Tecnologia de digitalização 3D Bridging microcircuitos e imagens cerebrais Macroscale em 3D Novel incorporação de protocolo de sobreposição

Resumo

Este artigo introduz um protocolo experimental utilizando tecnologia de digitalização 3D que constrói duas escalas espaciais: a escala espacial macroscópica da anatomia do cérebro inteiro imaged por RM a > 100 μm e a escala espacial microscópica de distribuições neuronais utilizando Coloração imuno-histoquímica e um sistema de arranjo multieletrodo e outros métodos (~ 10 μm).

Resumo

O cérebro humano, sendo um sistema multidimensionado, tem sinais elétricos macroscópicos, fluindo globalmente ao longo de feixes de fibras de matéria branca grossas, e picos neuronais microscópicos, propagando-se ao longo de axônios e dendritos. Ambas as escalas complementam diferentes aspectos das funções cognitivas e comportamentais humanas. No nível macroscópico, a RM tem sido a atual tecnologia de imagem padrão, na qual a menor resolução espacial, tamanho de VOXEL, é de 0,1 – 1 mm³. Também, no nível microscópico, os estudos fisiológicos precedentes estavam cientes de arquiteturas neuronal não uniforme dentro de tais voxels. Este estudo desenvolve uma maneira poderosa de incorporar com precisão dados microscópicos em um mapa macroscópico por meio da interface de pesquisa científica biológica com avanços tecnológicos na tecnologia de digitalização 3D. Desde que a tecnologia da exploração 3D tem sido usada na maior parte para a engenharia e o projeto industrial até agora, reaproveitado para a primeira vez incorporar microconnectomes no cérebro inteiro ao preservar o spiking natural em pilhas de cérebro vivas. A fim alcançar esta finalidade, primeiramente, nós construímos um protocolo da exploração para obter imagens 3D exatas dos bio-organismos vivos que desafiam inerentemente à imagem devido às superfícies húmidas e reflexivas. Em segundo, nós treinamos para manter a velocidade para impedir a degradação do tecido vivo do cérebro, que é um factor chave em reter melhores condições e em registrar uns pontos neuronal mais naturais dos neurônios ativos no tecido de cérebro. Duas imagens de superfície corticais, independentemente extraídas de dois módulos de imagem diferentes, ou seja, ressonância magnética e imagens de superfície do scanner 3D, surpreendentemente mostram um erro de distância de apenas 50 μm como valor de modo do histograma. Esta exatidão é comparável na escala à definição microscópica de distâncias intercelular; também, é estável entre diferentes camundongos individuais. Este novo protocolo, o romance 3D incorporando sobreposição (3D-NEO) protocolo, pontes macroscópicas e microscópicos níveis derivados por este protocolo integrativo e acelera novos achados científicos para estudar arquiteturas de conectividade abrangentes (ou seja, microconnectome).

Introdução

Arquiteturas multiescala não uniformes em várias organizações físicas e biológicas são comumente encontradas^1,2. O cérebro também é uma organização de rede muito não uniforme e multiescala^3,4. As várias funções cognitivas são codificadas em tais organizações da rede, prendendo mudanças temporais de testes padrões elétricos do ponto de populações neuronal em resoluções temporais do de. Historicamente, as complexas redes entre os neurônios foram estruturalmente observadas em detalhes usando as técnicas de coloração por Santiago Ramón y Cajal de mais de 1....

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de cuidados com animais da Universidade de Kyoto.

1. animais (dia 1)

1. Prepare camundongos fêmeas C57BL/6J (n = 6, com idades entre 3 − 5 semanas).
   Nota: Este protocolo é aplicável a todas as espécies de roedores.

2. ajustes de MRI (dia 1)

1. Põr o rato em uma caixa acrílica da anestesia coloc em uma esteira do calefator ajustada a 37 ° c usando um controlador da esteira do calefator.
2. Anestesiar o rato com isoflurano a 2% em fluxo aéreo através da caixa a uma vazão de 1,4 L/m....

Resultados

Foram avaliadas as distâncias entre as superfícies corticais, produzidas pela remoção do volume de RM e superfícies obtidas a partir de varreduras 3D de cérebros extraídos. Os valores de modo do histograma das distâncias são apenas 55 μm (Figura 3a). Adicionalmente, ao acumular o histograma a partir do ponto em que a distância é igual a zero, o valor acumulado atinge 90% do total de números de amostra em ~ 300 μm (Figura 3B). O h.......

Discussão

Nós desenvolvemos um protocolo novo chamado o protocolo 3D-NEO para colmatar escalas espaciais macroscópicas e microscópicas sobrepondo duas superfícies do cérebro mais exatamente do que antes. Originalmente, havia dois desafios em criar este protocolo que fêz possível a sobreposição exata de duas imagens de superfície do cérebro e de gravar atividades neuronal saudáveis dos organismos vivos. Primeiramente, era necessário limpar eficazmente a solução do corte que circunda o cérebro extraído após a extração dele do crânio.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Compressor de ar	Kimura Medical	KA-100	Preparação animal para ressonância magnética
Microscópio de fluorescência tudo-em-um	KEYENCE	BZ-X710
Caixa de anestesia	Bio Research Center	RIC-01	Preparação animal para sistema de anestesia de ressonância magnética
	ACOMA Medical Industry	NS-5000A	Preparação animal para ressonância magnética
Anti-GAD67, clone 1G10.2	Merk Millipore	MAB5406	para imunocoloração
Cálcio Chrolide	nacalai tesque	06729-55	aCSF
Cloreto de colina	nacalai tesque	08809-45	aCSF
Pinça
Eliminação bisturi	Kai	10
D-PBS (-) sem Ca e Mg, líquido (10x)	nacalai tesque		Para imunocoloração
de D(+)-Glicose	Wako	049-31165	aCSF
Gelatina	nacalai tesque	16605-42	resseccionamento
Anticorpo secundário altamente adsorvido de cabra anti-rato IgG (H+L), Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32723	Para imunocoloração
de anticorpo secundário de cabra anti-Rabbit IgG (H+L) altamente adsorvido cruzado, Alexa Fluor Plus 555	Invitrogen	A32732	Para imunocoloração
Tapete aquecedor	Bio Research Center	HM-10	Preparação animal para ressonância magnética
Controlador de tapete aquecedor	Bio Research Center	BWT-100A	Preparação animal para
sistema de aquecimento	SA Instruments	Sistema de aquecimento de pequenos animais compatível com	MRI Preparação animal para ressonância magnética
Isoflurano	AbbVie		Preparação animal para
vaporizador de isoflurano	ACOMA Medical Industry	MKIIIai	Preparação animal para cortador linear de ressonância magnética
	DOSAKA	Neo Linear Slicer MT
L (+) -Ascorbic Acid Sodium Salt	Wako	196-01252	aCSF
Magnesium Chrolide Hexahydrate	Wako	135-00165	aCSF
MaxOne Single-Well MEA	MaxWell Biosystems
Espátula
Sistema de Monitoramento	SA Instruments	Modelo 1025	Preparação de animais para ressonância magnética
Software de monitoramento SA	Instruments	PC-SAM V.5.12	Preparação de animais para ressonância magnética
Berço compatível com ressonância magnética	Bruker BioSpin	T12812	Preparação de animais para
ressonância magnética Bobina de ressonância magnética	Bruker BioSpin	T9988	para software
operação de ressonância magnética	Bruker BioSpin	ParaVision 5.1	para MRI
Neo LinearSlicer MT	D.S.K.	NLS-MT
NeuN (D4G40) XP	que sinaliza	24307	para immunostaining
Soro normal	Wako	143-06561	da cabra para immunostaining
Cloreto de potássio	163-03545	éter
Mono-p-isooctilphenyl do glicol de polietileno de WoC de Wako	12967-45	nacalai para	immunostaining
Sensor de respiração sensível à pressão	SA Instruments	RS-301	Preparação de animais para ressonância magnética
Scanner de ressonância magnética pré-clínica	Bruker BioSpin	BioSpec 70/20 USR	Para ressonância magnética
Ácido pirúvico Sal de sódio	nacalai tesque	29806-54	aCSF
SCAN em uma CAIXA	Open Technologies srl
Peneira de
garrafa	TIGERCROWN	81	Para digitalização 3D
SlowFade Gold Antifade Mountant	Invitrogen	S36937	Para imunocoloração
Cloreto de Sódio	Wako	191-01665	aCSF
Dihidrogenofosfato de Sódio	Wako	197-09705	aCSF
Hidrogenocarbonato de Sódio	Wako	191-01305	aCSF
Hidrogensulfito de Sódio	nacalai tesque	31220-15	para imunocoloração
Sonda de temperatura termistor	Instrumentos	SA RTP-101-B, PLTPC-300	Preparação animal para ressonância magnética
Barra de dente	Bruker BioSpin	T10146	Preparação animal para ressonância magnética
Agulha intravenosa alada	TERUMO	SV-23CLK	Para perfusão
1 mol/l-Tris-HCl Solução tampão	nacalai tesque	35436-01	Para imunocoloração
1 mol / l-ácido clorídrico	nacalai tesque	37314-15	Para ajuste de pH da solução
16% - Paraformaldeído Solução aquosa	Microscopia eletrônica Ciências	15710	Para imunocoloração