Artigo de método

Preparação e modificação genética de primatas não humanos tronco hematopoiéticas e células progenitoras

DOI:

10.3791/58933

⸱

15 de fevereiro de 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stem Cell and Gene Therapy Program, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Medicine, University of Washington, 3Department of Pathology, University of Washington

Neste artigo

Resumo

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O objetivo do presente protocolo é isolar os primatas não-humanos CD34+ células de medula aprontada, gene-modificar estas células com vetores Lentivirus e preparar um produto para infusão no hospedeiro autólogo. O comprimento total do protocolo é aproximadamente 48 h.

Resumo

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Transplante de células (HSPC) de haste e progenitoras hematopoiético tem sido uma terapia de pedra angular para a leucemia e outros tipos de câncer há quase meio século, subjaz a única cura conhecida de infecção de vírus de imunodeficiência humana (HIV-1) e mostra a imensa promessa em o tratamento de doenças genéticas, tais como talassemia beta. O nosso grupo desenvolveu um protocolo para a terapia de gene HSPC modelo em primatas não-humanos (NHPs), permitindo que os cientistas otimizar muitos dos mesmos reagentes e técnicas que são aplicadas na clínica. Aqui, descrevemos os métodos para a purificação CD34+ HSPCs e subconjuntos de células-tronco hematopoiéticas (HSC) persistentes a longo prazo da medula óssea aprontada (BM). Técnicas idênticas podem ser empregadas para a purificação de outras fontes HSPC (por exemplo, sangue periférico mobilizado células-tronco [PBSCs]). Descrito, é um protocolo de 2 dia em que células são purificadas, culta, modificadas com lentivirus (LV) e preparadas para infusão de volta para o host autólogo. Leituras chaves de sucesso incluem a pureza do CD34+ HSPC da população, a capacidade de HSPCs purificados para formar colônias morfologicamente distintas na mídia semi-sólido e, mais importante, eficiência de modificação genética. A principal vantagem para a terapia de gene HSPC é a capacidade de fornecer uma fonte de vida longa células que dão origem a todos os tipos de células hematopoiéticas. Como tal, esses métodos têm sido usados para terapias de modelo para câncer, doenças genéticas e doenças infecciosas. Em cada caso, eficácia terapêutica é estabelecida, aumentando a função de progênie HSPC distintas, incluindo células vermelhas do sangue, as células T, células B, e/ou subconjuntos mieloides. Os métodos de isolar, modificar e preparar HSPC produtos são directamente aplicáveis e traduzíveis para várias doenças em pacientes humanos.

Introdução

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Terapia gênica de células-tronco é um meio poderoso para abordar um vasto leque de patologias humanas. Terapia de gene HSPC é uma abordagem particularmente atraente, devido à i) a relativa facilidade de coletar essas células dos pacientes, ii) a riqueza de conhecimentos disponíveis sobre fenótipos de superfície celular e ex vivo parâmetros de cultura, e, como o campo se expande, Porque iii) apresenta cientistas com uma caixa de ferramentas cada vez maior de estratégias de modificação do gene adaptados às várias doenças de interesse. Estamos investigando ativamente HSPC abordagens de terapia de gene de vários ângulos, incluindo a ciência básica da HSPC biologia, a enxertia de HSPCs gene-modificado em modelos in vivo pré-clínicos e a aplicação de populações de pacientes relevantes. Nós e os outros têm caracterizado o fenótipo de superfície celular de funcionalmente distintos HSPC subconjuntos1,2,3, a mobilização e regimes de condicionamento que maximizar o rendimento HSPC e enxertia, minimizando toxicidade de4,5e o gene modificação e edição de gene estratégias que têm sido adaptadas para uma ampla gama de maligno, genética e doenças infecciosas6,7,8, 9,10. A função e a enxertia de HSPCs gene modificado podem ser avaliados em um número de modelos de pequeno e grande-animal, incluindo ratos, cães e NHPs. Em particular, modelos de PNC são vantajosos porque muitos reagentes, por exemplo, os anticorpos específicos para as proteínas superfície celular HSPC como CD34 e CD90, podem ser usados permutavelmente em humanos e células do PNC. Além disso, em contraste com os ratos, animais de grandes porte como NHPs permitem uma maior aproximação da escala da modificação genética necessária para a eficácia clínica. Finalmente, NHPs são o padrão ouro para a modelagem de patologias humanas tais como a infecção de HIV-111 e um sistema de modelo emergente para candidato anticâncer e anti-HIV imunoterapias12,13.

O propósito do presente protocolo é delinear os métodos de purificação, modificação genética, e a preparação de produtos de infusão NHP HSPC. Embora fora do âmbito do presente protocolo, anteriormente mostramos que esses produtos engraft em hospedeiros de PNC autólogos, dão origem a todas as linhagens hematopoiéticas e fornecem eficácia terapêutica em uma ampla gama de modelos de doença1. Temos também caracterizada a clonality de HSPCs engrafting e construiu uma plataforma para rastrear a cinética, o tráfico e o fenótipo dos HSPCs individuais e seus descendentes, seguir transplante autólogo1,14. Os métodos aqui apresentados foram desenvolvidos com os seguintes objetivos: i) para isolar HSPCs altamente puros e subconjuntos HSC engrafting a longo prazo, ii) para manter o primitivos linfócitos durante ex vivo de cultura e iii) eficientemente gene-modificar qualquer granel HSPCs ou a longo prazo engrafting HSC subconjuntos. Nós empregamos magnética assistida por célula-classificação (MACS), bem como fluorescência-ativado da pilha (FACS), para isolar fenotipicamente/funcionalmente HSPC populações distintas, consistentes com os métodos de muitos grupos2,15, de classificação 16. A manutenção da primitivas linfócitos em cultura (ou seja, minimizando a diferenciação dessas células em progenitores comprometidos que dão origem a totalmente diferenciadas subconjuntos mieloides e linfoides) é um aspecto essencial do protocolo descrito aqui. Embora nós anteriormente caracterizaram abordagens para expandir HSPCs mantendo um fenótipo primitivo17,18, aqui, descrevemos um protocolo que centra-se na manutenção de linfócitos através de uma mínima (48 h) e definido ex vivo cultura.

A modificação eficiente de HSPCs e HSC subconjuntos é um objetivo central do presente protocolo. Entre várias abordagens temos relatado, dois são de longe os mais investigados em ensaios clínicos: modificação genética de LV-mediada e mediada por nuclease gene edição1,6,19. Gene-edição estratégias usam um de um número de plataformas de nuclease para modificar especificamente um gene alvo de interesse, por exemplo, o receptor do chemokine C-C tipo 5 (CCR5) para o tratamento da infecção de HIV7,19 ou Bcl11A para o tratamento de Hemoglobinopatias6. Aqui, focalizamos a modificação genética de LV-mediado, no qual cargas transgênicas semirandomly integrarem o genoma1,8,20. A principal vantagem da LV abordagens é a capacidade de entregar grandes quantidades de material genético (até 8 ou 9 kilobases). Embora o gene-edição estratégias estão sendo desenvolvidas para direcionar um transgene de interesse para integrar somente em um locus especificado por recombinação homóloga doador (HDR), esses métodos exigem mais desenvolvimento in vitro e em modelos animais pequenos. Em contraste, vetores de LV têm sido amplamente utilizados em NHPs e em pacientes21,22. Importante, o protocolo descrito aqui, que usa aprontado BM como uma fonte HSPC a partida, pode ser facilmente e amplamente adaptado, por exemplo, para isolar o PBSCs. Conforme descrito acima, podemos aproveitar o alto grau de similaridade genética entre NHPs e os seres humanos usar reagentes que são aplicáveis a ambas as espécies. Finalmente, esta abordagem tem sido adaptada para modificar outros subconjuntos hematopoiéticos, nomeadamente T células12,23,24; o advento das abordagens de imunoterapia eficazes células T tem dependia fortemente a mesma plataforma de LV utilizada neste protocolo. Esses métodos são adequados para qualquer pesquisador interessado em biologia HSPC ou modificação genética mediada por LV. Por exemplo, o protocolo de purificação HSPC apresentado aqui pode ser usado para caracterizar o romance subconjuntos HSC-enriquecido, conforme descrito anteriormente,1,15,25. Da mesma forma, a transdução de LV métodos apresentados aqui da mesma forma poderiam ser aplicada e desenvolvida para vários outros tipos de células e perguntas experimentais, tanto em modelos in vitro e in vivo.

Em resumo, apresentamos métodos para isolar e modificar geneticamente NHP HSPCs. Esses métodos podem ser facilmente adaptados para outras espécies e outras fontes de HSPCs. Este protocolo exaustivamente investigado mostra uma grande promessa na modelagem de terapias eficazes para várias doenças humanas.

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Protocolo

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Transplantes autólogos de PNC, escorva (mobilização), a coleção de células e modificação genética são conduzidas consistente com protocolos previamente publicado26. Todos os procedimentos experimentais são revistos e aprovados pelo Comitê de uso do centro de pesquisas de câncer Fred Hutchinson e a Universidade de Washington e institucional Cuidado Animal (protocolo #3235 - 01). Todos os estudos são realizados em estrita conformidade com as recomendações do guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório do National Institutes of Health ("o guia"); animais foram aleatoriamente para os estudos.

1. enriquecimento de CD34+ HSPCs e cultura durante a noite (dia -1)

  1. Colheita de BM e condicioná-lo.
    1. Mobilize NHPs com fator estimulante de colônia de granulócitos (GCSF) por 4 dias, conforme descrito anteriormente,26.
    2. Sede os animais com 100 mg/kg de ketamina e 0,03 mL/kg de dexmedetomidina (estoque de 0,5 mg/mL). Administre analgésicos (por exemplo, buprenorfina SR) no momento do sorteio.
    3. Usando a tesoura, raspar o cabelo do animal da extremidade proximal do úmero e/ou fêmur bone(s) e esfregue a pele com esfoliação à base de iodo ou uma solução anti-séptica similar, alternada com álcool e repita 3x. Como anestésico adicional, infundi o periósteo com bupivacaína (2 mg por site, estoque de 5 mg/mL).
    4. Posicione a agulha de aspiração de medula óssea (16G) sobre o local de entrada do periósteo (cavidade medular) e perfuram a pele, penetrando na cavidade medular, usando um movimento rotativo. Retire o estilete da agulha aspiração e reservá-lo em um campo estéril para utilização posterior.
      Nota: Escolher o local de entrada do periósteo da cavidade medular em uma área do osso que não está coberto por músculos e onde a paisagem/forma do osso é também visível ou pode ser sentida facilmente através da pele (normalmente em direção a extremidade proximal ou distal do osso).
    5. A agulha do BM, anexar uma seringa pré-carregada, contendo uma mistura de solução de anticoagulante citrato dextrose (ACD-A) e heparina (USP/20ml, 1 mL por 9 mL de medula a recolher).
    6. Puxe o êmbolo enquanto delicadamente balançando o membro e rodá-la, para agitar a seringa para misturar aspirado e anticoagulante. Girar a agulha e reposicioná-lo em toda a aspiração e retirada para acessar uma maior percentagem de células dentro do espaço de medula.
    7. Uma vez que a amostra é coletada, retire a agulha e aplique pressão para o site de aspiração até que o sangramento pare.
      Nota: Dependendo do volume necessário, da medula óssea de um a quatro membros (dois úmeros, dois fêmures) pode ser estabelecida durante uma única coleção. Não mais que 20 mL deverão ser recolhida a cada membro, e o volume total coletado deve constituir a não mais de 10% do peso do animal (10ml/kg).
    8. Se receber aspirados de vários membros, combinar e registrar o volume.
    9. Deixe o postanesthesia de recuperar PNC.
      1. Reverta os efeitos da dexmedetomidina com atipamezole 0,03 mL/kg (estoque de 5 mg/mL) após o procedimento. Fornece analgésicos (por exemplo, buprenorfina SR), conforme prescrito pelo corpo veterinário clínico pelo menos 48 h após o procedimento, ou mais, a critério do clínico veterinário, com base em sinais clínicos.
      2. Retorno do animal para sua gaiola para casa após o procedimento e monitorá-lo a cada 15-20 min, até que o animal é sentar-se sua própria. Monitore o animal diariamente pela equipe do veterinário até que se determine que o site de aspiração é curado. Além disso, monitore sinais de infecção, inflamação ou dor.
    10. Em paralelo ao processamento de células, condicionar o PNC mesmo com mieloablativo irradiação de corpo total (TBI): 1.020 cGy a uma taxa de 7 cGy/min. irradiação de administrar em doses fracionadas durante os 2 dias antes da infusão de células.
  2. Hemolizar BM.
    1. Divida o BM em tubos cônicos de 50 mL (10-12 mL por tubo) e adicionar hemolítica buffer para trazer o volume de 50 mL (tabela 1). Incube as células à temperatura ambiente (RT) até que eles são lisados, mas não mais de 7 min. centrifugar a 800 x g durante 5 min e aspirar o sobrenadante de pellet(s), deixando de 2 a 5 mL de volume/tubo. Resuspenda o pellet no volume residual.
      Nota: Amostras com sucesso lisadas mudam de cor, de um vermelho-escuro de uma luz vermelha transparente.
    2. Adicione 10 a 15 mL de tampão/pelota hemolítica. Remova qualquer coágulos de sangue usando 70 µm coadores de célula. Adicionar hemolítica buffer até 50 mL, incubar durante 5 min à RT e girar a 800 x g por 5 min.
    3. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 10 mL de tampão de MACS (tabela 1). Filtrar novamente através de um filtro de célula de 70 µm. Enxague o tubo e o filtro com 40 mL de MACS buffer até 50 mL.
  3. Enriquecer o CD34+ células de hemolisadas células brancas do sangue (glóbulos brancos) usando protocolos padrão.
    1. Gire as células a 800 x g durante 15 min. verificar os tubos para certificar-se de que nenhuma célula redemoinhos são evidentes no meio/parte superior. Se as células estão presentes acima a pelota, centrifugue novamente em uma velocidade mais elevada (até 1.000 x g máxima) e para até 10 min.
    2. Aspirar o sobrenadante e ressuspendê-lo em 10 mL ou menos de buffer de MACS, observando o volume exato. Conte as células em uma diluição de 1: 100 ou 1:1,000 usando um hemocytometer ou um contador de célula automatizada.
      Nota: Esta contagem de WBC total é a contagem de pré-enriquecimento.
    3. Adicione o buffer de MACS para reduzir a concentração de células a 1 x 108 células/mL. Se necessário, primeiro, repita as etapas de 1.3.1 - 1.3.2 (por exemplo, devido a uma baixa contagem de pré-enriquecimento). Reserve 5 x 106 células no buffer de MACS para subconjunto HSC coloração (amostra de pré-enriquecimento).
    4. Adicione anti-CD34 unconjugated anticorpo (clone 12,8, Tabela de materiais)27 para as células restantes de pré-enriquecimento para uma concentração final de 40 µ g/mL (1 x 108 células/mL). Incube a suspensão de eritrócitos a 4 ° C em rotacao do tubo (ver a Tabela de materiais) para 25-30 min.
    5. Utilização de buffer de MACS para trazer o volume para 50 mL e girar as células a 800 x g durante 5 min. Aspire o sobrenadante, Ressuspender as células em 50 mL de tampão de MACS e girar novamente em 800 x g por 5 min.
    6. Degas 100 mL de tampão de MACS com dois tubos de filtro, envolvendo a entrada de ar com papel de cera, para 25-30 minutos ou até estar pronto para uso.
    7. Calcular o volume necessário de grânulos magnéticos: 1 mL de grânulos/109 células. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células a 108 células/mL, depois que os grânulos são adicionados. Por exemplo: 3 x 109 células + 3 mL de grânulos + 27 mL de MACS de buffer para 30 mL de volume total.
    8. Incube a suspensão de eritrócitos a 4 ° C em rotacao tubo para 25-30 min.
    9. Durante adquirir ímãs para as colunas; Pretendo usar 0,6 x 109 células por coluna. Coloque as colunas sobre o ímã e coloque um tubo cónico de 50 mL, abaixo de cada coluna para coletar o fluxo através de. Preparar um tubo cônico de 15 mL e o êmbolo para cada coluna de eluição (passo
    10. Quando a incubação na etapa 1.3.8 é completa, adicionar o buffer de MACS para 50ml e girar a 800 x g durante 5 min. Aspire o sobrenadante e ressuspender as células em buffer de MACS libertos (2 mL por coluna). Pipeta suavemente para evitar a introdução de bolhas.
    11. Sem permitir que a coluna a secar, adicione 1 mL de tampão de MACS desgaseificado para cada coluna, seguida de 2 mL de suspensão de células. Lave o filtro e tubo original com buffer de MACS desgaseificado e dividir a solução igualmente entre as colunas (6 mL/coluna); em seguida, adicione 7 mL de tampão de MACS libertos para a lavagem final.
    12. Suavemente, puxe a coluna longe do ímã (empurre a parte superior traseira) e coletar a última gota para o tubo de escoamento. Adicionar 5 mL de tampão de MACS desgaseificado para cada coluna e aplicar o êmbolo para eluir as células dentro do tubo cônico estéril da etapa 1.3.9. Não recolhem qualquer líquido depois aparecem bolhas.
  4. Conte as células em ambos o enriquecido e os escoamento (FT) tubos de colheita em uma proporção de diluição de 01:10. Manter as células no gelo. Alíquota 1 x 106 células da fração enriquecida CD34 e 5 x 106 células de frações FT para análise por citometria de fluxo. Armazene a fração FT a 4 ° C até o controle de qualidade (passo 2) é celebrado.
    Nota: O número de CD34+ necessárias para enxertia multilineage sucesso no PNC é dependente na frequência do CD34 HSC-enriquecido de células+CD90+CD45RA subconjunto– . Com base em uma frequência média de 3% - 5% e o requisito mínimo de 122.000 CD34+CD90+CD45RA células– por quilograma de corpo peso1, é recomendado proceder com um total de pelo menos 2,5 x 106 e até 10 x 10 6 CD34+ células por quilograma de peso corporal.
  5. Adicionar MACS buffer para o CD34+ enriquecido fração a um 50 mL no total, girar a 800 x g por 5 min, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células 106 células/ml em mídia HSPC (tabela 1).
    1. As células em uma densidade de 106 células/mL em exalada, cultura de tecidos (TC) da placa-tratados frascos de T-75 10-20 mL por frasco e incube-os durante a noite em um 37 ° C, 5% CO2 incubadora. Descanse os frascos no comprimento (não em pé).
      Nota: Se desejado, CD34 adicionais+ células ou CD34– FT pode ser criopreservado em 90% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS) + 10% dimetilsulfóxido (DMSO) em uma concentração de 1 x 106 a 5 x 106 células/mL, então refrigerado lento... 80 ° C (por exemplo, usando recipientes de congelação). O rendimento médio de recuperação de células criopreservados é dependente o CD34+ pureza e geralmente varia de 50% a 80% com uma viabilidade de > 80%.

2. controle da qualidade das células CD34-enriquecido (dia -1)

  1. Prepare amostras para citometria de fluxo.
    1. Resuspenda as amostras reservadas de cada etapa de isolamento mencionada acima (pré-enriquecimento, FT e frações CD34-enriquecido) em tampão de FACS numa concentração de 10 x 106 células/mL e transferir 100 µ l de cada suspensão de células (tabela 1) para um tubo de FACS.
      Nota: Amostras de controlo devem incluir células imaculadas de cada etapa de isolamento (por exemplo, 5 x 105 células) para o ajuste de dispersão para a frente (FSC), dispersão lateral (SSC) e autofluorescência em cada canal de fluorescência. Além disso, contas de compensação single-manchado para cada anticorpo conjugado fluorocromo deverão ajustar para a compensação entre canais adjacentes (tabela 2 e tabela 3).
    2. Acrescente os anticorpos desejados (por exemplo, anti-CD45, anti-CD34, anti-CD45RA e anti-CD90), de acordo com as instruções do fabricante, para um teste (1 x 106 células em 100 µ l) (tabela 3). Incubar durante 20 min a 4 ° C. Adicionar 3 mL de tampão de FACS e rotação a 800 x g por 5 min, aspirar o sobrenadante, resuspenda em 100 µ l de tampão de FACS e analisar em um citômetro de fluxo apropriado (passo 2.2).
  2. Prepare o classificador de celular/citômetro de fluxo para análise.
    Nota:     recomenda-se realizar a análise na mesma máquina que será usada para célula classificação na etapa 2.3.
    1. Gere um protocolo, incluindo FSC/SSC e CD45/CD34 CD45RA/CD90 (três parcelas de fluxo). Botão direito do mouse em um terreno de fluxo e adicionar o layout de hierarquia de população .
    2. Esquerdo, clique na trama do FSC/SSC, selecione o recurso de portal de polígono e desenhe um portão para excluir os detritos e as células mortas. Destaque o novo portal e renomeá-lo para espalhar na janela Inspetor.
      Nota: Isso automaticamente é denominado como P1.
    3. Botão direito do mouse no centro da trama do fluxo CD45/CD34, navegue para Mostrar as populaçõese portão a trama na dispersão. Desenhar um portão retangular em torno a CD45intCD34+ células células CD34 não de excluir e células nonhematopoietic, como bem como residual de plaquetas e hemácias (CD45–). Renomear o portão CD34+.
    4. Portão a trama de fluxo CD45RA/CD90 sobre o CD34+ população. Desenhe três subgates independentes em torno do CD90+CD45RA células de– (enriquecidas para linfócitos), CD90–CD45RA células– (enriquecidas para progenitoras multipotentes e Eritro-mieloide [MPPs/EMPs]) e CD90–CD45RA + células (enriquecidas para progenitores mieloides linfoproliferativas [PMT]). Renomeie os portões para o HSC, MPP-EMPe LMP, respectivamente.
    5. Quando terminar, certifique-se de que a hierarquia de população contém seis entradas hierarquicamente organizadas na seguinte ordem: 1) todos os eventos; 2) dispersão; 3) CD34+; 4) HSC; 5) MPP-EMP; 6) LMP. Certifique-se de que as parcelas do fluxo e a forma da porta olhar como ilustrado na Figura 4.
    6. Execute imaculados glóbulos brancos de pré-enriquecimento para ajustar a tensão para o FSC, SSC e todos os canais de fluorescência (tabela 2, amostra 5). Execute contas de compensação single-manchado para ajustar a compensação entre canais adjacentes (tabela 2, as amostras de 1-4). Executar todos os restante inocente e manchado de amostras com o ajustado e compensado de protocolo, para documentar a eficiência de enriquecimento CD34 (tabela 2, amostras de 6-9).
      Nota: Manter a amostra final (tabela 2, amostra 10) para a análise dos fluxos simultâneos e célula classificação na etapa 2.4.
  3. Configure o classificador de pilha para o tipo-purificação de subconjuntos de CD34 em ensaios formadoras de célula (CFC).
    Nota:     se uma máquina diferente foi usada para análise (passo 2.2), configurar o protocolo no classificador de célula conforme descrito nos passos 2.2.1 - 2.2.5.
    1. Ajuste a ângulo/tensão para os córregos e direito-lado esquerdo do software de classificador de célula para depositar células em tubos de 15 mL contendo CFC meio. Configure o ângulo do fluxo de lado para evitar desalinhamento. Step-Wise, ajuste o ângulo do fluxo desviado de lado até as células classificadas bateu o meio de CFC e não do lado do tubo, porque muito poucas células são classificadas.
    2. No navegador, abra a pasta de planilhas globais e criar um novo classificação-layout usando o botão no menu superior da janela do navegador. Alterar a entrada no menu suspenso dispositivo de recolha para 2 tubos, a entrada no menu suspenso precisão de 4 vias pureza ou única célula e definir os eventos de alvo a 800-1.200 células. Clique no campo tipo-localização (esquerda ou direita), selecione a entrada adicionar no menu e escolher a população para classificar no menu.
  4. Classificar as células para ensaios de CFC.
    Nota:     classificação para os ensaios do CFC só é executada com células do produto enriquecido CD34 (tabela 2, exemplo 10).
    1. Carregar a amostra 10, registrar eventos de 2.000-3.000 e fino-ajustar os portões tipo para caber as populações de força e alvo de sinal.
    2. Quando a instalação estiver concluída, adquira células (tabela 2, exemplo 10). Aquisição de dados conforme descrito na etapa 2.2.3, ajustar a vazão de 500-1.000 células/s e classificar a 800-1.200 células do i) Scatter portão, ii) o CD34+ portão, portão iii) o HSC, iv) o portão MPP-EMP e v) o portão LMP em tubos separados contendo 3,6 mL de CFC meios de comunicação.
      Nota: Classificação para os ensaios do CFC só é executada com células do produto enriquecido CD34 (tabela 3, exemplo 10). Células do Scatter e CD34+ portões devem ser classificados individualmente, Considerando que os linfócitos, MPP-EMPs e PMT pode ser classificados simultaneamente para a posição de titular do tubo esquerdo e direito.
    3. Vórtice e distribuir 1 mL de suspensão de células para cada um do nontissue estéril, 3 x 3.5 cm, pratos de Petri cultura tratada. Incube as células a 37 ° C por 10-14 dias em um recipiente secundário (por exemplo, uma placa de Petri de 15 cm).
    4. Em 10 dias-11 postplating, contagem colônias individuais de todos os três pratos por condição, com base na morfologia das colónias.

3. Gene modificação de CD34+ HSPCs e recuperação durante a noite (dia 0)

  1. Dilua 2,5 mL de solução de CH-296 1 µ g / µ l 50 µ g/ml em 50 mL de equilibrada solução de sal Hank está (HBSS, consulte a Tabela de materiais).
  2. Prepare frascos para a transdução de LV.
    1. Determinar o número aproximado de nontissue-cultura (não-TC)-Tratado de frascos necessários (geralmente a partir da contagem de células determinada na etapa 1.4). Plano para placa 1 x 107 células em 10 mL de mídia por balão de T-75 (1 x 108 células total exigiria 10 frascos) e incluem um TC não-tratados 12 placa (condição de transdução simulado). Adicione HBSS estéril e 50 µ g/mL CH-296 estoque da etapa 3.1 para cada balão/placa, em uma concentração de 2 µ g/cm2. Para frascos de T-75 usar 3 mL de 50 µ g/mL CH-296 + 7 mL de HBSS; para a placa de 12, use 160 µ l de 50 μL de CH-296 + 340 µ g/mL de HBSS por bem.
    2. Permitir que os pratos que fique intacta RT sobre uma bancada limpa ou no bairro por 2 h. Aspire o CH-296 e substituí-lo com um volume semelhante de HBSS estéril + 2% albumina de soro bovino (BSA). Incubar a RT por 30 min, Aspire o HBSS/BSA e lavar os pratos com um volume semelhante de HBSS estéril contendo 2,5% 1 HEPES M, pH 7,0. Aspire imediatamente antes de chapear as pilhas (passo 3.4).
      Nota: Seguindo o passo 3.2.2, não permitir que os frascos/placas secar. Placas contendo estéril HBSS + 2,5% 1 M de HEPES realizam-se a 4 ° C durante a noite (ou seja,, preparar no dia -1).
  3. Colheita e transduce o CD34+ células de dia -1.
    1. Utilizando uma pipeta de 10 mL, enxágue células frouxamente aderentes enxaguando a repetida, gentil de cada frasco de cultura com HBSS estéril. Certifique-se de que todas as células irão desanexar (se necessário, torneira/tapa no balão para afrouxar as células).
    2. Centrifugar as células a 800 x g por 5 min, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em meios de transdução a uma concentração de 1 x 106 células/mL. Uma vez que todas as células têm sido recolhidas, determine a contagem de células, usando um hemocytometer ou contador automatizado de células.
    3. Adicione 1 mL de suspensão de células (1 x 106 células) a um poço da placa de 12 poços CH-296-revestido (para a amostra de controle de simulação-transfectadas). Divide o restante das células entre os frascos de T-75 (passo 3.2.2), adicionando cerca de 10 mL (1 x 107 células) por balão. Permitir que as células aderir ao revestimento dos CH-296 por incubação a 37 ° C, 5% de CO2 por 30 min, com os tampões ventilados.
    4. Descongelar o vírus-condicionado mídia (VCM, Tabela de materiais) e determinar a concentração em unidades infecciosas por mililitro (UI/mL)28,29,30,31,32 . Adicionar o volume apropriado de VCM a cada balão de T-75 da etapa 3.3.3 e incubar a 37 ° C, 5% CO2células.
      Nota: Se executar uma única transdução, incubar durante uma noite; Se executar uma dupla transdução, repita este stepapproximately 6 - 8 h após a primeira transdução sem uma lavagem e recuperação de fase e, em seguida, incubar durante uma noite. Por exemplo, para um balão (1 x 107 células) com uma multiplicidade de desejado de infecção (MOI) de 10, adicione 1 mL de vírus titulada a 1 x 108 UI/mL.

4. celular colheita e preparação para infusão (dia 1)

  1. As células da colheita.
    1. Recolha pilhas transduzidas e simulação, conforme descrito nas etapas 3.3.1 - 3.3.2. Realize lavagens sequenciais com 10 mL de HBSS, transferindo as lavagens para o tubo cônico com as células. Certifique-se de que todas as células foram retiradas os frascos, batendo/tapa os balões se necessário.
    2. Centrifugar as suspensões celulares a 800 x g por 5 min, aspirar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 1 mL de HBSS. Combine os tubos contendo células da mesma condição. Cada um com 10 mL de HBSS enxaguar e o adicione à suspensão de células. Determine a contagem de células usando um hemocytometer. Trazer o volume total da célula a 50 mL de HBSS e centrifugar 800 x g por 5 min.
  2. Pulso de prostaglandina E2 (PGE2) e preparar reagentes para o produto de infusão.
    1. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células transduzidas (não simulado) de 5 x 106/mL em mídia HSPC sem citocinas. Adicionar 10 mM PGE2 para uma concentração final de 10 µM. Incubar as células no gelo durante 2 h, agitando-os suavemente cada 30 min.
    2. Durante a etapa de 4.2.1, calor-inativar o soro autólogo (Tabela de materiais), envolvendo o recipiente no papel de cera e incubando-a 56 ° C durante 30 min. preparem soro autólogo de 2% no mix HBSS (500 µ l de soro inativado por calor + 24,5 mL de HBSS),-os bem, e armazene a mistura no gelo até o uso. Também, durante a etapa de 4.2.1, colha células-simulação-transfectadas em uma placa de 12 pipetando as células acima e para baixo vigorosamente. Adicionar a suspensão de células para um tubo cônico de 15 mL, lave-os 3 x 1 ml de HBSS e adicionar as lavagens para o mesmo tubo cônico de 15 mL.
    3. Depois de 2h de PGE2 de incubação, lavar as células 2 x por centrifugação-los a 800 x g por 5 min e descartar o sobrenadante. Após a segunda lavagem, Ressuspender as células em um volume adequado de HBSS para a contagem, usando um hemocytometer ou um contador de célula automatizada.
      Nota: Células aglutinar-se frequentemente após um pulso de PGE2, que pode fazer para contagem de células menos confiável. Em caso afirmativo, use a contagem de células da etapa 4.1.2 em vez de um da etapa 4.2.3.
  3. Reserva de células transduzidas e simuladas para o controle de qualidade (etapa 5) do produto infusão: 5 x 105 1 x 106 células de fluxo cytometry/célula classificação (etapas 5.1 e 5.3) e aproximadamente 1 x 106 para cultura líquida (passo 5.2) e colônia reação em cadeia da polimerase (PCR) (passo 5.4).
  4. Prepare o produto de infusão.
    1. Com o restante das células transduzidas, realizar uma terceira lavagem em 50 mL de HBSS, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 10 mL de HBSS + 2% de soro autólogo (preparado na etapa 4.2.2). Desenhe a solução 10 mL em uma seringa de 20 mL, equipada com uma agulha de 16,5 G. Lavar o tubo com 10 mL de HBSS + soro 2% auto e desenhar a lavagem para a mesma seringa para trazer o volume total de 20ml. Cap a seringa com a tampa da agulha, rotular a seringa e colocá-lo em gelo para transporte/infusão.
    2. Infundi o produto transduzidas célula no host autólogo, localizado dentro de um centro de pesquisa animal credenciado, através de um cateter venoso central33,34. Monitorar a contagem de glóbulos completa dos animais transplantados (CBCs) e exames de sangue e realizar ensaios de gene-marcação de estudo específico sob medidos para o projeto1,6,19.

5. controle de qualidade

Nota: Citometria de fluxo e triagem de célula são executadas depois que as células são infundidas para os animais como parte do seguimento descrito na etapa 4.4.2. Dados de fluxo cytometric é usado imediatamente após o transplante para determinar a composição de subconjuntos de célula tronco e progenitoras fenotipicamente definidos no produto infusão (etapas 5.1 e 5.3), Considerando que a análise do CFC ensaios é realizada de 12 a 14 dias postinfusion para determinar a eficiência do gene-modificação em Colônia PCR (passo 5.4).

  1. Execute a citometria de fluxo e CFC classificação do produto infusão.
    1. Analisar as células por citometria de fluxo e tipo-purificar CD34 subconjuntos para ensaios de CFC, conforme descrito na seção 2. Semente CFC ensaios de simulação transduzidas CD34 de células (o produto de infusão após o pulso de PGE2).
    2. Classificar um máximo de 800 células por condição e vórtice, placa, cultura e contar ensaios CFC conforme descrito na etapa 2.4. Depois de contar, escolha as colônias de ensaios para executar colônia PCR conforme descrito na etapa 5.4 os CFC.
  2. Cultura líquida
    1. Células de placa para cultura de líquidos na mídia HSPC a 1 x 106/mL em placas de TC não-tratados. Em posttransduction dias, 2, 5 e 12, colheita e contar as células por citometria de fluxo. Célula de triagem para ensaios de CFC não é necessária.
    2. Nos dias 2 e 5, replate 33% das células em mídia HSPC fresca em 1 x 106/mL. Congele a 33% das células no buffer de extração de DNA por PCR quantitativo em tempo real. Use 33% das células por citometria de fluxo, como descrito nos passos 2.1 e 2.2.
    3. Use estes dados da etapa 5.2.2 para analisar a composição fenotípica de progênie hematopoiéticas. Determine a frequência de células CD34 + e subconjuntos fenotipicamente definidos conforme descrito na etapa 2.2.2 dentro de cada amostra. Comparar a composição do CD34+ células entre condições para determinar o efeito da modificação genética.
      Nota: CD34+ células devem manter sua expressão ao longo de toda a cultura e conter todos os subconjuntos fenotípicos. Uma perda de CD90+CD45RA células– ou uma sobre-representação de subconjuntos fenotípica pode indicar efeitos diretos ou indiretos de modificação genética.
  3. Quantificar a expressão do transgene (ex.., verde fluorescente da proteína [GFP]) por citometria de fluxo (opcional e dependendo da configuração experimental), adaptando o protocolo da etapa 2.2.
    1. Adicionar três parcelas de fluxo, mostrando o SSC/transgene (por exemplo, SSC/GFP). Portão a primeira trama em linfócitos, o segundo na MPPs-EMPs e o terceiro na PMT. trama cada contra transgene (por exemplo, as boas práticas agrícolas) e criar portas chamadas HSC-GFP+, MPP-EMP-GFP+e LMP-GFP+, respectivamente.
    2. Quando completa, a hierarquia de população deve conter nove entradas hierarquicamente organizadas na seguinte ordem: 1) todos os eventos; 2) dispersão; 3) CD34+; 4) HSC; 5) HSC-GFP+; 6) MPP-EMP; 7) MPP-EMP-GFP+; 8) LMP; 9) LMP-GFP+.
      Nota: Qualquer expressão do transgene mais tarde em cultura líquida (por exemplo, dias 5 e 12) refletirá melhor a eficiência de modificação genética determinada por PCR de colônia em passo 5.4. Pontos de tempo anteriores em cultura líquida podem superestimar a expressão do transgene, devido ao LVs dificultando. Da mesma forma, fluxo e separação de células GFP+ para ensaios de CFC no dia 1 irão resultar em muitas colônias de positivas falsas.
  4. Realize a PCR de colônia.
    1. Após a contagem de passos 2.4.4 e 5.1.1, escolher o única colônias em 50 µ l de tampão de extração de DNA, usando um µ l 10 ou 20 µ l pipeta e pipeta de cima e para baixo para transferir as colônias para um tubo de um PCR 8-tubo tira cap. Escolha oito colônias da condição simulada e 88 colônias da condição transduzida para gerar uma placa de 96 poços completo. Adicione 50 µ l de tampão de extração de DNA a cada poço.
    2. Extrair DNA de colônias, usando um thermocycler e o programa a seguir: 65 ° C/20 min, 99 ° C/10 min e um 4 ° C segurar. Plano para mover o DNA a-20 ° C, logo que possível para uma qualidade ideal.
    3. Execute a colônia PCR quantificar células transfectadas-LV, comparando o número de colônias de LV+ , usando as primeiras demão Lenti F/R, para totais colônias, utilizando primers actina F/R e controle (Tabela de materiais).

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo descrito acima é projetado para isolar e gene-modificar NHP CD34+ HSPCs, que posteriormente pode ser infundido volta para o host autólogo (Figura 1 e Figura 2). Quando este protocolo a seguir, nós geralmente obter até 8 x 109 glóbulos brancos totais do BM purgado de macacos de pigtail e, às vezes, o dobro desse montante de macacos rhesus. Em ambas as espécies, o número de CD34+ HSPCs q...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vetor de LV engenharia é o método mais bem caracterizado para gene-modificar tipos de célula como CD34 + HSPCs, para posterior transplante em vivo. O protocolo descrito aqui é projetado para maximizar o número de HSPCs gene modificado que persistem a longo prazo na vivo e fornecem benefícios clínicos aos pacientes com várias doenças malignas, infecciosas e genéticas. Embora o gene-edição estratégias surgiram na última década, LV-modificado células são os melhores estudadas in vitro, em modelos animais e em pac...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores graças Helen Crawford na preparação deste manuscrito, Jim Woolace de design gráfico e Veronica Nelson e Devikha Chandrasekaran para participar no desenvolvimento do protocolo. O desenvolvimento do presente protocolo foi apoiado por concessões do NIH Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas (R01 AI135953 e AI138329 para H.P.K.) e nacional de coração, pulmão e Instituto de sangue (R01 HL136135, HL116217, HL122173 P01 e sub-19 HL129902 para H.P.K.), bem como NIH P51 OD010425 e, em parte através do centro de câncer NIH/ICN, suporte Grant P30 CA015704. H.P.K. é um investigador de Medicina Molecular Markey e recebeu apoio como o destinatário inaugural de José Carreras/E. Donnall Thomas dotado cadeira para pesquisa do câncer e o Fred Hutch dotado cadeira para celular e Gene Therapy.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Stemspam SFEM II ("HSPC") MídiaStemCell09655
Solução salina balanceada de HankGibco14175095
solução salina tamponada com fosfatoGibco14190-144
Penicilina/estreptomicinaGibco15140-122
DimetilsulfóxidoSigma AldrichD2650-100
100% EtanolDecon labsM18027161M
CiclosporinaSigma30024-25MG
500 mM EDTAInvitrogen15575-038
Soro Fetal Bovino Inativadopor Calor Sigma AldrichPS-0500-A
CH-296/ RetroNectina (2.5 mL, 1 µ g/µ L)TaKaRAT100B
Albumina de soro bovinoSigmaA7906-100g
HEPESSigmaH9897
Grânulos magnéticos IgM anti-ratoMiltenyi Biotec130-047-301
Fator de Células-Tronco Humanas Recombinantes (SCF)Peprotech300-07
Trombopoetina Humana Recombinante (TPO)Peprotech300-18
Tirosina quinase 3 semelhante ao FMS humano recombinante (FLT-3)Peprotech300-19
Sulfato de protaminaSigmaP-4505
14 mL Polipropileno Tubo de fundo redondoCorning352059
Colony Gel 1402ReachBio1402
QuadroMACS SeparadoresMiltenyi Biotec130-090-976
Colunas MACS L25Miltenyi biotec130-042-401
10 mM PGE2Cayman Chemical14753-5mg
frascos T-75 tratados com TCBioexpressT-3001-2
Frascos T-75 não tratados com TCSeringas Thermo-Fisher13680-57
20 mLBD Biosciences302830
16,5 G agulhasBD Tampade 305198
BD Biosciences305819
QuickExtract DNA SolutionEpicentreQE09050
8-tube strip cap PCR TubesUSA scientific1402-2708
Thermocycler de 96 poçosThermo-Fisher4375786
Filtros de pré-separaçãoMiltenyi Biotec130-041-407
Filtro, Célula; Falcão BD; Estéril; Malha de nylon; Tamanho de malha: 70um; Cor: branco; 50/CSfisher scientific352350
Ultracomp ebeadseBioscience01-2222-42
MACSmix Tube RotatorMiltenyi130-090-753
Seringas Luer-Lock de 3 mLThermo-Fisher14823435
Placa de cultura de células de 35 mm x 10 mmCorning430165
Placa de cultura de células de 60 mm x 15 mmCorning
Placa de cultura de células de 150 mm x 25 mmCorning
Falcon353133
Extração de DNA Qiagen Qiagen51104
PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone: 5E10Biolegend328110
PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone: 563BD horizon562449
APC-H7 Camundongo Anti-Humano CD45RA Clone: 5H9BD Pharmingen561212
V450 Camundongo Anti-NHP CD45 Clone: d058-1283BD Biosciences561291
Soro AutólogoColetado do hospedeiro autólogo e criopreservado antes da mobilização e coleta de CD34+ HSPCsN/ABeard, B. C. et al. Seleção eficiente e estável mediada por MGMT de células-tronco de repovoamento de longo prazo em primatas não humanos. Jornal de Investigação Clínica. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Mídia Condicionada por Vírus (VCM)Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH)N/ABeard, B. C. et al. Seleção eficiente e estável mediada por MGMT de células-tronco de repovoamento de longo prazo em primatas não humanos. Jornal de Investigação Clínica. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Anticorpo anti-CD34, Clone 12.8Kiem LabN/ABeard, B. C. et al. Seleção eficiente e estável mediada por MGMT de células-tronco de repovoamento de longo prazo em primatas não humanos. Jornal de Investigação Clínica. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Primer Lenti F: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. et al. Enxerto policlonal multilinhagem de células modificadas pelo gene Cal-1 e seleção in vivo após infecção por SHIV em um modelo de primata não humano de AIDS. Mol Ther Métodos Clin Dev. 3 16007, (2016).
Primer Lenti R: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAAIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. et al. Enxerto policlonal multilinhagem de células modificadas pelo gene Cal-1 e seleção in vivo após infecção por SHIV em um modelo de primata não humano de AIDS. Mol Ther Métodos Clin Dev. 3 16007, (2016).
Primer de actina F: TCCTGTGGCACTCACGAAACTIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. et al. Enxerto policlonal multilinhagem de células modificadas pelo gene Cal-1 e seleção in vivo após infecção por SHIV em um modelo de primata não humano de AIDS. Mol Ther Métodos Clin Dev. 3 16007, (2016).
Primer de actina R: GAAGCATTTGCGGTGGACGATIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. et al. Enxerto policlonal multilinhagem de células modificadas pelo gene Cal-1 e seleção in vivo após infecção por SHIV em um modelo de primata não humano de AIDS. Mol Ther Métodos Clin Dev. 3 16007, (2016).
de ponta de seringa de precisão430196 Frascos não tratados com 430599 TC

Referências

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