Usando um patógeno bacteriano para sonda para celular e organísmica-nível Host respostas

Resumo

Descrevemos dois ensaios in vitro e in vivo de infecção que podem ser usados para analisar as atividades dos fatores do hospedeiro-codificação.

Resumo

Há uma variedade de estratégias de patógenos bacterianos empregam para sobreviver e proliferar uma vez dentro da célula eucariótica. Os chamados 'citosólico' patógenos (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensise Rickettsia spp.) ter acesso para o citoplasma da célula infectada pelo fisicamente e enzimaticamente degradante a membrana vacuolar primária. Uma vez no citosol, estes patógenos proliferam tanto geram forças mecânicas suficientes para penetrar a membrana plasmática da célula hospedeira para infectar novas células. Aqui, nós mostramos como essa etapa terminal do ciclo celular de infecção de L. monocytogenes (Lm) pode ser quantificada por citometria de fluxo e ensaios de unidade formadoras e dar exemplos de como ambos impacto de fatores patógeno e hospedeiro codificado - isto processo. Também mostramos uma estreita correspondência de Lm dinâmica de infecção das células cultivadas infectados in vitro e os de células hepáticas, derivadas de ratos infectados in vivo. Estes ensaios baseados em função são relativamente simples e podem ser facilmente ampliados para telas de alta produtividade baseada na descoberta de moduladores da função da célula eucariótica.

Introdução

Infecção com base em modelos experimentais são inerentemente desafiadoras devido a sua dependência sobre as condições de estado inicial do hospedeiro e patógeno, as várias estratégias de infecção do patógeno e a dificuldade de atribuir o patógeno e hospedeiro-orientado a processos com base em resultados. A bactéria Listeria monocytogenes (Lm) tornou-se um patógeno ideal para sondar as respostas de defesa do hospedeiro por causa de sua rastreabilidade genética e microbiológica, sua estratégia de infecção celular rápida e processive e relativamente clara relação entre seus fenótipos de infecção celular e organísmica-nível. A infecção celular de Lm procede por quatro fases distintas¹: (i) invasão celular que conclui com Lm sendo colocadas dentro de um vacúolo; (ii) Lm-dirigido a dissolução da membrana do vacúolo e libertação de Lm no citosol; (iii) intracytosolic replicação; e (iv) penetração física da membrana plasmática que resulta na infecção de células diretamente adjacentes (tais como uma folha epitelial) ou, em celas solitárias, lançamento do Lm para o meio extracelular. Cada uma destas fases são promovidos pelo específico Lm-codificado fatores (referidos como 'fatores de virulência') que, quando eliminado, causar defeitos de infecção em modelos celulares e animais. Esta estratégia de infecção geral tem sido evoluiu de modo independente por vários dos chamados patógenos 'citosólica'².

Formadoras de Colônia (UFC) de unidade ensaios são amplamente empregados para avaliar ambos in vitro (ou seja, celulares), bem como in vivo (ou seja, organísmica) resultados de infecção. Além de sua alta sensibilidade, particularmente para infecções em vivo, CFU ensaios fornecem uma leitura ambígua para invasão do patógeno e sobrevivência/proliferação intracelular. CFU ensaios têm sido utilizados extensivamente para analisar os determinantes de célula Lm e o anfitrião que impactam a infecção. Tão informativa como estes estudos prévios foram analisar a invasão celular e replicação de intracytosolic, ensaios de UFC não, o melhor de nosso conhecimento, foram utilizados para acompanhar a quarta fase do processo de infecção de Lm : fuga de celular. Aqui, descrevemos relativamente simples meios de evacuação como celular (doravante referida como 'emergência') podem ser monitorados por meio de ensaio CFU (bem como por citometria de fluxo) e mostrar exemplos de como os dois fatores do patógeno e hospedeiro codificado - regulam esta fase da Lm ciclo de infecção. A análise da fase terminal do ciclo celular Lm infecção pode tornar possível identificar atividades e fatores de infecção específica de célula do hospedeiro e patógeno adicional.

Protocolo

Os ratos foram tratados com humanidade em conformidade com todas as directrizes do governo apropriado para o cuidado e uso de animais de laboratório do institutos nacionais da saúde e seu uso foi aprovados para este estudo todo pelo cuidado Animal institucional Universidade de Miami e o Comitê de uso (protocolo 16-053).

1. preparar células para a infecção

1. Propagar o rato macrófago-como a linha celular 264.7 crus em meios de cultura de tecido DMEM suplementados com 10% de soro fetal bezerro (doravante referido como DMEM/FCS) usando um balão de 125 mL e uma incubadora de cultura de tecidos, mantida a 37 °C/5% CO₂.
2. O dia antes da infecção, use uma espátula de célula para remover células de balão de expansão e recolher em um tubo cônico de 15 mL tampa de rosca. Células em 800 x g durante 10 minutos de centrifugação, decante o sobrenadante e suspender o centrifugado em 1 mL de DMEM/FCS (sem antibióticos) e determinar o título usando um hemocytometer ou um contador de célula automatizada.
3. Ajustar a concentração de 2 x 10⁶ células/mL e adicionar 0,10 mL (2 x 10⁵ células) para poços de uma placa de cultura de tecido 48-bem. Certifique-se de que a suspensão de eritrócitos cobre toda a superfície do poço.
   1. Células de placa em poços adicionais para uma posterior fonte de mídia condicionadas. Também coloca 0,10 mL de DMEM/FCS em três poços adicionais para servir como um 'nenhuma célula controle'.
4. Incube durante uma noite em uma incubadora de cultura de tecidos em 37 °C/5% CO₂. No dia seguinte, não retire da incubadora até o inóculo da bactéria é preparado e pronto para uso.

2. preparação de Listeria monocytogenes (Lm) para infecção

1. Inocular a 2 mL de infusão de cérebro-coração (BHI) com uma única colônia de uma placa de ágar recém leucostictus (< 2 dias) da Lm e incubar durante uma noite a 37 ° C, com agitação em 130 rotações/min.
2. No dia seguinte, adicione 0,10 mL de cultura durante a noite para 2ml pré aquecido BHI e continuar a incubar a 37 ° C, com agitação até que a densidade óptica (OD₆₀₀) é entre 0,4 e 0,6.
3. Determine aproximada concentração bacteriana usando uma fórmula de conversão derivados empiricamente. Em nosso laboratório, uma cultura de Lm exponencialmente crescente em BHI é aproximadamente 1.3 x 10⁹ formadoras de unidades (CFU) / OD₆₀₀. Minimize a quantidade de tempo que culturas bacterianas são expostas à temperatura ambiente.
4. Apenas antes da infecção, ajuste a concentração de 5 x 10⁷ UFC/mL, usando pré-aquecido DMEM/FCS como diluente.

3. infecção

1. Trabalhar rapidamente e precisamente, adicionar 20 µ l (1 x 10⁶ UFC; multiplicidade de infecção, MOI = 5) do inóculo a Lm recém-preparado (passo 2.4 acima) para poços inclinando ligeiramente o prato e cuidadosamente, colocando a ponta da pipeta na mídia sobrejacente;
   Nota: Evite tocar as paredes do poço com a ponta da pipeta.
2. Delicadamente pipetar o conteúdo de cada poço para garantir completa a mistura; Não sacuda ou significativamente incline o prato como isso vai se espalhar por Lm as paredes do poço. Retorne o prato de cultura celular para 37 °C/5% CO₂ incubadora.
3. Prepare uma solução de gentamicina 10 µ g/mL usando mídia condicionadas de poços não infectados como diluente.
4. Em 30 minutos pós infecção (mpi), cuidadosamente Adicionar 30 µ l da solução de gentamicina (concentração final 2,5 µ g/mL) e suavemente pipetar o conteúdo do bem como antes e placa de cultura de célula retorno a 37 °C/5% CO₂ incubadora.
5. Em 60 mpi, colheita poços apropriados para ensaio CFU (60 mpi ponto de tempo) ou análise FCM (como descrito abaixo nas secções 4 e 5, respectivamente).
6. Para poços restantes, em vários momentos depois ou colher células como antes, ou, para o ensaio de surgimento de Lm , inteiramente remover mídia do poço e substituir com 150 µ l de mídia condicionada livre de gentamicina.

4. amostragem, processamento e análise de intracelular e emergente Lm por ensaio CFU

1. A colheita, incline ligeiramente o prato e remova cuidadosamente a mídia inteira do poço. Adicione a 0,50 mL de água destilada estéril (dsH₂O) para o poço. Após 30 s, transferir a água resultante lisada (10⁰) para um tubo de 1,5 mL microcentrifuga e vórtice vigorosamente por 10 s.
2. Prepare-se 10^-1 e 10^-2 diluições adicionando ou 4,5 µ l ou 50 µ l de água lisada a 450 µ l de dsH₂O e brevemente vórtice para assegurar uma mistura completa.
3. Espalhe 50 µ l de 10 a⁰, 10^-1 e/ou 10 amostras de^-2 em placas de ágar lisogenia caldo (LB).
4. Ensaio para emergentes Lm (passo 3.6 acima), remover 10 µ l da mídia sobreposição e dividi-lo em alíquotas de 2 a 5 µ l: a uma alíquota adicionar 5 µ l de DMEM/FCS e a segunda alíquota adicionar 5 µ l de DMEM/FCS contendo 5 gentamicina µ g/mL. Controle o último distingue entre extracelular Lm (gentamicina sensível) e do ensaio intracelular Lm (gentamicina resistente) no CFU subsequente.
5. Depois de 5 min à temperatura ambiente, adicione 90 µ l de dsH₂O, vortex vigorosamente durante 10 s e propagação 50 µ l em placas de ágar LB.
6. Enumerar a Lm colônias em placas de ágar LB após 2 dias de incubação a 37 ° C.

5. amostragem, processamento e análise de intracelular e emergente Lm por citometria de fluxo (FCM)

1. Prepare 264.7 pilhas conforme descrito nos passos 1.1-4. Ajustar as células a 1 x 10⁶ células/mL e adicionar 1 mL (1 x 10⁶ células) para poços de uma placa de cultura de tecido 6-poços.
2. Preparar o inóculo da bactéria, conforme descrito no passo 2.1-2.3 e infectar células com volume de inóculo, correspondente a um MOI de 50 (5 x 10⁷ UFC).
3. A infecção de post de 1,5 horas (hpi), coletar mídia do primeiro conjunto de poços e coloque em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL com 500 µ l de paraformaldeído 4% (PFA) e lugar no gelo até que todos os poços foram processados.
4. Para coletar intracelular Lm, adicione 1 mL de dsH₂O para o poço e depois de 60 s, transfira a lisado de água resultante para um tubo de microcentrifuga de 1,5 mL com 500 µ l de 4% PFA. Vórtice vigorosamente durante 10 s e lugar no gelo até que todos os poços foram processados. (Processamento de amostra é descrito na etapa 5.8 abaixo).
5. Para poços restantes, remova a mídia e substituir com 1 mL de DMEM/FCS com 5 gentamicina µ g/mL para matar extracelular Lm e devolver imediatamente as células para incubadora.
6. Depois de 30 min (2 hpi) remover mídia e substituir com DMEM/FCS sem gentamicina.
7. Após 2 e 4 h (hpi 4 e 6) tomar a segunda e a terceira vez pontos através da recolha de meios de comunicação e lisados como etapas 5.3 e 5.4.
8. Centrifugar tubos a 10.000 x g durante 7 min. remover sobrenadante sem perturbador da pelota.
9. Suspender a cada pellet de coloração, o cocktail de 50 µ l de 4% PFA e 15 µ l de faloidina. Incube os tubos no escuro a 4 ° C por 20 min.
10. Após a incubação adicione 1 mL de tampão de FACS a cada tubo e pipeta para cima e para baixo se misturam.
11. Gire os tubos a 10.000 x g durante 7 min. remover sobrenadante sem perturbador da pelota.
12. Suspender a cada pellet em 400 µ l de tampão de FACS para uso imediato, ou 200 µ l de tampão de FACS e 200 µ l de 4% PFA se armazenando para análise posterior.
13. Executar amostras em uma citometria de fluxo e analisar os dados coletados.

6. amostragem, processamento e análise de colonização Lm e respostas de Host no fígado

1. Prepare o Lm para infecção, conforme descrito no passo 2.1-2.3.
2. Calcule a quantidade necessária de subcultura para desejado título de 3 x 10⁶ UFC/mL.
3. Apenas antes da infecção, dilua a quantidade de bactérias calculadas com pré-aquecido Hank está equilibrado sal solução (HBSS) em um volume final de 1 mL. Este é o inóculo de entrada que é injetado o mouse.
4. Utilizando uma seringa de insulina 100U G½ 28, desenhar 100 µ l (3 x 10⁵ UFC) de inóculo entrado e remover quaisquer bolhas de ar visível.
5. Coloque o mouse (linhagem C57BL/6; os machos entre 6 e 12 semanas de idade) em apoio de exploração e utilizar água quente (não mais do que 45 ° C) para dilatar a veia da cauda e, em seguida, injetar o inóculo de entrada para a veia.
6. 10^-2 e 10^-3 diluições do inóculo entrada nas chapas de 10bcm LB ágar da placa e incubar durante uma noite a 37 ° C para determinar a dose de entrada real.
7. Em 18 hpi, humanamente eutanásia mouse (CO₂ asfixia seguida por deslocamento cervical) e usando o peritônio do mouse abrir corte de tesoura estéril para coletar o lóbulo frontal do fígado usando pares separados de pinças e tesouras para fora e dentro de o mouse. Coloque o fígado em um prato de Petri no gelo de 6cm.
8. Corte o fígado em cubos pequenos e coloque num frasco de vidro com uma barra de agitação magnética. Adicione 2 mL de colagenase 2 mg/mL D reconstituído em DMEM sem FCS. Incube frascos a 37 ° C em um agitador magnético para min 30−45. Uma vez que o tecido é homogeneizado, adicione 3 mL de DMEM/FCS para inactivar a colagenase.
9. Filtre as células através de um filtro de célula de 70 µm para um tubo cônico, adicionando mais DMEM/FCS, se necessário.
10. Centrifugar as células em 800 x g a 4 ° C por 10 min de Pelotas, remover o sobrenadante e suspender centrifugado em 500 µ l de tampão ACK para lisar células vermelhas do sangue.
11. Incube as células à temperatura ambiente por 5 min em buffer ACK. Suspenda as células em 1 mL de DMEM/FCS.
12. Centrifugar as células em 800 x g a 4 ° C por 10 min de Pelotas, remover o sobrenadante e suspender em 1 mL de DMEM/FCS. Em seguida, conte as células usando um hemocytometer ou um contador de célula automatizada.
13. Transferi 1 x 10⁶ células para tubo de 1,5 mL microcentrifuga e girar a bola. Então suspenda em 1 mL de dsH₂O vórtice para lisar as células. 50 µ l em placas LB no não diluído e 10^-2 diluições da placa e incubar a 37 ° C para enumerar Lm para análise do UFC.
14. Transferir 1 x 10⁶ células para tubos de FACS para cada amostra de tecido de acordo com a contagem de células e lavar com 1 mL de tampão de FACS.
15. Centrifugar as células a 800 x g a 4 ° C por 10 min de pelotas e remover o sobrenadante.
16. Prepare um coquetel de anticorpos que contém os anticorpos de interesse com base na concentração recomendada para cada anticorpo e buffer de FACS. Consulte Tabela de materiais para quantidades recomendadas utilizadas na análise.
17. Suspender o sedimento em 100 µ l de anticorpo cocktail e incubar os tubos no escuro a 4 ° C por 30 min.
18. Após a incubação, adicionar 2 mL de tampão de FACS a cada tubo e suspender as células.
19. Centrifugar as células em 800 x g a 4 ° C de pelotas e descartar o sobrenadante. Então, suspender o sedimento em 400 µ l de tampão de FACS para uso imediato, ou 200 µ l de tampão de FACS e 200 µ l de 4% PFA se guardar para mais tarde.
20. Analisar as células por citometria de fluxo (consulte a etapa 5.13).

Resultados

Avaliar o papel do patógeno e hospedeiro-codificado fatores impactando infecção celular
Usando as condições de infecção descritas acima, 0,15% da entrada do selvagem-tipo Lm é recuperado após 1,5 h de incubação co com macrófagos cultivados (Figura 1A). No subsequente 1,5 h de incubação co (3h pós infecção, hpi), houve um 4-fold aumento na recuperação de viável Lm e de 3 a 6 hpi, houve um aumento de 7.5-fo...

Discussão

Devido a seu programa de infecção celular rápida e processive, Lm é um patógeno ideal para sondar celulares atividades que impactam a infecção. Foram identificada uma série de fatores do hospedeiro que positivamente ou negativamente afetar Lm infecção celular^11,12,13,14. Dois desses hospedam fatores caracteriza-se em nosso laboratório, perforina-2 e o inibidor de Heme regulada...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
ACK Lysing	Buffer Gibco
Contas de Compensação Reativa de Amina ArC	Caldo de Infusão	A10346
BHI	da Life Technologies EMD Milipore	110493
Cell Strainer, 70 µ m	VWR	10199-656
Collagenase D	Roche	11088858001
DMEM media	Gibco	11965-092
	BD Falcon	352054
FBS - Inativado por Calor	Sigma-Aldrich	F4135-500ML
Hanks' Solução salina balanceada	Sigma-Aldrich	H6648-6X500ML
LB agar	Grow Cells MS	MBPE-4040
LIVE/DEAD Kit de coloração de células mortas amarelas fixáveis	Life Technologies	L349S9
Rodamina Faloidina	Thermo Fischer	R415
SP6800 Analisador Espectral	Sony
Seringa 28 G 1/2" 1cc	BD	329461
TPP Placas de 48 Poços	MIDSCI	TP92048
TPP Placas de 6 Poços para Cultura de Tecidos	MIDSCI	TP92406
UltraComp eBeads eBioscience		01-2222-42
Antigen
CD11b	Biolegend		Flurochrome = PE Cy5, Diluição = 1/100, Clone = M1/70
CD11c	Biolegend		Flurochrome = AF 647, Diluição = 1/100, Clone = N418
CD45	Biolegend		Flurochrome = APC Cy7, Diluição = 1/100, Clone = 30-F11
F4/80	Biolegend		Flurochrome = PE, Diluição = 1/100, Clone = BM8
Vivo/Morto	Invitrogen		Flurocromo = AmCyN, Diluição = 1/100
Ly6C	Biolegend		Flurocromo = PacBlue, Diluição = 1/200, Clone = HK1.4
MHC II	Biolegend		Flurocromo = AF 700, Diluição = 1/200, Clone = M5/114.15.2
NK 1.1	Biolegend		Flurocromo = BV 605, Diluição = 1/100, Clone = PK136