revelam quão rápido as células mover, quantas vezes eles mudam de direção, se o vetor de fluxo de distorção afeta sua direção de migração e quais integrina ligantes estão envolvidos. Embora nós usamos MZBs, o método pode ser facilmente adaptado para a análise de migração de qualquer leucócito que responde à força de cisalhamento do fluxo.
Introdução
Células do sistema imune são as células mais motile no organismo humano e muitas vezes têm que lidar com a força de cisalhamento do fluxo de sangue e da linfa. No entanto, existem relativamente poucos estudos sobre a migração induzida por força de cisalhamento de leucócitos1,2,3,4,5. Apresentamos aqui um protocolo confiável e quantitativo para analisar a resposta de uma célula imune ao fluxo in vitro. Realizar o ensaio não exige a fabricação de componentes, e todos os equipamentos e bens de consumo estão di....
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Protocolo
Todos os experimentos envolvendo o uso de animais foram previamente aprovados pelo Landesverwaltungsamt Halle (Saxónia-Anhalt), Alemanha, em conformidade com todas as orientações da faculdade de medicina da Universidade OVGU de Magdeburg.
1. MZB célula purificação
-
Isole os leucócitos.
- Sacrificar um 8 a 16 semanas de mouse e remover o baço16. Dissociar o baço em 5 mL de tampão de cela gelada [tampão fosfato salino (PBS) + 0,5% albumina de soro bovino livre de ácidos gordos (BSA)], usando um Dissociador de tecido ou suavemente esmagou o baço através de uma malha de filtro célula 70....
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Resultados
Usamos o protocolo descrito acima, para comparar a migração de MZBs em slides de ICAM-1-revestido sem fluxo (0 dyn/cm2) e exposto para distorcer o fluxo (4 dyn/cm2). As células foram rastreadas automaticamente com MTrack2 e a faixa resultante arquivos foram sobrepostos sobre os filmes de migração celular de nenhum fluxo (0 dyn/cm2) e (4 dyn/cm2) para mostrar a distribuição e a forma das faixas (Figura 4A). Faixas de.......
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Discussão
Descrevemos aqui um método para analisar a migração de células que a força de cisalhamento do fluxo de detectar e responder, alterando sua migração. Uma análise de MZBs mostrou que MZBs migrar espontaneamente no ICAM-1 e na presença de fluxo, migrará o fluxo. No nosso trabalho anterior, mostramos que MZBs não migrar o fluxo na VCAM-1, mas em vez disso, permanecem fixos no lugar. A zona marginal esplênica murino contém principalmente a ICAM-1, enquanto a polpa vermelha contém ICAM-1 e VCAM-1. A partir desses dados, pode d.......
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Divulgações
Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por concessões do "Deutsche Forschungsgemeinschaft" SFB 854/TP11 para K.-D.F.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Filtro de Células VWR, 70 µ m | VWR | 10199-656 | |
| Filtros de pré-separação, 30 µ m | Miltenyi | 130-095-823 | |
| Kit de isolamento de células MZB e FOB | Miltenyi | 130-100-366 | |
| B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC | Biolegend | 103206 | |
| CD21 / CD 35, clone 7G6, APC | BD Biosciences | 558658 | |
| CD23, clone B3B4, PE | Biolegend | 101608 | |
| HBSS | Biochrom | L2035 | |
| D-PBS 1x | Gibco da Life Technologies | 14190-094 | |
| BSA albumina fração V, livre de ácidos graxos | Roth | "0052.3" | |
| ICAM-1 | R& D Systems | 796-IC-050 | |
| Ibidi µ-slides VI 0.4, hidrofóbico, não revestido | Ibidi | 80601 | |
| Conjunto de perfusão, branco, 50 cm, 0.8 mm | Ibidi | 10963 | |
| Ibidi Sistema de bomba | Ibidi | 10902 |
Referências
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
- Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A.
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Reimpressões e permissões
