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Indução de Intestinal enxerto versus doença-- host e sua avaliação endoscópica-Mini em ratos ao vivo

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DOI:

10.3791/58871

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11 de fevereiro de 2019

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1Department of Internal Medicine 1, University Erlangen-Nürnberg, University Hospital Erlangen, 2Institute of Pathology, Department of Nephropathology, University Hospital Erlangen, 3Deutsches Zentrum Immuntherapie (DZI), University Hospital Erlangen

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo que descreve o transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico e permite repetitivas avaliações miniendoscópica do cólon distal in situ para a presença, as características e gravidade da inflamação do cólon dentro ao vivo ratos sofrem intestinal enxerto versus doença-- host.

Resumo

Aguda enxerto doença contra o hospedeiro (GvHD) representa a complicação mais grave que pacientes submetidos anteriormente a cara (allo-HCT) de transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico e frequentemente está associada com um resultado clínico ruim. Quando, por exemplo, GvHD manifestações da pele são geralmente responsivos às terapias imune-supressora estabelecidas e, portanto, não vai levar um curso fatal, a presença e a intensidade da GvHD intestinal, especialmente das partes meados-de-inferior do intestino, influenciar fortemente o resultado e geral sobrevida de pacientes com aguda DECH. opções terapêuticas são essencialmente limitados aos agentes imune-supressora clássicos rendendo apenas moderados efeitos atenuantes a doença. Portanto, conhecimento detalhado sobre a cascata imune do tecido-residente, alterações na microbiota intestinal, e a resposta do estroma anterior, em cima e depois do aparecimento de GvHD intestinal são urgentemente necessários para compreender os eventos e os mecanismos subjacentes a patogênese e desenvolver opções terapêuticas inovadoras. Modelos murino de GvHD são frequentemente empregados para identificar e avaliar funcionalmente moléculas e vias de condução presumidamente GvHD intestinal. No entanto, meios especificamente monitorar e avaliar a inflamação intestinal ao longo do tempo são essencialmente falta desde que escores estabelecidos para avaliar e corrigir GvHD aguda rotineiramente são compostos de vários parâmetros que melhor reflectem GvHD sistêmica manifestações. A avaliação detalhada da GvHD intestinal foi restringida aos estudos usando ratos sacrificados, excluindo, assim, essencialmente longitudinal (i.e., cinética) análises do compartimento do cólon sob uma determinada condição experimental (por exemplo, anticorpo mediada bloqueio de uma citocina proinflammatory) em camundongos ao vivo (i.e., na vivo). A avaliação in situ miniendoscópica do cólon distal dos ratos allo-HCT-tratada aqui descrito permite um) uma detalhada avaliação macroscópica dos diferentes aspectos da inflamação intestinal e b) a opção para coletar amostras de tecido para análises a jusante no vários pontos de tempo ao longo do período de observação. Em geral, a abordagem endoscópica-mini fornece um grande avanço na monitorização não invasiva pré-clínica e avaliação de GvHD intestinal.

Introdução

Malignidades hematopoiéticas directamente decorrentes do compartimento de células-tronco hematopoiéticas e descontrolada, progredindo rapidamente e distúrbios graves de imune-mediada são frequentemente indicações para executar allo-HCT1,2. No entanto, apesar de contabilidade para a ocorrência da resposta enxerto-versus-tumor prognóstica benéfica, linfócitos do doador são frequentemente induzindo e promovendo um ataque imune-mediada indesejado de componentes de tecido saudável dentro do destinatário allo-HCT , um processo que é chamado de doença do enxerto - versus - hospedeiro3. Manifestações no intestino, o so-called GvHD intestinal, representam a mais temida complicação da DECH aguda, formas graves de que são rotineiramente associadas com uma elevada taxa de mortalidade1,2,4.

Modelos globais, murino de allo-HCT têm emergido como inestimáveis ferramentas para identificar e estudar mecanismos imune-mediada subjacentes a patogênese da GvHD5. No entanto, avaliação cinética de, por exemplo, efeitos benéficos do romance intervenções terapêuticas ao longo do tempo em ratos vivos rotineiramente baseia a determinação da GvHD clínico pontuações6. Enquanto essas pontuações são adequadas para refletir, por exemplo, a carga doença global (ou seja, a DECH sistêmica), clínica marca falta a sensibilidade para espelhar confiantemente manifestações específicas do órgão (por exemplo,, no intestino). Portanto, as conclusões, por exemplo no que diz respeito a efeitos de intestino-protetor de uma determinada intervenção terapêutica, que se baseiam estes sistemas de pontuação, geralmente deixam a desejar.

Apesar dos grandes avanços através da invenção de novela todo o corpo de imagem modalidades em combinação com o uso de qualquer rato genética bioluminescentes ou fluorescente modelos7,8, metodologias para diretamente e especificamente avaliar o intestinal manifestação da DECH em ratos vivos estão faltando. Portanto, a lógica por trás do protocolo da avaliação endoscópica do fenótipo intestinal GvHD descrito na próxima seção é para ultrapassar este obstáculo. Além disso, a motivação também é reduzir o número de ratos experimentais desde que, até agora, uma avaliação detalhada das características morfológicas, celulares e moleculares (por exemplo,, por histopatologia ou biologia molecular) de GvHD intestinal manifestação em última análise, é exigido o sacrifício do mouse experimental.

Nossa instituição tem relatado anteriormente na metodologia de uma miniendoscópica avaliação das manifestações do cólon, no curso de modelos de colite syngeneic9. No protocolo apresentado aqui, nós temos refinado e adaptado a polictomia matriz de Pontuação para colite alloresponse-conduzido em camundongos ao vivo com GvHD intestinal após transplante de alloreactive linfócitos HCT e doador em uma classe de MHC eu totalmente incompatíveis configuração . Identificamos quatro parâmetros adequados para refletir intestinais lesões do cólon DECH-relacionados. Além disso, nós estabelecemos um sistema que permite uma classificação aperfeiçoá-lo de qualquer determinante único, resultando em uma nova partitura que prontamente informa o leitor sobre a gravidade da GvHD intestinal presente em um determinado do mouse em um ponto determinado do tempo. Análises histopatológicas confirmaram que um escore endoscópico acima de um determinado limiar confiantemente está prevendo a inflamação do tecido de grau moderado a alto. Portanto, avaliação endoscópica-mini parece representar um substituto do trabalho para a Histopatologia do padrão-ouro que rotineiramente exige o sacrifício dos ratos experimentais. Importante, este protocolo pode ser aplicado em praticamente qualquer ponto de tempo determinado e pode ser usado várias vezes durante o curso da doença10,11. Além disso, em contraste com o uso de abordagens de bioluminescência-dependente, não do trabalho intenso e demoradas como intercrossing geneticamente modificados ratos são necessárias medidas e, portanto, a metodologia pode ser aplicada em praticamente qualquer linha de rato de interesse.

Tomados em conjunto, do ponto de vista clínico prejudicial de allo-HCT os pacientes com DECH intestinal grave, rápidos progressos científicos e mais insight sobre os mecanismos moleculares subjacentes a patogênese imunológica são urgentemente necessários. Da mesma forma, considerações importantes, éticas exigem que o ganho de conhecimento deve ser alcançado com o uso do número mínimo de ratos experimentais. Portanto, ambos reconhecidos créditos sobre a comunidade de pesquisa explorando GvHD intestinal podem ser avançados implementando seriais avaliações miniendoscópica do cólon na cadeia de trabalho experimental para monitorar e grau GvHD intestinal no rato experimental ao vivo modelos, como descrito e validados no protocolo aqui apresentado.

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Protocolo

Os métodos experimentais descritos aqui foram aprovados pelo governo de Mittelfranken, estado de Baviera, Alemanha.

1. DECH indução

  1. Dia 0: Irradiação de corpo Total dos ratos destinatários
    1. Usar o feminino CD45.2+ H2kd+ BALB/c ratos que são pelo menos 10 semanas de idade como destinatários.
    2. Pesar e registar o peso dos ratos destinatários antes da indução da DECH.
      Nota: Certifique-se de que o destinatário tem um peso mínimo de 20 g. O peso inicial do corpo irá servir como valor de referência para calcular a perda de peso do mouse individual sobre o curso da indução de GvHD e progressão.
    3. Coloque até cinco ratos no recipiente do irradiador de raios-x.
    4. Irradiar os ratos por irradiação total do corpo com uma dose única de 8 Gy de raios-x. Use o Cs137 como uma fonte de radiação.
  2. Dia 1: Reconstituição dos ratos irradiados com medula T-celular-esgotada
    NOTA:O transplante de células de medula óssea alogênico, como descrito e detalhado ao abrigo da secção 1.2, deverá ter lugar no prazo de 24 h após a irradiação. Executar os procedimentos descritos abaixo em cultura de tecido estéril capa e usar reagentes filtrados. Uso alogênico CD45.1/Ly5.1 B6. SJL-Ptprca Pepcb/ BoyCrl ratos como doadores de medula T-celular-esgotada.
    1. Eutanásia em CD45.1/Ly5.1 B6. Ratos SJL que vão doar células de medula óssea alogênico em conformidade com as orientações institucionais, 12-24 h após a irradiação dos camundongos BALB/c destinatários. Por isso, anestesia o CD45.1/Ly5.1 B6. Ratos SJL com inalação de 5% de isoflurano. Continuar com a exposição de isoflurano mais 1 min após a detenção de respiração e confirmar a eutanásia por deslocamento cervical.
    2. Desinfecte o pelo e a pele do rato completamente com etanol a 70%.
    3. Posição do mouse para um limpo trabalhando bainha para que o mouse está em posição, com seus traseiros enfrentando o experimentador. Levante a pele no calcanhar de Aquiles com a ponta de uma pinça Semken com um comprimento de 13 cm e dicas curvas serrilhadas. Faça uma incisão na pele entre a pinça e o calcanhar com uma tesoura bem temperado 8,5 cm, com pontas retas.
    4. Alongar a incisão cranialmente (ou seja, desde o calcanhar sobre a perna e coxa para a região do quadril). Retire a pele e o pelo do membro posterior com a ajuda da pinça.
    5. Execute o mesmo procedimento no outro membro hind.
    6. Remova os membros traseiros cortando através das ancas adjacentes.
    7. Corte as patas traseiras. Corte através da articulação do joelho. Armazene a coxa e a haste de cada membro posterior junto em um prato de Petri de 92mm preenchido com tampão fosfato (PBS) fisiológico no gelo.
    8. Limpe cuidadosamente os ossos fêmur e tíbia removendo tanto tecido muscular quanto possível de cada coxa e perna. Transfira os ossos do fêmur e da tíbia para um tubo de 50 mL, preenchido com estéril meio RPMI 1640 e coloque-o em gelo molhado até os ossos tíbia e fêmur coletados na etapa 1.2.7 são limpas de tecido muscular.
    9. Para isolar a medula óssea, transferi um osso fêmur ou tíbia por vez (que foi limpa como descrito no passo 1.2.8) do tubo de 50 mL para um prato de Petri (com um diâmetro de 92 mm) preenchido com meio RPMI 1640. Corte as extremidades do fêmur ou da tíbia com um bisturi para ter acesso à cavidade do osso que contém a medula óssea.
    10. Prepare um tubo de coleta de 50 mL com 5 mL de meio RPMI 1640. Inserir uma agulha 26G anexada a uma seringa de 1 mL, preenchida com 1 mL de meio RPMI 1640 na cavidade óssea e irrigue a medula óssea da cavidade dentro do tubo de coleta, empurrando o êmbolo.
    11. Repita a etapa 1.2.10 até o osso aparece leve e brilhante (i.e., a cavidade óssea é visivelmente desprovida de avermelhada da medula óssea). Descarte o osso vazio.
    12. Repita as etapas 1.2.9 - 1.2.11, usando todos os ossos fêmur e tíbia da etapa 1.2.8 e coletar todas as peças recuperadas de medula óssea no tubo da mesma coleção de 50 mL de passo 1.2.10. Mantenha o tubo de coleta no gelo molhado até os ossos da etapa 1.2.8 foram processados em conformidade.
    13. Crie uma única célula suspensão pipetando suavemente as peças corada, friável da medula óssea para cima e para baixo. Filtre a suspensão de célula única de medula óssea através de um filtro de celular tela de malha 40 µm colocado em um novo tubo de coleta de 50 mL.
    14. Centrifugar o tubo de coleta de 50 mL contendo a suspensão de célula única medula óssea 450 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
    15. Resuspenda o pellet em 5 mL de ACK lise buffer (EDTA 1 mM Na210mm KHCO3144mm NH4Cl; pH 7.2) para lise de células vermelhas do sangue. Incube a suspensão de eritrócitos para 3 min à temperatura ambiente. Depois, imediatamente Adicione 10 mL de solução de PBS para a suspensão de eritrócitos.
    16. Centrifugar a suspensão de 450 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 2 mL de solução de PBS.
    17. Conte as células de medula óssea, usando um hemocytometer. Preservar uma alíquota de 6 x 106 células para análise de citometria de fluxo verificar a pureza das células após a purificação celular (consulte a etapa 1.2.20).
    18. Para o esgotamento das células T da suspensão de célula única de medula óssea, use um kit de purificação de célula comercialmente disponível. Magneticamente empobrecem células CD90.2+ (ou seja, linfócitos) das células total da medula óssea, seguindo o protocolo do fabricante.
    19. Conte as células de medula T-celular-esgotada que têm sido isoladas, conforme descrito na etapa 1.2.18, usando um hemocytometer. Preserve uma alíquota de 1 x 106 células para análise de citometria de fluxo a ser executada, conforme descrito na etapa 1.2.20.
      Nota: O rendimento na média célula derivado de rato de um doador é geralmente de 2 x 107 3.4 x 107 células de medula T-celular-esgotada.
    20. Confirme uma sucesso depleção de células T por citometria de fluxo. Mancha de 1 x 106 células, preservadas da escadaria 1.2.17 (células da medula óssea antes de separação magnética celular) e 1.2.19 (T-celular-esgotada células da medula óssea após a separação magnética celular), com os seguintes anticorpos: α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), α-CD4 ( Gk1.5) e α-CD8α (53-6,7). Use as células restantes da etapa 1.2.17 como um controle imaculado e para controles single-mancha, para configurar o citômetro de fluxo.
      1. Transferi 1 x 106 células de cada amostra para um poço de uma placa de 96 poços, com um baixo V para executar o fluxo cytometric mancham o procedimento.
      2. Gire para baixo as células dentro da placa de 96 poços (etapa 1.2.20.1) a 450 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 100 µ l de tampão de FACS (PBS, complementada com 3% filtrado soro bovino).
      3. Centrifugar as células dentro da placa de 96 poços a 450 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
      4. Adicione uma quantidade apropriada do anticorpo de escolha (compare com passo 1.2.20) para as amostras para a única mancha em 100 µ l de tampão de FACS.
      5. Prepare uma mistura de todos os anticorpos (mistura de mestre), contendo as quantidades apropriadas suficientes para manchar separadamente as alíquotas de células de medula óssea preservadas do prior (consulte a etapa 1.2.17) e depois (consulte a etapa 1.2.19) magnética depleção de células T. Adicione 100 µ l do mix mestre para ambas as alíquotas.
      6. Adicione apenas 100 µ l de tampão de FACS à amostra imaculada.
      7. Incube as células dentro da placa de 96 poços por 20 min a 4 ° C, no escuro.
      8. Adicione 100 µ l de tampão de FACS e centrifugar as células dentro da placa de 96 poços a 450 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 100 µ l de tampão de FACS.
      9. Centrifugar as células a 450 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 250 µ l de tampão de FACS.
      10. Transferir as amostras para um tubo de fundo redondo de poliestireno 5 mL e analisá-los com um instrumento de citômetro de fluxo que é capaz de detectar as moléculas fluorescentes que foram usadas para rotular os anticorpos utilizados para caracterizar as amostras de células (consulte a etapa 1.2.20).
      11. Compare a composição celular de antes e após a separação magnética celular.
        Nota: Uma pureza de aproximadamente 95% CD45.1+CD3– (i.e., T-celular-esgotada da medula óssea) células dentro do portão ao vivo geralmente é alcançado.
    21. Lave as suspensões de célula da medula óssea de T-celular-esgotada 2 x com solução de PBS (450 x g por 5 min a 4 ° C) e, finalmente, Ressuspender as células em solução de PBS, ajustar a concentração de células a 5 x 107 células/mL. Manter as células no gelo molhado até a injeção.
    22. Injete células da medula óssea de T-celular-esgotado os destinatários ratos, que foram irradiados no dia anterior (consulte a seção 1.1).
      1. Coloque o mouse experimental em uma câmara à prova de vazamento e induzir anestesia por inalação de até 4% isoflurano, até que o mouse está inconsciente. Confirmar a analgesia e perda de consciência, testando a perda do braço endireitante reflexo e a perda subsequente do pedal retirar reflexo.
      2. Injetar 5 x 106 células de célula T-empobrecido da medula óssea (ou seja, 100 µ l de 5 x 107 células/mL) contendo solução de PBS, utilizando uma seringa de 1 mL, equipada com uma agulha 30G por via intravenosa no espaço retrobulbar contendo o seio venoso.
  3. Dia 2: Transferência de células T
    Nota: Executar os procedimentos descritos abaixo em uma capa de cultura de tecido estéril e usar reagentes filtrados. Usar CD45.2 C57Bl/6 (tipo selvagem; Ratos WT) como doadores de células alloreactive T. O uso de sistemas de congenic marcador permite a distinguibilidade entre destinatário (CD45.2+ H2kd+ Balb/c ratos) e tipos de células hematopoiéticas do doador (células da medula óssea: CD45.1+ H2kb+ B6. Ratos SJL; alogênico células T: CD45.2+ H2kb+ C57/Bl6 ratos).
    1. Eutanásia em camundongos C57Bl/6 em conformidade com a aplicar as orientações institucionais e autoridades. Portanto, anestesia os ratos por inalação com uma concentração de 5% de isoflurano. Continuar a exposição de isoflurano até 1 min após a detenção de respiração e confirmar a eutanásia por deslocamento cervical. Desinfecte o pelo e a pele do rato completamente com etanol a 70%.
    2. Coloque um filtro com uma tela de engranzamento 40 µm em um tubo de coleta de 50 mL. Remover o baço e coloque-a sobre o filtro.
    3. Com um êmbolo da seringa, fragmentar o baço no filtro. Lave o filtro e o êmbolo da seringa com PBS para coletar todos os splenocytes.
    4. Centrifugar as células no interior do tubo de coleta de 50 mL a 450 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
    5. Resuspenda os splenocytes em 3 mL de tampão de lise de ACK para lisar células vermelhas do sangue. Incube a suspensão de eritrócitos por 3 min. depois, adicionar 10 mL de PBS e centrifugar as células a 450 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante e ressuspender os splenocytes em PBS.
    6. Conte as células de baço, usando um hemocytometer. Desvie uma parte alíquota de 6 x 106 células para análise de citometria de fluxo, para avaliar a magnitude da purificação na etapa 1.3.9.
    7. Para uma total CD3+ células T isolamento de splenocytes total, use um kit de purificação de célula comercialmente disponível. Isole as células T esplênica, seguindo o protocolo do fabricante.
    8. Contar o CD3 esplênica+ T células isoladas como descrito no passo 1.3.7, usando um hemocytometer. Preserve uma alíquota de 1 x 106 T células para análise de citometria de fluxo.
      Nota: O rendimento em média de esplênica T células por doador rato isolado por intervalos de separação magnética celular de 1,3 x 107 a 2 x 107 células.
    9. Confirme o sucesso do isolamento de células T por citometria de fluxo. Para obter uma descrição detalhada do protocolo de coloração, conferir e siga os passos 1.2.20.1 - 1.2.20.10.
      1. Manchar a 1 x 106 splenocytes de passos 1.3.6 (antes da separação magnética celular) e 1.3.8 (após a separação magnética celular) com os seguintes anticorpos: α-CD45.2 (104), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) e α-CD8α (53-6,7).
      2. Use as células restantes da etapa 1.3.6 como um controle imaculado e para coloração única, com os respectivos anticorpos, para configurar o citômetro de fluxo.
      3. Compare a composição celular antes e após a separação magnética celular.
        Nota: Uma pureza de ≥ 95% de CD45.2+CD3+ T células dentro do portão de linfócitos ao vivo devem ser realizadas.
    10. Lavagem a T células 2x com PBS (450 x g por 5 min a 4 ° C) e, finalmente, Ressuspender as células em solução de PBS, ajustar a concentração de células de 7 x 106 células/mL. Manter as células no gelo até a injeção.
    11. Injete alloreactive, esplênica células T (veja a etapa 1.3.10) em irradiados camundongos BALB/c que receberam anteriormente CD45.1+ células de medula T-celular-esgotada (consulte a etapa 1.2.22).
      1. Induzi anestesia, colocando o mouse experimental em uma câmara à prova de vazamentos no qual ele é exposto para até 4% de isoflurano até que perde a sua consciência. Confirmar a analgesia e perda de consciência, testando a perda do braço endireitante reflexo e a perda subsequente do pedal retirar reflexo.
      2. Injetar 0,7 x 106 alloreactive CD3+ T células utilizando uma seringa de 1 mL, equipada com uma agulha 30G   (ou seja, 100 µ l de 7 x 106 células/mL) contendo solução de PBS (consulte a etapa 1.3.10), por via intravenosa para a retrobulbar espaço dos ratos, para induzir a DECH. denominar estes ratos como o grupo experimental.
      3. Injetar um grupo diferente de ratos com 100 µ l de PBS sozinho, por via intravenosa o espaço retrobulbar e denominar este grupo como o grupo de controle, posteriormente chamado "não-T-celular-transplantado (ou não) de ratos".

2. avaliação da GvHD sistêmica

Nota: Execute esse procedimento em um envolvente semi estéril em uma sala experimental licenciado e equipados para lidar com ratos vivos dentro da instalação de animais.

  1. Siga o curso clínico da DECH em camundongos individuais; especificamente, avaliar e pontuar os ratos experimentais 3 x por semana, durante a presença de sintomas clínicos de GvHD, baseado em um sistema de Pontuação descrito abaixo e adaptado de um sistema de Pontuação estabelecido anteriormente por Cook et al.6.
    1. Pesar cada rato individualmente, registar a sua massa e calcular a perda de peso de corpo determina em referência ao peso do corpo, o que foi determinado antes do início do experimento (correspondente a 100%) no dia 0 (etapa 1.1.2). Marca uma perda de peso de menos de 10% do peso inicial com grau 0, uma perda de peso entre 10% e 25% com grau 1 e uma perda de peso de mais de 25% com grau 3.
    2. Marcar o nível de atividade de cada rato, ratos discriminadores com um nível de atividade normal (escore = 0) de ratos com um nível de atividade moderadamente diminuída (escore = 1) e ratos com comportamento estacionário a menos que eles são estimulados externamente (Pontuação = 2).
    3. Marcar a textura da pele, assim, discriminar uma pele normal, brilhante e kempt (Pontuação = 0) de um pelo moderadamente babado (escore = 1) e a presença de pontos calvos (Pontuação = 2).
    4. Marcar a textura da pele, discriminar a pele normal (escore = 0) de pontos esporádicos de escamação da pele (por exemplo, a cauda e as patas) (Pontuação = 1) e dimensionamento óbvio e áreas da pele ferida (Pontuação = 2).
    5. Analise a consistência de frações de fezes secretado. Pontuação de fezes com um normal (ou seja, consistência dura) com grau 0, fezes com fezes moles e deformáveis com grau 1 e fezes sem qualquer consistência e, consequentemente, com diarreia grave com grau 2.
    6. Resumir todos os parâmetros marcados separadamente para uma máxima pontuação clínica de 12 por rato.
  2. Considerar e avaliar os critérios de cessar o experimento devido ao nível de severidade de doença atual do mouse individual, em conformidade com as diretrizes de aplicação institucionais e autorizado protocolo animal.

3. avaliação da GvHD Intestinal

  1. Pontuação das lesões DECH-relacionados por endoscopia mini da região distal do colo-rectal
    NOTA:Execute esta num ambiente semisterile em uma sala experimental licenciado e equipados para lidar com ratos vivos dentro da instalação de animais. Use um miniendoscópica workstation que é aprovado para o uso de pequenos animais.
    1. Prepare o dispositivo endoscópico, cobrindo o telescópio com (de 1,9 mm de diâmetro) e um comprimento de 10 cm com bainha o exame endoscópico. Limpar e esterilizar o endoscópio com água e etanol.
    2. Ligue o computador, a fonte de luz de xenônio ajustável e o módulo da câmera e definir o foco de uma forma que objetos perto da lente dão uma imagem clara.
    3. Conecte a bomba de ar para a bainha endoscópica. Para visualizar o fluxo de ar, mergulhe a ponta do endoscópio em um copo de vidro cheio de água. Regule o fluxo de ar ajustando a válvula entre a bomba de ar e a bainha endoscópica. Ajustá-lo para um fluxo de ar lento, constante, reflectido por alguns continuamente ascendente bolhas.
    4. Coloque um rato em uma câmara à prova de vazamentos. Induzir a anestesia por inalação de até 4% isoflurano até que o mouse está inconsciente. Confirmar a analgesia e a um estado ausente reflexos testando a perda do braço endireitante reflexo e a perda subsequente do pedal retirar reflexo.
    5. Use uma máquina adequada anestesia veterinária em conformidade com o protocolo de animais utilizado. Transferi o mouse da câmara para a área de colonoscopia. Aqui, a posição do mouse anestesiado, com seu nariz no cone do nariz (que é conectado ao instrumento de anestesia), para uma limpeza trabalhando bainha para que o mouse está em posição, enfrentando o experimentador com seus traseiros.
    6. Para manter a anestesia durante o procedimento de colonoscopia, reduza a concentração de isoflurano para aproximadamente 2%. Monitorar a respiração do rato e resposta à estimulação durante a colonoscopia e ajustar a concentração de isoflurano no vaporizador, se necessário. Cubra os olhos do rato com bálsamo para impedi-los de ficar seco.
    7. Controle a eficácia da anestesia por beliscar entre os dedos do mouse. No caso de ausência de reatividade, prossiga para a etapa 3.1.8.
    8. Levante a cauda logo acima da raiz da cauda com uma mão e insira cuidadosamente o endoscópio, posicionado no outro lado, através do ânus, no reto.
    9. Enquanto o fluxo de ar infla o lúmen colorectal, lentamente e com cuidado se movem do endoscópio para a frente na direção aboral.
    10. Coloque o endoscópio no meio do lúmen do cólon e manter esta posição a fim de minimizar o contato com a parede do cólon e evitar fazer arranhões, ferimentos relacionados com parede mais profundos (por exemplo, resultando em hemorragia), ou mesmo perfuração da parede (veja a etapa 3.1.17) . Controle este passo, permanentemente, observando o fluxo de vídeo (ou seja, sob visualização constante do compartimento do cólon).
    11. Se fezes se contraem a vista, remover o endoscópio e realizar um enema irrigando por via retal com até 2 mL de soro fisiológico, com uma pipeta Pasteur macia. Use como pouco líquido quanto possível, para evitar uma diluição involuntária de fezes e outros efeitos secundários afetando negativamente as características da superfície da mucosa e, finalmente, os resultados de pontuação.
    12. Tente posicionar regularmente o endoscópio em uma definida (ou seja,, distintas) anatômico site dentro do cólon distal para padronizar o marcador de inflamação do cólon e otimizar a comparabilidade dos resultados entre ratos e através de experimentos de pontuação.
      Nota: Normalmente, com o endoscópio rígido, uma profundidade máxima de 4 cm pode ser alcançada através da via retal. Entre 2 e 4 cm aborally, o cólon regularmente se transforma em uma prega do que não pode ser passada com o colonoscópio rígido. Use a região de cólon distal adjacente a flexão como o padrão marcando ponto.
    13. Começa a gravar o fluxo de vídeo e começam com o marcador de inflamação.
    14. Avalie a DECH relacionadas com inflamação do cólon, marcando os parâmetros explicados e descritos na tabela 1 e Figura 3.
      1. Mova o endoscópio no marcando o local suavemente e ligeiramente atrás - e para frente para avaliar os parâmetros diferentes.
      2. Avalie o parâmetro "translucidez", bem como a "consistência de fezes", posicionando o endoscópio em uma distância maior em relação à parede do cólon.
      3. Avalie os parâmetros "granularidade" e "vascularização" posicionando o endoscópio em estreita proximidade com a parede do cólon. Para esta tarefa, aplique cuidadosamente bem dosado tensão na parede do cólon com a ponta do endoscópio.
    15. Após a conclusão do processo de pontuação, pare a gravação.
      Nota: Depois disso, o videoclipe gravado pode ser usado no total ou usado para gerar imagens representativas (i.e., screenshots) dos miniendoscopicamente avaliados critérios globais, contribuindo para a inflamação do cólon.
    16. Remova cuidadosamente o endoscópio.
    17. Descontinuar a exposição de isoflurano, transferindo o mouse para uma gaiola separada na qual ele é exposto ao ar ambiente. Aquecer o mouse com uma lâmpada de luz vermelha e observar o mouse até que ele se recupera de anestésico e recobra a consciência plena.
      Nota: Devido à inflação de ar do cólon durante a endoscopia, a região abdominal do mouse pode aparecer inchado acima diretamente depois. Enquanto isso é normal e de natureza transitória, prolongadas sinais de inflação maciça e nem progressiva do abdômen e o fracasso da recuperação do mouse podem indicar uma perfuração não intencional do cólon (no caso, o rato precisa ser sacrificado imediatamente).
    18. Após a completa recuperação, posicione o mouse volta para sua gaiola respectiva.
    19. Abordagem opcional: também é possível tomar biópsias guiadas vista do tecido. Siga as etapas seguintes.
      Nota: A colonoscopia será realizada da mesma forma como descrito nos passos 3.1.1 - 3.1.18, com as seguintes modificações.
      1. Na etapa 3.1.1, use uma bainha de exame endoscópico com um canal de trabalho interno, em vez de uma bainha de exame simples sem canais de trabalho, para cobrir o telescópio. Introduza uma pinça de biopsia do canal de trabalho até sua ponta é apenas visível na frente do endoscópio na tela de vídeo porque isso em grande parte impede que a lesão não intencional para o intestino.
      2. Prossiga com as etapas 3.1.2 - 3.1.11. Introduza o endoscópio no cólon e empurre-a cuidadosamente para frente para o ponto de interesse.
      3. Emprega a ajuda de um experimentador segundo para a tarefa de tomar biópsias do tecido do cólon. Pedir o segundo experimentador para navegar a ponta da pinça biópsia à região Colônica de escolha empurrando a pinça dentro do canal de trabalho lentamente para a frente até que as garras da pinça podem ser abertas. Assista constantemente o fluxo de vídeo durante este procedimento para minimizar o risco de ferir a parede do cólon.
      4. Recupere uma amostra de tecido da parede do cólon cuidadosamente abrindo e fechando as mandíbulas da pinça de biopsia.
        Nota: Fazer isso com cautela para evitar a perfuração da parede do cólon. No caso raro de uma perfuração do cólon, imediatamente sacrifica o mouse afetado pela aplicação de medidas em conformidade com as orientações institucionais e sob a administração contínua de anestésicos.
      5. Puxe para trás e retire a pinça fechada do canal de trabalho. Remova o espécime das garras da pinça de biopsia a mergulhar e agitando cuidadosamente a pinça aberta em solução de PBS estéril. Depois, escolha as condições de armazenamento adequado para a amostra de tecido, em conformidade com as análises planejadas a jusante. Após a desinfecção com álcool 70%, a pinça pode ser reutilizada para levar mais longe a biópsias.
      6. Depois de tomar biópsias, remover o endoscópio e terminar a colonoscopia como descrito nos passos 3.1.16 - 3.1.18.
  2. Análise histopatológica
    1. Entre os dias 26 e 30 após a irradiação de raios-x, eutanásia os ratos destinatário allo-HCT em conformidade com a aplicação de autoridades e as orientações institucionais. Por isso, anestesia os ratos com inalação de 5% de isoflurano. Continuar com a exposição de isoflurano durante 1 min após a detenção de respiração e confirmar a eutanásia por deslocamento cervical. Desinfecte cuidadosamente o pelo e a pele do rato com etanol a 70%.
    2. Abrir a cavidade abdominal e remover o cólon. Transfira para um prato de Petri (com um diâmetro de 92 mm) com PBS.
    3. Encha uma ponta de dispensador de 5 mL com PBS. Com a ajuda de uma pinça Semken, com um comprimento de 13 cm e serrilhadas pontas curvadas, deslize a parte distal do cólon (cerca de 5 mm) sobre a ponta da ponta do distribuidor. Cuidadosamente, consertar o cólon com a pinça na ponta do distribuidor e irrigue o cólon com PBS pressionando para baixo o êmbolo da ponta do distribuidor para remover fezes no intestino.
    4. Corte um segmento do cólon, localizado a cerca de 5 mm do ânus, com a ajuda de um bisturi.
    5. Corrigi o espécime de intestino ressecado em 4,5% formaldeído durante a noite. Antes de incorporá-lo em parafina, coloque o tecido na posição vertical.
    6. Corte 3 µm secções de tecido do cólon parafina transversais e mancha-las com hematoxilina e eosina (HE), usando protocolos padrão de coloração.
    7. Prepare-se ele-manchado de seções transversais de amostras de tecido do cólon.
    8. Adaptado de scoring matrix relatado por Kaplan et al.12, histopatologicamente marcar a atividade inflamatória semiquantitatively, com pontuação de 0-3: sem inflamação (Pontuação = 0), leve inflamação (escore = 1), moderada inflamação (Pontuação = 2), e inflamação grave (escore = 3).
      Nota: Idealmente, empregam para esta tarefa, a perícia de uma patologista, que é experiente na avaliação de murino GvHD intestinal e cega para a natureza de experimental e de controlo.

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Resultados

O protocolo atual, descrevendo a avaliação miniendoscópica de lesões intestinais de DECH-associado do cólon distal, foi estabelecido e validado em ratos previamente submetidos a indução sistêmica de um modelo de DECH aguda grave. Neste estudo, usamos uma classe de MHC eu totalmente incompatíveis sistema modelo no qual BALB/c ratos foram letalmente irradiados, seguido pelo transplante de medula óssea alogênico de T-celular-esgotada e pela administração da DECH-induzindo alloreactive CD3 C5...

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Discussão

O protocolo descreve a metodologia de indução e miniendoscópica avaliação do fenótipo do cólon observada no decurso de GvHD intestinal. Serve o propósito maior de permitir aos cientistas estudar GvHD intestinal longitudinalmente e de forma não invasiva, ao longo de toda doença (ou seja, desde o início da manifestação do cólon e progressão até a atividade da doença máxima).

No entanto, existem alguns passos críticos e importantes limitações inerentes aos métodos de apresentado que o experimenta...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este estudo foi suportado pelo Collaborative Research centros CRC () 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634; projeto B03) (para KH) e CRC 1181 (CRC-DFG, projeto B05) (para KH), ambos financiados pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, alemão Research Foundation).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
BIOBEAM 2000 Gamma IrradiatorGamma-Service Meical GmbH
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Sigma-Aldrich Co. LLC.D8662-6x500ML
Semken Forceps (comprimento: 13 cm; pontas serrilhadas e curvas)Fine Science Tools11009-13
Tesouras Finas Endurecidas (comprimento: 8,5 cm; pontas retas; aresta de corte: 24 mm)Fine Science Tools14090-09
RPMI-1640 MediumSigma-Aldrich Co. LLC.R8758-500ML 
Agulha hipodérmica (26 G)B. Braun Melsungen AG4657683
seringa de 1 mLB. Braun Melsungen AG9166017V
Tubo de 50 mLSarstedt Ag & Co.KG62.547.254
Filtro de células com um filtro de 40 & micro; Tela de malha BDFalcon352340
Cloreto de amônio (NH4Cl)Sigma-Aldrich Co. LLC.11209ingrediente do tampão de lise ACK
Sal dissódico do ácido etilenodiaminotetracético di-hidratado (Na2EDTA)Carl Roth GmbH & Co.KG8043.2ingrediente do tampão de lise ACK
Bicarbonato de potássio (KHCO3)Merck KGaA1.048.540.500ingrediente do tampão de licitação ACK
CD90.2 MicroBeads, ratoMiltenyi Biotec GmbH130-049-101separação de células magnéticas para isolar células da medula óssea empobrecidas em células T
Kit de isolamento de células T Pan II, camundongoMiltenyi Biotec GmbH130-095-130separação de células magnéticas para isolar células T esplênicas
Alexa Fluor 700 anticorpo CD45.2 de camundongo (clone: 104; lote: B252126; RRID: AB_493731)Biolegend109822
anticorpo CD3 de camundongo Pacific Blue (clone: 17A2; lote: B227246; RRID: AB_493645)Biolegend100214
anticorpo CD4 de camundongo FITC (clone: GK1.5; lote: B225057; RRID: AB_312691)Biolegend100406
PE / Cy7 anti-mouse CD45.1 Anticorpo (clone: A20; lote: B217246; RRID: AB_1134168)Biolegend110730
APC / Cy7 anti-camundongo CD8a Anticorpo (clone: 53-6,7, lote: B247008; RRID: AB_312753)Biolegend100714
Soro bovino filtrado Pan BiotecP40-47500ingrediente do tampão FACS 
Placas de fundo em V de poliestireno de 96 poçosGreiner Bio-One651201
Tubo de fundo redondo de poliestireno (5 mL)Falcon352052
BD LSRFortessa II citômetro de fluxoBD Bioscience Co.
Seringa de insulina com interior estéril (30 G)BD324826
Oxy Vet Oxymat 3Concentrador de oxigênioEickemeyer
NarkoVetEickemeyer213062
Câmara de plexiglass Eickemeyer214620
Telescópio diretoKARL STORZ SE & Co KG64301 AAparte da configuração experimental para colonoscopia
Bainha de proteção e exameKARL STORZ SE & Co KG61029 Cparte da configuração experimental para colonoscopia
Bainha de exame com canal de trabalhoKARL STORZ SE & Co KG61029 Dparte da configuração experimental para colonoscopia
Pinça de biópsiaKARL STORZ SE & Co KG61071 ZJ Parte da configuração experimental para colonoscopia
  Fonte de luz de xenônio SCB de 175 wattsKARL STORZ SE & Co KG20132120parte da configuração experimental para colonoscopia
Cabo de luz de fibra ópticaKARL STORZ SE & Co KG495 NLparte da configuração experimental para colonoscopia
Imagem 1 S3 Cabeça de câmeraKARL STORZ SE & Co KG22220030parte da configuração experimental para colonoscopia
Imagem 1 Unidade de controle da câmera SCBKARL STORZ SE & Co KG22200020parte da configuração experimental para colonoscopia
Monitor LCDOlympusOEV181Hparte da configuração experimental para colonoscopia
Forane / IsofluranAbbVie Inc. B506
Solução de formaldeído 37 %Carl Roth GmbH & Co.KG7398.1
5.0 mL Ponta do dispensador Eppendorf AG30089456
para anestesia

Referências

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