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Artigo de método

Avaliação das respostas do hospedeiro-patógeno e eficácia da vacina em camundongos

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DOI:

10.3791/58930

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22 de fevereiro de 2019

 ,  ,  , 
1Department of Microbial Infection & Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University

Neste artigo

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo elegante na vivo avaliação da vacina respostas imunes de eficácia e de acolhimento. Este protocolo pode ser adaptado para modelos de vacina que estudar virais, bacterianas ou parasitárias patógenos.

Resumo

As vacinas são uma maravilha deth do século 20 médica. Eles reduziram drasticamente a morbidade e a mortalidade causada por doenças infecciosas e contribuíram para um aumento marcante na expectativa de vida ao redor do globo. No entanto, determinar a eficácia da vacina continua a ser um desafio. Emergentes a evidência sugerem que a atual vacina acelular (aPV) para Bordetella pertussis (b. pertussis) induz imunidade suboptimal. Portanto, um grande desafio é projetar uma vacina de próxima geração que induz a imunidade protetora, sem os efeitos colaterais de uma vacina de células inteiras (wPV). Aqui descrevemos um protocolo que usamos para testar a eficácia de um adjuvante promissora, a novela que distorce as respostas imunes de um fenótipo Th1/Th17 protetora e promove um melhor apuramento de um desafio de b. pertussis do tracto respiratório murino. Este artigo descreve o protocolo para a imunização de rato, inoculação bacteriana, tecido colheita e análise de respostas imunes. Usando esse método, dentro de nosso modelo, nós com sucesso ter elucidado mecanismos cruciais, provocados por uma vacina pertussis acelular promissor de última geração. Esse método pode ser aplicado para qualquer modelo de doença infecciosa, a fim de determinar a eficácia da vacina.

Introdução

As vacinas representam uma das maiores conquistas da saúde pública do século XX, no entanto, nós ainda não entendemos completamente os mecanismos pelos quais vacinas bem sucedidas estimulam a imunidade protetora. A identificação de assinaturas moleculares (EG., marcadores de ativação celular, expansão dos subtipos celulares e os padrões de expressão gênica) induzido após vacinação fornece uma infinidade de informações para prever e gerando uma eficaz resposta imune. A complexidade das respostas do hospedeiro-patógeno não pode ser adequadamente replicada usando em vitro celular cultura sistemas1. Na vivo vacina modelos são projetados para avaliar concomitantemente vários tipos de células imunes dentro do host. Isso fornece uma vantagem quando caracterizando processamento de antígeno de vacina e apresentação, secreção de citocinas diferencial e expansão de células do sistema imunológico. O protocolo descrito aqui fornece um método detalhado para determinar a eficácia da vacina através da avaliação das respostas imune locais e sistêmicas e quantificação da carga de agentes patogénicos em tecidos de interesse. O exemplo fornecido aqui testa a eficácia de uma vacina experimental para o patógeno Bordetella pertussis (b. pertussis).

B. pertussis é uma bactéria Gram-negativa, que é o agente etiológico da doença respiratória tosse convulsa (coqueluche)2,3. Contato direto com indivíduos infectados (sintomáticos ou assintomáticos) leva à transmissão, colonização e doença. Apesar da vacina global significativa cobertura4, coqueluche é considerada uma doença ressurgente em muitas nações ao redor do mundo e é das principais causas de infância evitáveis mortes5,6,7, 8. em 2015, b. pertussis e coqueluche foram incluídas no Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas (NIAID) emergentes lista de patógeno/doenças infecciosas, enfatizando a necessidade de desenvolvimento de uma vacina melhor que confere vida longa imunidade protetora.

Atualmente, uma área ativa de investigação para controlar o ressurgimento da coqueluche é o desenvolvimento de uma vacina pertussis acelular de próxima geração (aPV) com uma combinação ideal de romance adjuvantes e antígenos para imitar a resposta imune eliciada a célula inteira coqueluche vacina (wPV)9. Usando o protocolo descrito, nos informou recentemente que a modificação de um atual aprovado pela FDA aPV pela adição de um adjuvante de romance, fator de colonização de Bordetella A (BcfA), resultou em uma redução mais eficiente da b. pertussis carga bacteriana de rato pulmões10,11. Esta proteção aumentada foi acompanhada pela inclinação de uma alum-induzida resposta imune de Th1/Th2 na mais protetor de perfil imune Th1/Th1710. Este protocolo é detalhada e abrangente, permitindo que o investigador para obter máximas informações por meio de avaliação simultânea de host e respostas imunes a uma variedade de agentes patogénicos.

O protocolo descrito aqui segue o calendário de vacinas representativa, mostrado na Figura 1, para garantir respostas imunes de anfitrião ideal.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais vivos foram realizados seguindo um protocolo aprovado pelo The IACUC de Universidade de estado de Ohio, em conformidade com as diretrizes IACUC. Camundongos C57Bl/6 foram usados em todas as imunizações e infecções. Ratos machos e fêmeas são usados em cada grupo de acordo com as diretrizes do NIH. O número de animais de cada grupo foi determinado pelos cálculos de energia com base nas diferenças previstas no resultado entre grupos experimentais. Por exemplo, 8 ratos por grupo irão produzir 80% de energia em α = 0,05 (2 lados) para uma amostra de 2 t- teste para detectar diferenças no resultado do interesse de 1,33 desvios padrão (SDs).

1. imunização de camundongos

  1. Preparar uma mistura de mestre vacina em um tampão fisiológico estéril como soro fisiológico ou DPS.
    Nota: O volume total da mistura deve incluir 10% mais do que necessário para a imunização de todo o grupo. Concentrações da composição da vacina são detalhadas abaixo nas etapas 1.1.1 e 1.1.2. Transporte os itens para o viveiro no gelo.
    1. Para estudos de b. pertussis , incluem os seguintes grupos de vacina: aPV e a aPV + BcfA. Além disso, use alume, antígenos de vacinas sozinhos (FHA e Prn) e ingênuo (não-imunizadas) ratos como grupos de controle.
      Nota: aPV é 1/5th a dose humana de um aPV aprovado pela FDA, que é composta de toxoide tetânico, difteria reduzida tetânico, toxoides coqueluche (PT), hemaglutinina filamentosa (FHA) e pertactin (Prn) adsorvidas a sais de alumínio. Uma dose humana de atual coqueluche aPV é 0,5 mL, portanto, 1/5th de uma dose é de 0,1 mL. Volumes para aPV + BcfA são 0,1 mL da aPV (1/5th a dose humana) + 0,046 mL de BcfA (30 µ g) por rato. O volume máximo que pode com segurança ser entregue a um músculo é de 0,1 mL. Porque o aPV + BcfA volume de vacina é superior a 0,1 mL, a vacina deve ser entregue em ambos os ombros, divididos em partes iguais, mais ou menos para ser administrada com segurança.
    2. Para preparar uma vacina experimental, para uma dose combine 1 µ g de FHA e 0,5 µ g do Prn com 50 µ g de gel de hidróxido de alumínio em PBS estéril. Permitir que a aPV experimental a mistura em um rolo de laboratório durante 15 minutos à temperatura ambiente (RT). Em seguida, girar o tubo a 18.000 x g por 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender o conteúdo em 1 mL de PBS estéril.
  2. O viveiro, defina a máquina de anestesia (Figura 2).
    Nota: Certifique-se existem níveis adequados de oxigênio e isoflurano em seus respectivos tanques antes da utilização. Pesar o cilindro ao tesouro de isoflurano e substituir quando seu peso aumenta em 50 g.
  3. Limpam-se o gabinete de segurança biológica (CSB) e coloque a câmara de indução limpo dentro do BSC. Conecte as linhas de anestesia e ao tesouro da máquina de anestesia para a câmara de indução. Abra o oxigênio tanque através do regulador para garantir o oxigênio está fluindo e defina o nível de 1,5 a 2 L/min.
  4. Coloque os ratos de idade desejada (6-12 semanas) na câmara de indução. Ligue o isoflurano para 2,5-3% para anestesiar levemente os ratos. Monitore os animais até que eles não estão se movendo na câmara e sua respiração diminuiu.
  5. Teste o nível de indução, dedo do pé-beliscar, observando para qualquer movimento reflexivo. Se não houver nenhum, então, os ratos estão prontos para injetar.
    Nota: Neste experimento, a gaiola inteira de animais foram anestesiados de uma só vez. Um pode escolher para anestesiar animais individualmente para injeção ou para injetar os animais sem anestesia. Um desses métodos é apropriado.
  6. Enquanto isso, prepare-se 1 mL seringas de insulina (28 1/2) com 0,1 mL de vacina cada. Quando os animais são totalmente induzidos, remover um animal da câmara e colocar o mouse ventralmente sobre uma almofada de toalha ou banco.
  7. Administre a vacina por via intramuscular. Com a seringa em um ângulo de 45° e com o bisel voltado para cima, insira a seringa ~ 5 mm o deltoide do mouse e injete a vacina.
    Nota: O hind trimestre/flanco pode ser utilizado como um local de injeção, em vez do deltoide.
  8. Após a injeção, manter a agulha inserida no músculo para s ~ 5-10. Uma vez que o volume é entregue, gire a seringa em 180° para que o bisel enfrenta fora para criar um selo e evitar a fuga da vacina. Em seguida, puxe lentamente a agulha fora do local da injeção.
  9. Retorne o rato da gaiola. Repita o procedimento com todos os animais no grupo designado.
  10. Desligue o isoflurano e purgar a câmara de indução com oxigênio antes de anestesiar a gaiola próxima dos ratos.
  11. Monitore os animais até que todos eles são alerta e em movimento na gaiola. Retorne a gaiola para o local de habitação.
  12. Monitor animais cada 12 h pós vacinação, acima de 48 h, para os sintomas clínicos de morbidade como revestimento áspero/despenteado, lenta marcha ou respiração ofegante. Se os sintomas persistirem, conferir com o veterinário institucional e remover os ratos do estudo, se necessário.
  13. Quatro semanas após a imunização inicial, impulsionar os ratos por anestesiar e administrar injeções intramusculares para o deltoide direito do mouse com a mesma formulação de vacina que foi dada anteriormente.
  14. Novamente, monitore o animal para quaisquer sintomas clínicas. Animais de casa um adicional de 2 semanas e então prosseguir com a infecção.

2. crescimento de cepas de b. pertussis e preparação do inóculo de infecção

  1. De estoques congelados [criopreservadas a-80 ° C em 15% de glicerol, congelado de crescimento planctônico em Stainer-Scholte (SS) mídia12], raia por b. pertussis em placas com13 agar Bordet-Gengou (BG) suplementado com 10% desfibrinado ovelha sangue e 100 estreptomicina µ g/mL (10% BG + Sm) para a seleção. Incube a placa a 37 ° C por 4 dias.
  2. Escolha ~ 8-10 colônias individuais de uma estirpe da placa e inocular 3 mL de mídia SS suplementada com 22,8 mM L-cisteína, sulfato ferroso de 3.6 mM, niacina 3,3 mM, 48,8 mM glutationa, ácido ascórbico de 227 mM, heptakis de 1 mg/mL e 100 estreptomicina µ g/mL. Cresce a cultura a 37 ° C em um tambor de cilindro em 60 rpm para 16-24 h.
  3. No dia seguinte, diluir a 1: 300, 1:120, 1:600 de cultura primária, 1: 60, 01:30 e 01:15 em 3 mL de mídia completada de SS. Incube a cultura a 37 ° C no cilindro do rolo em 60 rpm para 16-24 h.
  4. Realizar medições de densidade óptica em 600 nm (OD600) para as culturas bacterianas. Usando cubetas de espectrofotômetro, dilua as culturas 01:10 adicionando 0,1 mL das culturas líquidas de 0,9 mL de PBS estéril.
  5. Selecione uma cultura com OD600≈ 0.8-1.2. Calcule o volume necessário para obter 1 OD (Figura 3). Spin para baixo o volume em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL a 6000 x g por 5 min a 25 ° C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender células bacterianas em 1 mL de PBS estéril para obter uma densidade de 1 OD/mL [1-3 x 109 formadoras de unidades (CFU) /mL].
  6. Para preparar um inóculo de ~ 5 x 105 de 1,5 x 106 CFUs/rato em 40-50 µ l, vórtice e serialmente, diluir a solução bacteriana (da etapa 2.5) 100-fold em 1 mL de PBS estéril para alcançar ~ 1-3 x 107 CFUs/mL(Figura 4). Transporte de inóculo para o viveiro no gelo.

3. murino de infecção Intranasal modelo

  1. No viveiro, defina condições de oxigênio e anestesia conforme descrito nas etapas 1.3 e 1.4. Conforme descrito na etapa 1.5, coloque os ratos na câmara para anestesiar. Monitore os animais até a anestesia faz efeito.
  2. Quando os ratos são anestesiados, remova um animal de cada vez da câmara de indução. Pega o mouse pela nuca do tórax dorsal, por trás dos ombros e pescoço. Posicione a verticalidade do mouse para acessar o nariz.
  3. Usando uma ponta de pipeta 200 µ l, lentamente aplica 40-50 µ l de inóculo bacteriano para as narinas do mouse (20-25 µ l em cada nare). Segure o mouse até o inóculo inteiro tem sido inalado pelo animal. Se algumas das bolhas inóculo para fora, recolher as bolhas e re-instilar às narinas. Entrega uma quantidade igual de PBS estéril para um grupo de ratos como controlo negativo.
  4. Como feito em etapas 1.10-1.12, devolver os animais inoculados para sua jaula e monitorar os animais até que eles estejam alerta e em movimento. Retorna a gaiola para seu espaço de habitação original na prateleira. Lave a câmara de indução com oxigênio para remover o isoflurano residual antes de anestesiar o próximo conjunto de animais. Monitore os animais para a pós-infecção 48 h.
  5. No laboratório, diluições de série da placa do inóculo, em PBS estéril, para verificar as reais CFUs entregue aos ratos. Placa de 0,1 mL das diluições em 10% BG + pratos Sm(Figura 4). Coloque as placas na incubadora a 37 ° C e crescer para 4 dias. Contar e calcular os CFUs de inóculo entregado para o mouse (Figura 4B).

4. a colheita de tecidos animais após a infecção

  1. Prepare-se para dissecção de rato e colheita de tecidos.
    1. Esterilize todos os equipamentos (grosseira e fina tesoura, tesoura curva, pinça fina, macacos da pelota e espalhadores de triângulo) necessários para o processamento de tecidos em uma autoclave. Sele as ferramentas em malotes da esterilização. Embrulhe os vidro homogenizacao Homogeneizadores em folha e adicionar a fita de autoclave, para indicar a esterilidade.
    2. Prepare-se dias de placas de 1 ou 2 ágar antes da colheita de tecidos para garantir que as placas são solidificados antes de usar. Para b. pertussis, use 10% BG + pratos SM Label para o septo nasal, traqueia e pulmão para cada mouse com as diluições desejadas, determinados empiricamente para cada experimento.
    3. Preenchimento e rótulo tubos de diluição de UFC. Adicione 0,9 mL de PBS estéril para tubos de microcentrifuga estéril 1,5 mL com base no número de órgãos para o processo e diluições por órgão.
    4. Preenchimento e rótulo de tubos para coleta de tecido:
      1. Septo nasal e traqueia: encher um tubo de microcentrifuga estéril 1,5 mL com 0,3 mL de caseína estéril de 1% em PBS (Ca2 + e Mg2 +-livre). Loja a 4 ° C.
      2. Pulmões: adicionar 2 mL de caseína estéril de 1% em PBS para um tubo cônico estéril 15 mL e em 4 ° C. Colher os pulmões para histologia, adicionar 2 mL de formol tamponado neutro a 10% (NBF) e armazenar em RT
      3. Baço: Adicionar 3 mL de RPMI + 5% FBS para um tubo cônico de 15 mL. Loja a 4 ° C.
      4. Sangue: rótulo dois conjuntos de tubos de microcentrifuga estéril 1,5 mL, um para sangue total e outro para soro.
    5. Etanol a 70% fresco deve estar preparado para encher copos e garrafas para dissecação de spray.
  2. Todos os materiais para o viveiro em um carrinho de transporte no dia da colheita. Limpe o BSC e montar a máquina de anestesia como nos passos 1.3 e 1.4.
  3. Coloque os ratos para ser dissecado na câmara de indução e, com o fluxo de oxigênio, ligue o isoflurano para 5% e esperar até que os animais estejam inconscientes. Remover os ratos um de cada vez e cervically, deslocar o animal como um método secundário para garantir a morte. Após deslocamento cervical, eutanásia deve ser confirmada pela ausência de uma frequência respiratória e/ou ausência do reflexo de retirada (teste do beliscão do dedo do pé).
  4. Posicione o mouse, lado ventral virada para cima, a bordo de dissecação e prenda os braços e pernas abertas. Pulverizador para baixo do corpo do mouse com etanol a 70%.
  5. Usando fórceps, fecho a pele abaixo do abdômen, no centro da pelve. Usando a tesoura afiada, fazer um corte vertical até a mandíbula. Em seguida, dissecar a pele longe da parede peritoneal, empurrando as duas camadas separadas, usando pequenos movimentos com a tesoura fechada. Coloque a pele para os lados da carcaça para criar um campo desobstruído para a colheita de órgãos estéril.
  6. Segure o peritônio intacto abaixo da caixa torácica em ou em torno do fígado e abri-lo se movendo em direção a caixa torácica. Expor o trato digestivo inferior e mover os dois pontos para a esquerda, revelando o baço. Usando pinça curva, segure o baço e dissecar longe do tecido conjuntivo com uma tesoura. Lugar do baço em um tubo cônico de 15 mL contendo 3 mL de RPMI + 5% FBS e coloque o tubo no gelo.
  7. Use fórceps para estabilizar a caixa torácica no processo xifoide e abrir o diafragma. Pulmões deveriam desinflar e caem em direção a coluna. Abri a caixa torácica de ambos os lados para remover a placa do peito.
  8. Isolar e remover o lobo superior do pulmão direito14, cortando as artérias pulmonares e veias. Coloque o lóbulo em um tubo cônico de 15 mL, contendo 10% NBF e coloque o tubo no RT pelo menos 24 h para reparar o tecido. Isole os lóbulos restantes do pulmão direito e o pulmão esquerdo. Coloque os lobos em um tubo cônico de 15 mL contendo 2 mL de 1% de caseína em PBS e colocá-lo no gelo.
  9. Depois de cortar as veias pulmonares e artérias para dissecar para fora dos pulmões, permitir que a cavidade torácica encher com sangue, como o mouse exsanguinates. Usando um pipetman 1ml com ponta, coletar o sangue e transferir para o tubo de microcentrifuga pre-etiquetados 1,5 mL. Coloca o tubo no gelo.
  10. Em seguida, do pescoço, remova o tecido mole (glândulas parótidas, sublinguais e submandibulares e gânglios linfáticos) que cobre a traqueia. Abra e retire as membranas protetoras em torno da traqueia. Delicadamente, usando uma tesoura e pinça fina, separe a traqueia esôfago e qualquer outro do tecido conjuntivo da parte superior das clavículas para baixo da mandíbula.
  11. Usando fórceps, segure a traqueia e cortar a traqueia na parte superior da clavícula. Puxe-a traqueia para maximizar a elasticidade e cortar a traqueia na parte inferior da mandíbula bem acima da laringe, isolando o máximo possível (~ 1 cm). Coloque o órgão em um tubo de microcentrifuga pre-etiquetados 1,5 mL com 0,3 mL de 1% de caseína em PBS e colocá-lo no gelo.
  12. Desafixar o mouse e colocá-lo ventralmente, com o mouse, enfrentando o pesquisador para acesso claro para o nariz. Pulverizar a cabeça do rato com etanol a 70% e, usando as mãos, segure o mouse diretamente atrás do crânio.
  13. Com uma tesoura, corte a carne macia do focinho, a partir do fundo do nariz e se movendo para cima. Além disso, remova o pelo, pele e bigodes em torno do nariz. Em seguida, com pinças e tesouras curvas, introduza as pontas da tesoura nares com as curvas, apontou para o exterior e abrir a passagem nasal para os olhos, criando uma formação do tipo V.
  14. Usando a pinça fina, colete o septo nasal e tecidos moles dentro da formação criado. Coloque o tecido em um tubo de microcentrifuga pre-etiquetados 1,5 mL com 0,3 mL de 1% de caseína em PBS e colocá-lo no gelo.
  15. Elimine a carcaça em um saco de risco biológico. Antes de dissecar o próximo animal, lavar as ferramentas com água desionizada e coloque num copo cheio de etanol a 70%. Remover as ferramentas, sacuda o excesso etanol e então prosseguir com a próxima dissecação
  16. Disse cada rato seguindo passos 4.3-4.14.
  17. Processe os tecidos conforme descrito abaixo.

5. processamento de baço

  1. Para dissociar baços, coloque um filtro de célula de 70 µm em um prato de cultura de tecidos de 60 mm. Despeje o baço e meios de comunicação que acompanha o filtro, usando o êmbolo de uma seringa de 3 mL. Amasse cuidadosamente o órgão até que ele é completamente dissociado e filtrado através de filtro de célula.
  2. Lave o filtro com 3 mL de RPMI + 5% FBS para o prato de cultura de tecidos. Recolher a suspensão de eritrócitos e colocá-lo em seu tubo original de 15 mL. Centrifuga os tubos a 450 x g por 5 min a 4 ° C para as células de Pelotas.
  3. Aspirar ou decante o sobrenadante e lisar os glóbulos vermelhos por resuspending a pelota em 2 mL de tampão de potássio (ACK) cloreto de amônio (cloreto de amônio de 150 mM, 10 mM, bicarbonato de potássio, EDTA de sódio 0,1 mM). Incube durante 3 min no RT (25 ° C).
  4. Encher os tubos até 8 mL com RPMI + 5% FBS e centrifugar tubos a 450 x g por 5 min a 4° C. Aspirar ou decante o sobrenadante. Resuspenda as pelotas de célula em 5 mL de RPMI + 5% FBS e contagem os splenocytes usando um hemocytometer e um microscópio.
  5. Calcule o volume de células necessárias para estimular a 2,5 x 106 células por poço. Em uma placa de 48, as sementes das células em 0,5 mL de meios de comunicação de células T (RPMI 1640 + 10% FBS, 10 µ g/mL gentamicina e 50 µM β-Mercaptoetanol) por poço.
  6. Com base no cálculo acima, colocar o volume necessário de suspensão de células em um tubo fresco e pelota-células a 450 x g por 5 min a 4 ° C.
  7. Resuspenda o pellet no volume necessário de mídia de células T. Para um modelo de infecção de b. pertussis , testar a resposta de citocinas antígeno-específicos aos antígenos da vacina: pertactin (Prn) e adesão de hemaglutinina filamentosa (FHA). Portanto, 3 tratamentos são necessários: 1) sem estimulação (NS, como controle negativo), Prn) 2 e 3) FHA. Para o ensaio, 7,5 x 106 células em 1,5 mL de mídia de células T é necessário (2,5 x 106 células por 0,5 mL).
  8. Alíquota 0,5 mL de suspensão de célula em uma placa de 48.
  9. Para estimular as células, misture antígenos em 2 vezes a concentração desejada na mídia de células T. Concentrações finais do Prn e FHA = 1 µ g/mL e 0,5 µ g/mL, respectivamente. Portanto, misture 2 µ g/mL Prn ou 1 µ g/mL FHA em 0,5 mL. Então, alíquota 0,5 mL do meio de estimulação em cada designado, diluindo o tratamento de antígeno para 1x, em um volume final de 1 mL em cada poço.
  10. Incube as placas a 37 ° C em 5% CO2. Colete sobrenadantes no dia 7 e alíquota 0,5 mL dos sobrenadantes em tubos microcentrifuga pre-etiquetados. Armazene as amostras em um-20 ° C até que esteja pronto para testar o antígeno-específicas citocinas por ELISA (Figura 6).

6. processamento de pulmões

  1. Transferi os pulmões (em 2 mL de 1% de caseína em PBS) para um estéril, homogenizador de homogenizacao de 15 mL. Pilão de uso para homogeneizar o tecido. Dissocia até permanecem sem grandes partículas de tecido. Coloque a suspensão homogeneizada volta no tubo de 15 mL original.
  2. Remover um 0,3 mL alíquota para chapeamento CFUs e centrifugar o homogenate a 450 x g por 5 min a 4 ° C. Coletar e alíquota o sobrenadante em alíquotas de 0,5 mL em pre-etiquetada microcentrifuga tubos. Armazene as amostras em um-20 ° C até a análise de citocinas por ELISA.
  3. Prepare diluições escolhidas serialmente diluindo 0,1 mL da suspensão de pulmão homogeneizado em tubos de diluição (0,9 mL de PBS estéril). Placa de 0,1 mL das diluições empiricamente escolhidas para pre-etiquetados BG 10% + Sm placas e propagação usando propagador do triângulo estéril.
  4. Incube as placas a 37 ° C, em ar ambiente por 4 dias.
  5. Contar e calcular CFUs/pulmão (Figura 6). Brevemente, multiplica números CFU recuperados pelo factor de diluição da placa, em seguida, também pelo volume total, em que o órgão foi processado. Os cálculos do UFC então são transformados em valores de Log10 para cada animal e graficamente.
    1. Placas com colônias de 30-300 são contadas facilmente e com precisão. Placas com menos de 6 colônias não devem ser usadas para cálculos, desde que um número tão baixo de colônia apresenta erro15. Para obter um limite inferior de detecção, o volume total, em que um órgão foi homogeneizado é dividido pelo volume usado de detectar em uma placa do homogeneizado não diluído (ex., volume total de 2 mL dividido por 0,1 mL de homogeneizado não diluído é igual a do limite inferior de 20 CFUs detectáveis).

7. processamento do septo Nasal e traqueia

  1. Homogeneizar o tecido no 0,3 mL de 1% PBS/caseína com sedimento judiava Homogeneizadores motor sem fios. Homogeneizar o tecido para 0,5-1 min até que o tecido é em grande medida dissociado. Bactéria deve ser derramada em suspensão.
  2. Prepare-se 10 escolhido x diluições por diluição serial de 0,1 mL da suspensão homogeneizada em tubos de diluições contendo 0,9 mL de PBS estéril. Ponto 0,1 mL de cada diluição para pre-rotulado BG 10% + Sm placas e espalhar a suspensão usando um propagador do triângulo que foi esterilizado por uma lavagem de 70% de etanol e chama.
  3. Incube as placas a 37 ° C, em ar ambiente por 4 dias.
  4. Contar e calcular CFUs/órgão como na etapa 6.5 (Figura 6). Para obter um limite inferior de detecção, o volume total, em que um órgão foi homogeneizado é dividido pelo volume utilizado para ponto em uma placa do homogeneizado não diluído (ex., volume total de 0,3 mL dividido por 0,1 mL de iguais não diluídos o limite de 3 detecto uma CFUs ble).

8. processamento de sangue

  1. Centrifuga os tubos contendo sangue isolado a 18.000 x g durante 30 min a 4 ° C para granular células vermelhas do sangue.
  2. Com cuidado, tire o soro sobrenadante e pipetar para um tubo de microcentrifuga soro previamente rotulado. Armazenar os tubos em-20 ° C até que esteja pronto para uma análise mais aprofundada a jusante (i. e., ELISA de Ig total e específica).

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Resultados

O modelo descrito mostra um método para avaliar a eficiência de vacina e respostas imunes durante as interações patógeno-hospedeiro. A Figura 1 mostra o calendário de vacinas representante usado para imunizar e infectar camundongos e colheita de tecidos para análise. A Figura 2 demonstra a configuração do sistema de anestesia empregado para induzir os ratos, permitindo que os investigadores entregar imunizações e inóculo bacteria...

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Discussão

O protocolo completo descrito aqui para estudar a imunidade induzida pela vacina contra a infecção de b. pertussis também permitirá a avaliação das respostas de anfitrião a uma variedade de outros patógenos. O protocolo descreve os métodos para entregar imunizações, determinar a seguinte eficácia de vacina patógeno desafio e dissecação paralela da função imune. Na adaptação do protocolo a fim de estudar outros patógenos, vários parâmetros precisaria ser modificado. Estes incluem, mas não estão limitados a, o mod...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado por fundos de 1R01AI125560-01 e start-up da The Ohio State University.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Câmara de indução 2LVet Equip941444
FlurisoVet OneV1 501017qualquer marca é apropriada
Base de ágar Bordet Gengou BDbioscience248200
CaseínaSigmaC-7078
Ácidos CasaminoVWRJ851-500GFiltro Scholte (SS) componentes de mídia
Ácido L-glutâmicoProdutos de Pesquisa IntG36020-500
L-ProlinaProdutos de Pesquisa IntP50200-500
Cloreto de SódioFisherBP358-10
Fosfato de Potássio monobásicoFisherBP362-1
Cloreto de PotássioFisherP217-500
Cloreto de Magnésio hexahidratadoFisherM2670-500G
Cloreto de CálcioFisherC75-500
Base TrisFisherBP153-1
L-cisteína HClFisherBP376-100SS suplementos de mídia
Sulfato ferroso heptahidratadoSigmaF-7002
niacinaIntN20080-100
GlutationaProdutos de Pesquisa IntG22010-25
Ácido AscórbicoProdutos de Pesquisa IntA50040-500
RPMI 1640ThermoFisher Scientific11875093
FBSSigmaF2442-500mL  qualquer fonte dos EUA,
gentamicinaThermoFisher Scientific15710064
B-mercaptoetanolFisher BP176-100
15mL moedor de tecidos dounceWheaton357544qualquer marca semelhante é apropriado
Homogeneizador de Mão Sem FioKontes/Sigma Z359971-1EAqualquer marca semelhante é apropriada
Instrumentos - tesouras, tesouras curvas, fórceps, pinças finas, espalhadores dequalquer marca é apropriada
Seringas de 3mLBD bioscience309657
tubos cônicos de 15mLFisher 
tubos de microfuga de 1,5mLDenvilleC2170
70umFisher 
placas de 60 mmThermoFisher Scientific130181
placas de cultura de tecidos de 48 poçosThermoFisher Scientific08-772-1C
Seringa de insulina de 1 mL 28G1/2Fisher Scientific/Excel Int.14-841-31
Mouse IFN-gamma ELISA Ready-SET-Go! KitInvitrogen / eBioscience50-173-21
Mouse IL-17 ELISA Ready-SET-Go! KitInvitrogen / eBioscience50-173-77
Mouse IL-5 ELISA Ready-SET-Go! KitInvitrogen / eBioscience50-172-09
Produtos de pesquisa de não inativada por calor triângulo 339651 Filtros de células 22363548

Referências

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