Artigo de método

Usando o protozoário Paramecium caudatum como um veículo para infecções de origem alimentar em larvas de Zebrafish

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DOI:

10.3791/58949

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7 de janeiro de 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1McGovern Medical School, Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of Texas Health Science Center at Houston

Neste artigo

Resumo

Peixe-zebra (Danio rerio) estão se tornando vertebrado modelo animal utilizado para colonização microbiana e patogénese. Este protocolo descreve o uso do protozoário Paramecium caudatum como um veículo para a infecção de origem alimentar em larvas de peixe-zebra. P. caudatum prontamente internaliza as bactérias e obter retomadas por larval zebrafish através de comportamento predando natural.

Resumo

Devido a sua transparência, rastreabilidade genética e facilidade de manutenção, peixe-zebra (Danio rerio) tornaram-se um modelo de vertebrados utilizado para doenças infecciosas. Zebrafish larval naturalmente predar os unicelulares protozoários Paramecium caudatum. Este protocolo descreve o uso de p. caudatum como um veículo para a infecção de origem alimentar em zebrafish larval. P. caudatum internalizar uma vasta gama de bactérias e células bacterianas permanecem viáveis durante várias horas. Zebrafish então predar p. caudatum, a carga bacteriana é lançada no foregut após digestão do veículo paramécio e as bactérias colonizam o trato intestinal. O protocolo inclui uma descrição detalhada da manutenção de paramécios, carregando com bactérias, determinação da degradação bacteriana e dose, assim como a infecção de zebrafish, alimentando com protozoários. A vantagem deste método de infecção de origem alimentar é que estreitamente imita o modo de infecção observada na doença humana, leva à colonização mais robusta em relação aos protocolos de imersão e permite o estudo de uma ampla gama de patógenos. Infecção de origem alimentar no zebrafish modelo pode ser usada para investigar a expressão de gene bacteriano dentro do hospedeiro, interações patógeno-hospedeiro e características de patogenicidade, incluindo a morbilidade, a localização, a difusão e a carga bacteriana.

Introdução

Compartilhamento de zebrafish morfologicamente e funcionalmente conservada características com mamíferos, incluindo linhagens granulocíticos (por exemplo, os neutrófilos), monócitos/macrófagos-células, receptores Toll-like, citocinas pró-inflamatórias e peptídeos antimicrobianos1 . O trato intestinal no zebrafish é totalmente desenvolvido em 6 dias pós fertilização (dpf) e mostra a conservação morfológica e funcional com o trato gastrointestinal dos mamíferos, tais como Regulamento transcriptional conservado em células epiteliais intestinais 2. isso faz com que um excelente modelo para a colonização microbiana intestinal e patogênese zebrafish. Uma ampla gama de bactérias entéricas tem sido estudada no modelo zebrafish, incluindo enterohemorrhagic Escherichia coli3, Vibrio cholerae4,5, Salmonella enterica6, o zebrafish microbiota7,8e o papel dos probióticos na imunidade intestinal9. Uma vantagem distinta do zebrafish modelo é que ele é colonizado por muitos micróbios sem interromper a microbiota endógena, que permite a investigação de comportamento microbiano no contexto de populações microbianas mistas3, 6. atualmente, a maioria dos modelos de zebrafish de colonização gastrointestinal e doença dependem da administração de micróbios por imersão de banho, onde o zebrafish são incubadas em uma suspensão bacteriana para uma quantidade específica de tempo10. No entanto, isso torna difícil determinar a dose exata de bactérias administradas e leva à colonização limitada com alguns micróbios, particularmente com bactérias não-patogênicas. Alternativamente, uma suspensão bacteriana é administrada a pescar através de de gavagem oral11, mas isso é tecnicamente desafiador e limitado a larvas mais velhas e adultos.

Este protocolo descreve o uso do unicelulares protozoários Paramecium caudatum como um veículo para entrega de origem alimentar de micróbios para o trato gastrointestinal de larvas de peixe-zebra. Paramécios são fácil e barato para manter e são capazes de alimentando-se de uma grande variedade de micróbios, incluindo algas, fungos e bactérias, que eles interiorizar através de um sulco oral ciliadas12,13,14. Uma vez internalizados, bactérias realizam-se em vacúolos, que eventualmente acidificar e conteúdo são degradados ao longo de um período de tempo de várias horas15. Zebrafish larval capturar protozoários como presas naturais logo após a eclosão, cerca dpf de 3 – 4, dependendo da temperatura de16e levá-los com alta eficiência. O processo de captura de presas leva em média 1.2 s da detecção de capturar17e paramécios capturados são digeridos rapidamente no zebrafish foregut, tal que interiorizado bactérias viáveis são liberadas para o trato intestinal3. Como resultado, os paramécios podem ser usados como um método rápido e fácil para entregar uma dose alta e consistente de bactérias no trato gastrointestinal de zebrafish. As bactérias entregues também podem ser transformadas para expressar uma proteína fluorescente, tais como mCherry, conforme descrito aqui, ou, no caso de bactérias geneticamente intratáveis, podem ser pre-manchadas com uma tintura fluorescente para permitir a visualização dentro do trato gastrointestinal.

Este protocolo descreve a entrega de origem alimentar de enteropatogênica Escherichia coli (enterohemorrhagic Escherichia coli [EHEC] e aderente invasiva Escherichia coli [AIEC]) e o SSP de Salmonella enterica Typhimurium. Tanto a patogenicidade de e. coli e S. typhimurium são transmitidas através da rota fecal-oral18,19e podem ser adquirida através de contaminados alimentos como carne, legumes e laticínios. Usando p. caudatum como um veículo, e. coli e S. typhimurium colonizam com sucesso as larvas de zebrafish dentro de 30 a 60 min de incubação co com o veículo paramécio. A carga bacteriana alcançada é robusta o suficiente para visualizar a colonização e determinar a carga por chapeamento do tecido homogenates.

Protocolo

Zebrafish cuidados, reprodução e experiências aqui descritas estão em conformidade com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório e foram aprovadas pelo Comitê institucional de bem-estar Animal do University of Texas Health Science Center, protocolo número AWC-16-0127.

1. o crescimento e manutenção de protozoários

  1. Obter culturas de protozoários ao vivo de fontes tais como o centro de recursos internacional Zebrafish (ZIRC).
  2. De uma cultura viva e crescente, adicionar 1 mL da cultura paramécios, 1ml de uma cultura de MG1655 de e. coli (densidade óptica OD600 1.0 – 2.0) resuspended em 1 x E3 (0,29 g/L NaCl, 13 mg/L de KCl, 44 mg/L de CaCl2, 81 mg/L de MgSO4 HEPES, pH 7.0, estéril de 0,48 g/L) e 8 mL de 1 x E3 para um balão de cultura de tecidos de 10 mL. Agite levemente e em seguida armazenar a 22 ° C.
  3. Para manter uma cultura, a cada duas semanas, passagem 1 mL de uma cultura de protozoários para um balão de cultura de tecidos de 10 mL com 9 mL de meio fresco de x E3 1, contendo 108 UFC/mL de Escherichia coli MG1655 resuspended em 1 x E3.

2. determinação da bacteriana Dose administrada de Zebrafish

  1. Determinar a meia-vida bacteriana dentro de Paramecium
    Nota: A meia-vida de bactérias dentro paramécios é determinado pelo chapeamento viável Escherichia coli recuperou paramécio, conforme descrito abaixo.
    1. Após uma incubação de 2h de bactérias (OD600 de 1.0) com paramécios a 22 ° C, combine os paramécios e cultura bacteriana de co em um tubo cónico de 50 mL, lavar os protozoários com 1 x E3 e a contagem do número de protozoários por mililitro (como descrito abaixo em passos 3.2.7 e 3.2.8).
    2. Depois de contar o número de protozoários, remover 50 µ l dos paramécios e cultura bacteriana co cada hora (para pós-exposição de 6 h) e adicionar a cada amostra em um tubo 1,5 mL.
    3. µ L de lugar 950 de surfactante não iônico de 1% (ver Tabela de materiais) em fosfato tamponado fisiológico (PBS) em cada um dos tubos de 1,5 mL e vórtice para 1 min lisar os paramécios. Executar 01:10 diluições de cada amostra usando PBS estéril como diluente (ou seja, 100 µ l em 900 µ l).
    4. Placa de 100 µ l de cada diluição em placas seletivas (meio LB tet: triptona 1 g/L, extrato de levedura 0,5 g/L, 1 g/L de NaCl, 30 tetraciclina µ g/mL) e incubar a 37 ° C, durante 16 h. No dia seguinte, contar e registrar o número de colônias bacterianas na placa (Colônia formando as unidades, CFUs) contando só as isoladas e distintas colônias individuais. Identifica uma placa com uma diluição que dá 30 – 300 CFU.
    5. Determinar a diluição fator utilizado. Por exemplo, se 1 µ l de cultura bacteriana é misturado com 99 mL de PBS estéril, isto é uma diluição de 1: 100 (0,01). Este número será o número de UFC na diluição. Realizar o cálculo abaixo, para cada ponto de tempo, para determinar o UFC na amostra original:
      figure-protocol-1
    6. Calcular e gráficos o número de viável Escherichiacoli/paramécio correspondente às horas pós exposição usando a concentração de protozoários calculada na etapa 3.3.1 e determinar o Half-Life dentro os paramécios (Figura 1).
    7. Usando o UFC número calculado para cada ponto de tempo, calcular e o número de viável e. coli por paramécio no eixo y contra a incubação de post horas no eixo x, usando a concentração de protozoários calculada na etapa 3.3.1 do gráfico. Determine o Half-Life dentro os paramécios.
  2. Determine a taxa de dosagem de Half-Life bacteriana bacteriana e atacando.
    Nota: Para determinar a dosagem bacteriana, a meia-vida das bactérias dentro os paramécios e predando taxa de zebrafish na paramécios (ver passo 3.4) tem que ser tidos em conta.
    1. Use a seguinte fórmula para determinar a deterioração bacteriana dentro de protozoários:
      (1)figure-protocol-2
      Onde N0 é a quantidade inicial de bactérias por protozoários após a incubação de 2 h, Nt é a quantidade restante após o tempo t, τ é o tempo após o qual o número de bactérias viáveis tem reduzido a metade, e k é a constante de decaimento.
    2. No experimento de degradação, determinar o k constante de decaimento, usando a meia-vida bacteriana (ou seja, o tempo após o qual a quantidade de bactérias viável/paramécio tem reduzido a metade).
      (2)figure-protocol-3
      Para a determinação do Half-Life, o termo figure-protocol-4 e
      (3) figure-protocol-5 ou
      (4)figure-protocol-6
      Nota: Com base na Figura 1, a meia-vida de e. coli em paramécios é de aproximadamente 2,3 h. Assim, usando a fórmula (4), a taxa de decaimento, k, para Escherichia coli é:
      (5)figure-protocol-7
    3. Determinar a taxa de decaimento (k) do experimento de Half-Life para encontrar a dose de bactérias viáveis (Nt), retomada por larvas zebrafish depois predando tempo (t), onde (P) é a taxa predando ou o número de protozoários comido por um peixe por hora:
      (6) figure-protocol-8 ou
      (7)figure-protocol-9
      Nota: Por Figura 1, a quantidade inicial de bactérias por protozoários (N0) após uma incubação de 2 h (t) é 790 CFU. Por filme 1 e Figura 2, a taxa predando (P) é de 1539.
    4. Usando esses valores para substituir na equação (7), calcular a dosagem bacteriana consumida por um zebrafish após uma incubação de 2 h como:
      (8)figure-protocol-10

3. food-borne infecção de Zebrafish

  1. Incube as bactérias com protozoários.
    1. Prepare uma cultura co de paramécios e Escherichia coli MG1655 a noite antes da infecção. Combinar a 8 mL da E3 media, 1 mL de uma cultura de protozoários em curso e 1 mL de uma cultura de MG1655 de e. coli (OD600 = 1.0) resuspended em 1 x E3 em frascos de cultura de tecidos de T25. Incube os frascos em temperatura ambiente (RT) durante a noite. Para cada condição de tratamento, prepare dois balões de paramécios.
    2. Inocular a mídia de crescimento bacteriano (LB: triptona 1 g/L, extrato de levedura 0,5 g/L, 1 g/L de NaCl) com infecciosa cepa de bactérias, escolhendo uma colônia bacteriana individual de uma placa utilizando uma ansa de inoculação estéril. Incubar a 37 ° C, a cultura líquida e deixar a tremer em 110 rotações por minuto (rpm) durante a noite.
      Nota: Devem ser usados equipamentos de proteção individual (luvas e um casaco de laboratório) e instalações de nível 2 de segurança biológica devem ser usadas quando a manipulação de agentes infecciosos.
    3. No dia seguinte, medir a OD600 da cultura durante a noite. Calcule o volume de cultura necessária para alcançar uma OD600 de 1 quando resuspended em 11 mL de mídia.
    4. Colha o volume de bactérias do passo 3.1.2 através de centrifugação a 6.000 x g durante 5 min, um volume para cada frasco de paramécios. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o bacteriana em 1 mL de E3 media.
    5. Opcionalmente, pre-manche as bactérias com um corante fluorescente.
      1. Adicione 1 µ l de mancha bacteriana de FM 4-64FX (5 mg/mL de solução). Cobrir o tubo com papel alumínio para proteger de fotobranqueamento e incubar a rotação mais completa em RT por 15 min.
      2. Remover o corante em excesso por lavagem com 1 x E3: bactérias através de centrifugação a 6.000 x g durante 1,5 min de pelotas e, em seguida, resuspenda o pellet em 1 mL de mídia E3. Repita a etapa de lavagem duas vezes.
      3. Colheita manchada de bactérias através de centrifugação a 6.000 x g por 5 min. descartar o sobrenadante e ressuspender o bacteriana em 1 mL de E3 media.
    6. Adicione 1 mL das suspensões bacterianas para cada um dos dois frascos de paramécios frescos. Incube a RT por 2 h.
      Nota: Se trabalhar com bactérias coradas, incube no escuro em RT por 2 h.
  2. Lavagem de bactérias/paramécios co-cultura.
    1. Combine o conteúdo de ambos os frascos de co-cultura paramécios/bactérias em um tubo cónico de 50 mL. Centrifugar as amostras a 300 x g a 15 ° C durante 10 min. Verifique se o centrifugador é pre-cooled antes desta etapa.
    2. Cerca de 10 mL do sobrenadante E3 com uma pipeta sorológica de remover e adicionar cerca de 10 mL de fresco 1 x E3 para o tubo cônico.
      Nota: Durante todas as etapas de lavagem, é essencial para ser muito rápido ao remover o sobrenadante, como os paramécios começará a nadar fora a pelota. Girar e remover sobrenadante de um tubo de cada vez para garantir a manipulação rápida o suficiente para esta etapa e evitar a perda de protozoários no sobrenadante.
    3. Girar as amostras através de centrifugação a 300 x g a 15 ° C por 5 min. remover cerca de 10 mL do sobrenadante E3 com uma pipeta sorológica e adicionar cerca de 10 mL de fresco 1 x E3 para o tubo cônico. Repita duas vezes.
    4. Centrifugar as amostras a 300 x g a 15 ° C por 5 min. remover cerca de 10 mL do sobrenadante E3, tomando cuidado para não perturbar a pelota.
    5. Resuspenda o pellet nos restante 10 mL da E3 media e 500 µ l da suspensão de transferência para um novo tubo de microcentrifuga de 1,5 mL. Pelota a 500 µ l de paramécios por centrifugação a 300 x g por 5 min contar o número de protozoários.
    6. Retire a amostra de 500 µ l 400 µ l do sobrenadante a E3. Adicionar 20 µ l de solução de formaldeído de 36,5% para os restantes 100 µ l de paramécios e ressuspender delicadamente e incubar durante 5 min à 22 ° C.
      Nota: Esta etapa mata os paramécios para permitir a contagem.
    7. Medir o volume total real usando a pipeta e registro. Dilua o paramécios suspensão 1:1 v/v com solução de azul de Tripan 0,4%.
    8. Use um contador de célula ou hemocytometer para contar o número de mortos paramécios/mL.
      Nota: Devido a etapa de fixação prévia, a maioria dos paramécios será mortos neste momento, mas este número refletir o número de protozoários ao vivo para a experiência de incubação co. Os autores não encontraram morte paramécios significativo devido à incubação co bacteriana, então isso pode ser desconsiderado como um fator aqui.
  3. Co incube paramécios e zebrafish as larvas.
    1. Calcule a concentração de protozoários:
      figure-protocol-11
      figure-protocol-12
      Nota: Este cálculo dá a concentração de protozoários no tubo cónico de 50 mL do passo 3.2.5.
    2. Calcule o volume de lavado paramécios necessários para uma concentração de 2 x 105 paramécios/mL em um volume final de 3 mL de E3.
      Nota: A concentração de protozoários pode ser ajustada baseado na dosagem bacteriana desejada, sujeita a otimização.
    3. Anestesiar o zebrafish adicionando tricaina em 100 mM Tris pH 8.0 para uma concentração final de 100 mg/L. transferência 10 zebrafish para cada poço de uma placa em um volume total de 3 mL de E3 fresco contendo a concentração adequada de paramécios (calculado na etapa 6 3.3.2). Certifique-se de transferir as larvas em uma quantidade mínima de líquido, para garantir que eles recuperar da anestesia no poço destinatário.
    4. Incube a 30 ° C, durante 2 h em uma incubadora diurna sob condições de luz do dia, para garantir condições de iluminação ideal para rapinar.
    5. Lave o zebrafish pelo menos 5 vezes pela transferência de peixe para um novo bem contendo 3 mL de E3 fresco contendo metanosulfonato de 100 mg/L de cada vez.
      Nota: Não tente omitir a tricaina durante a etapa de lavagem. Transferência de larvas móveis sem anestesia aumenta o risco de danos e sofrimento para o animal.
    6. Opcionalmente, preparar zebrafish para a imagem latente por incorporação zebrafish em 3 mL de agarose de baixo ponto de fusão de 1% em uma parede preto 6 placa: agarose de baixo ponto de fusão é feita em 1xE3 e aquecida no microondas. Depois de derretido, adicione tricaina a uma concentração final de 160 mg/mL. Posição o peixe sob um estereomicroscópio, usando um gel cortado carregando ponta, certificando-se de que a cabeça está na esquerda e a cauda é à direita (Figura 3). Aguarde 5 minutos para o agarose definir e, em seguida, o peixe incorporado com 1 x E3 contendo metanosulfonato de 160 mg/mL para a imagem latente de sobreposição.
  4. Determine a taxa rapinando.
    Nota: Nenhuma experiência separada precisa ser configurado para determinar a taxa rapinando. Pelo contrário, isso pode ser feito durante a etapa 3.3.4, conforme descrito abaixo.
    1. Durante a etapa 3.3.4, Ver os zebrafish rapinando em uma microscópio estereoscópico e captura imagens de vídeo a captura de presas.
    2. Marca as imagens de vídeo. Captura de presas é caracterizada por marcante de zebrafish em direção a presa. Contar cada greve como evento de captura uma presa, embora esta seja apenas uma aproximação (ver discussão).
    3. Calcule o número médio de eventos de captura de presas por hora de vários clipes de vídeo, cada um representando uma larva de zebrafish diferentes (Figura 2).

Resultados

Paramecium caudatum prontamente internaliza uma vasta gama de bactérias em vacúolos de armazenamento. A densidade bacteriana intracelular depende da densidade de bactérias e protozoários em cultura co, bem como as espécies bacterianas utilizadas. Ao longo do tempo, os vacúolos acidificam e degradação bacteriana ensues. A taxa de degradação tem de ser individualmente determinado para todas as estirpes utilizadas. Para patogênicas de Escherichia coli, a densidade bacteriana inicial é 790 bactérias /paramécioe bactérias são degradados com uma meia-vida de aproximadamente 2,3 h (Figura 1).

figure-results-1
Figura 1: determinação do Half-Life bacteriana em paramécios. (A) seguir 2 h de incubação co com infecciosas e. coli, p. caudatum foi lavado e transferido para meio sem bactérias. Nos pontos de tempo indicado, números de viável Escherichia coli células foram determinadas pelo chapeamento de diluição em ágar seletivo. Os resultados são meios ± erro padrão da média (SEM; n = 3). (B) imagem típica do paramécio carregando internalizada bactérias, com campo claro (Bi), bactérias fluorescentes (Bii) e fundiu-se canais (Biii). Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Além disso, o zebrafish rapinando taxa, ou seja, a taxa na qual zebrafish internalizar paramécios carregados de bactérias após incubação co, foi estudada. Zebrafish larval começam a caçar e capturar presas vivas de 5 dpf20, embora se verificou que, quando levantou a 30 ° C, o desenvolvimento larval é acelerado e animais Exibir comportamento predando de dpf 4. Rapinando é acompanhada por uma característica marcante do comportamento20 (Figura 2A), e a determinação da taxa predando baseia-se no pressuposto de que cada golpe leva à interiorização de um paramécio, embora isso só pode ser considerado um aproximação (ver discussão). Baseado em observações descritas neste documento de rapinar zebrafish larvas, a taxa de absorção de paramécios é aproximadamente 1.539 por h (Figura 2B).

figure-results-2
Figura 2: determinação da taxa predando zebrafish. (A) imagens de um vídeo predando, mostrando um zebrafish larvas (5 dpf) predando paramécios carregando bactérias fluorescentes. Tempo em [segundos]. A seta indica o principal eixo de circulação durante a greve. (B) a quantificação da taxa predando (ingestão de protozoários por hora), com base em n = 10 vídeos tomadas ao longo do tempo de exposição completa 2 h. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Após internalização dos protozoários, o zebrafish eficientemente degrada a rapina do foregut, liberando bactérias infecciosas no sistema digestivo. Conforme descrito neste documento, a degradação de paramécios procede rapidamente, e bactérias gratuito podem ser detectadas no trato intestinal dentro de 30 minutos de rapinar. Livre de bactérias, em seguida, mover-se do foregut para o intestino médio e posterior, onde eles são detectados cerca de 1 – 2 h após o início da pinça (Figura 3). Persistência bacteriana no intestino depende da espécie e dose, mas varia de h vários para vários dias no caso de e. coli e S. typhi. S. typhi localiza-se principalmente na mucosa intestinal, com alguma invasão epitelial (Figura 3D), levando à infiltração de neutrófilos no epitélio (Figura 3).

figure-results-3
Figura 3: colonização de zebrafish com bactérias. Zebrafish no dpf 5 foram deixados não infectado (A) ou colonizados com mCherry expressando (B) e. coli ou (C) S. enterica. Experimentos de infecção podem ser realizados em linhas transgénicas ou tipo selvagem (A e B) peixe (por exemplo, a linha Tg (MPO::EGFP) eu114 expressando verdes fluorescentes neutrófilos mostrados em (C). A abertura retal é marcada por uma flecha. (D) maior ampliação da seção intestinal de toda a montagem incorporadas larvas infectadas com infecção por Salmonella typhi . Azul (Di) = Hoechst marcando núcleos, roxo (Dii) = faloidina marcando F-Actina, vermelho (Diii) = Salmonella, mesclagem (Div). Barra de escala = 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Filme 1: imagens de vídeo de captura presas. Clique aqui para baixar este vídeo.

Discussão

O protocolo básico descrito aqui foi otimizado para a patogenicidade de e. colie foi adaptado com sucesso para outras espécies bacterianas, incluindo a Salmonella typhi e Vibrio cholerae. Para algumas espécies que não a colonizar o intestino de zebrafish após imersão de banho, incluindo algumas estirpes de typhi Salmonella e alguns anaeróbios, infecção de origem alimentar conforme descrito aqui pode ser usada para estabelecer com sucesso a colonização. Em comparação com microgavage, que também é usado para estabelecer elevados encargos bacterianos no trato intestinal larval, infecção de origem alimentar é tecnicamente menos desafiador e requer equipamentos menos especializados. No entanto, os parâmetros críticos devem ser otimizados para as espécies bacterianas e as tensões para ser usado. Tais fatores incluem a densidade bacteriana e paramécio para a etapa de co-cultura de bactérias-paramécio: se bacteriana números dentro paramécios são baixos, isto pode ser melhorado, aumentando a densidade bacteriana na etapa de co-cultura. Algumas espécies bacterianas podem causar danos ao host paramécio, e isto deve ser avaliado por microscopia.

Outro fator importante neste protocolo é a captura de presas por zebrafish. A taxa predando conforme descrito aqui é baseada no pressuposto de que cada captura de presas strike resultados na ingestão de um paramécio. Altas densidades de paramécios por peixes são usadas no protocolo para garantir altas taxas rapinando. No entanto, a captura de presas é dependente da densidade de protozoários no sistema, e em culturas muito diluído paramécio, predando taxas podem ser tão baixas quanto 13 – 15 paramécios por hora21,22. Uma limitação é que taxas de captura de presas também são fortemente dependentes em condições de iluminação e no escuro, as taxas de captura são 80% mais baixos do que em condições de luz21 e isso devem ter em conta quando a criação de experiências. Se os tempos de exposição a presa precisa ser expandida para otimizar a colonização, consideração deve ser dada à exposição secundária a bactéria através de fezes. Nas condições descritas acima – 2 h de exposição de rapina – esta exposição é negligenciável, desde que o tempo de passagem do intestino de bactérias é mais de 1h e a concentração de bactérias no veículo é muito maior do que nas fezes. No entanto, se o tempo de exposição de rapina é significativamente maior, isto pode tornar-se um fator significativo.

Controlos adequados devem ser incluídos no presente protocolo, incluindo a colonização do zebrafish seguindo alimentação com paramécios contendo não-patogênicas de Escherichia coli MG1655. Se várias estirpes bacterianas são comparadas pela sua capacidade de colonizar o zebrafish host, é importante testar se seus Half-Life dentro paramécios é comparável. Mutações bacterianas, incluindo aqueles comprometer a integridade da parede celular ou sensoriamento de ácido, podem comprometer a estabilidade bacteriana dentro de paramécios. Em tais casos, zebrafish alimentação tem que ser ajustado para dar conta das diferenças na dosagem.

O protocolo descrito aqui pode ser usado para investigar a colonização bacteriana e suas consequências, incluindo por imagem colonização bacteriana de zebrafish como descrito acima, bem como determinando CFU por zebrafish de tecido homogeneizado3, ou investigando a mortalidade e a morbidade associada a infecção. Idealmente, para visualização de bactérias, cepas bacterianas expressando proteínas fluorescentes, tais como mCherry ou proteína fluorescente vermelha (RFP) devem ser usadas. Isto permitirá a visualização do crescimento das populações bacterianas. Se a estirpe bacteriana não é geneticamente tractable ou o uso da expressão da proteína fluorescente é impedido por outras razões, bactérias podem ser coradas com um corante fluorescente, como FM 4-64FX, antes da cultura co com protozoários. Ao usar o protocolo descrito aqui, não diminui o brilho da tintura co-cultura com protozoários e bactérias coradas são claramente visíveis no intestino zebrafish. No entanto, a tintura será diluída ao longo do tempo deve ocorrer de significativa proliferação bacteriana dentro do host de zebrafish. Em ambos os casos, vermelho fluorescente bactérias são preferíveis sobre bactérias fluorescentes-verde, desde autofluorescência de tecido pode ser mais elevada no verde do que no canal vermelho.

Verificou-se que o presente protocolo pode ser adaptado para aeróbios e microaerofílicas espécies bacterianas. Pode ser possível adaptá-lo para a alimentação de esporos e espécies de fungos, embora isto continua a ser testada experimentalmente.

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer os membros do grupo Krachler para leitura crítica e comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi financiado por um prêmio de UT sistemas STAR e o BBSRC NIH (R01AI132354).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Paramecium caudatum,viva Carolina131554não armazene culturas em crescimento abaixo da temperatura ambiente
0,4% Solução de Azul de Tripano SigmaT8154-20MLlíquido, filtrado estéril, adequado para cultura de células; preparado em cloreto de sódio a 0,81% e fosfato de potássio a 0,06%, dimetilsulfóxido
dibásico (DMSO)Sigma276855-100MLarmazenar em um armário de segurança de solvente
Escherichia coli, MG1655ATCCATCC 700926pode ser substituído por qualquer outra cepa
não patogênica de E. coliFM 4-64FX manchaThermo FisherF34653alíquota e armazena congelado
FormaldeídoSigmaF8775-4X25ML
LB CaldoSigmaL3397-1KG
Comprimidos salinos tampolados com fosfatoThermo Fisher18912014
TetraciclinaSigma87128-25Gtóxico, irritante
Tricaine (etil 3-aminobenzoato metanosulfonato)SigmaE10521-10G
Triton X-100SigmaX100-100ML
Trypan Blue Solution, 0.4%Sigma93595-50ML
UltraPure Low Melting Point AgaroseThermo Fisher16520050
hemocitômetro ou contador de célulasqualquer
estereomicroscópioqualquer
Centrífuga
Roda
de Microondas
Aquecida Incubadora
Aquática Instalações
Tanques
de mesaRotadora de Criação de Animais

Referências

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