Artigo de método

Um sistema de indução de estomas agrupado por tratamento de imersão de solução de açúcar em plântulas de Arabidopsis thaliana

DOI:

10.3791/58951

⸱

15 de fevereiro de 2019

 , 
1Department of Integrated Frontier Sciences, The University of Tokyo, 2International Research Organization for Advanced Science and Technology, Kumamoto University

Neste artigo

Resumo

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O objetivo do presente protocolo é demonstrar como induzir estomas clusterizadas em cotilédones de plântulas de Arabidopsis thaliana por tratamento de imersão com uma solução de médio contendo açúcar e como observar estruturas intracelulares como cloroplastos e microtúbulos nas células guarda clusterizados usando confocal laser microscopia.

Resumo

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Movimento estomático Medeia troca gasosa planta, que é essencial para a fotossíntese e transpiração. Estomática de abertura e fechamento são realizados por um significativo aumento e diminuição do volume das células de guarda, respectivamente. Porque o transporte de transporte de íons e água ocorre entre as células guarda e células epidérmicas vizinhas maiores durante o movimento estomático, espaçada distribuição dos estômatos da planta é considerada uma distribuição ideal para o movimento estomático. Sistemas experimentais para perturbar o espaçamento padrão dos estomas são úteis para examinar o significado do padrão de espaçamento. Foram identificados vários genes chaves associados à distribuição estomática espaçada, e estômatos em cluster podem ser induzidos experimentalmente, alterando estes genes. Alternativamente, estomas em cluster podem ser também induzidas por tratamentos exógenos sem modificação genética. Neste artigo, descrevemos um sistema simples de indução para estomas clusterizados em plântulas de Arabidopsis thaliana por tratamento de imersão com uma solução de médio contendo sacarose. Nosso método é fácil e diretamente aplicável às linhas transgénicas ou mutantes. Cloroplastos maiores são apresentados como uma célula biológica marca registrada de induzida em sacarose clusterizadas células guarda. Além disso, uma imagem microscópica confocal representativa de microtúbulos corticais é mostrada como um exemplo de observação intracelular de células de guarda em cluster. A orientação radial de microtúbulos corticais é mantida nas células de guarda em cluster como em células de guarda espaçadas em controlar as condições.

Introdução

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O estoma de planta é um órgão essencial para a troca de gás para a fotossíntese e a transpiração e movimento estomático é realizado por mudanças significativas nas células de guarda a íon-driven captação e liberação de água. Sob um microscópio, podemos observar um padrão de distribuição espaçada de estômatos nas superfícies das folhas e caules. Esta distribuição espaçada de estomas é considerada para ajudar o movimento estomático, que é regulamentado pela troca de íons e água entre as células guarda e vizinhos células epidérmicas1,2. Sistemas de indução experimental de estomas em cluster são úteis para investigar a importância da distribuição espaçada dos estomas.

Tem sido relatado que a aglomeração espacial dos estomas pode ser induzida por modificação genética de genes-chave de3,de diferenciação celular guarda4 ou o tratamento com um composto químico5. Também informamos que tratamento de imersão com uma solução meio suplementado com açúcares, incluindo a sacarose, glicose, e frutose causou clusters estomática em cotilédones de plântulas de Arabidopsis thaliana 6. Callose reduzida em novas paredes celulares separando meristemoids e células epidérmicas foi observada na epiderme cotilédone tratados com sacarose, sugerindo que o tratamento de imersão de solução de sacarose afeta negativamente a parede celular, que impede o escapamento e ação ectópica de produtos do gene chave para diferenciação de célula guarda (por exemplo, fatores de transcrição) em direção ao lado epidérmica células6. Um mecanismo semelhante foi sugerido de estudos sobre gsl8/chor mutantes7,8. Nosso sistema experimental para indução pode ser reproduzido dos estomas em cluster usando sacarose, contendo solução média é bastante fácil e barato. Também pode ser usada para investigar as estruturas intracelulares como organelas e o citoesqueleto nas células guarda em cluster quando aplicado às linhas transgênicas expressando marcadores fluorescentes que rótulo estruturas intracelulares9, 10.

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Protocolo

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1. preparação da solução médio de 1/2 Murashige-Skoog 3% sacarose, contendo

  1. Adicione 1,1 g de sais médios Murashige-Skoog e 15 g de sacarose para um copo.
  2. Adicione 490 mL de água destilada e misture bem, usando uma barra de agitação.
  3. Ajuste o pH a 5.8 usando KOH.
  4. Diluir para 500 mL com água destilada e transferir a solução para um frasco médio.
  5. Esterilize a solução por autoclave (121 ° C, 20 min). Se não usado imediatamente, esta solução pode ser mantida a 4 ° C após a esterilização.

2. indução de estomas agrupadas por sacarose, contendo solução médio tratamento de imersão

  1. Esterilize as sementes.
    1. Preparar a solução de esterilização adicionando 500 µ l de cloro ativo 5% solução de NaClO e 1 µ l de 10% Triton X-100 de água estéril de 500 µ l.
    2. Coloque ca. 50 transgênicos sementes da . thaliana carregando um marcador fluorescente como CT-GFP11 ou GFP-TUB612 em um tubo de 1,5 mL.
    3. Adicione 1 mL de solução de etanol 70% e misturar bem invertendo-se cinco vezes. Deixe por 1 min.
    4. As sementes vão afundar até o fundo do tubo. Sobre uma bancada limpa, suavemente remover o etanol 70%, utilizando uma micropipeta e adicionar 1 mL de solução de esterilização. Misture bem invertendo-se cinco vezes e deixar por 5 min.
    5. Lave as sementes. Ainda trabalhando sob condições assépticas em uma bancada limpa, suavemente remover a solução usando uma micropipeta e adicionar 1 mL de água estéril. Repita essa etapa cinco vezes.
  2. Adicione 1,5 mL de 3% de sacarose, contendo 1/2 Murashige-Skoog média solução esterilizada a cada poço de uma placa de 24 sobre uma bancada limpa.
  3. Adicione duas sementes esterilizadas para cada poço. Fita a tampa sobre a placa de 24 usando duas camadas de parafilme.
  4. Transferir a placa de 24 para um conjunto de câmara de crescimento a 23,5 ° C, com um ciclo de claro-escuro de 12/12-h-h usando 100 µmol m− 2 s− 1 branco luz e incubar durante 14 dias.

3. observação microscópica dos estomas em cluster

  1. Lugar 30 µ l de 1/2 3% de sacarose, contendo Murashige-Skoog média solução de um poço da placa 24-bem no centro de uma lâmina de vidro (tamanho: 76 × 26 mm, espessura: 1.0-1.2 mm).
  2. Remova um cotilédone de uma muda de 14 dias de idade com uma tesoura de dissecação. Flutue o cotilédone com o lado de observação voltada para cima sobre a gota de solução.
  3. Prepare a amostra de cotilédone de acordo com nossos anteriores método13. Essencialmente, coloque 30 µ l da solução no centro de uma tampa de vidro (tamanho: 18 × 18 mm, espessura: 0,12-0,17 mm). Vire o tampa de vidro e coloque-o delicadamente sobre o cotilédone. Limpe o excesso buffer usando um pano livre de fiapos.
  4. Definir um espécime no palco de um microscópio confocal laser e selecionar as células de guarda em cluster para observação usando iluminação de campo claro.
  5. Adquira imagens confocal de estruturas intracelulares fluorescente rotuladas de acordo com as instruções do fabricante do microscópio.

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Resultados

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Aqui, foi apresentado o protocolo para um método simples de induzir estomática clusters com sacarose, contendo solução média em mudas da . thaliana . As células de guarda em cluster cultivadas em solução média contendo sacarose (Figura 1B) possuem cloroplastos maiores que guarda cultivados em condições de controle isento de sacarose (Figura 1A). O alargamento dos cloroplastos foi confirm...

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Discussão

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Nós apresentamos protocolos para indução dos estomas em cluster em mudas da . thaliana por tratamento de imersão com uma solução de médio contendo sacarose. Como mostrado aqui, esse método é muito simples e não requer nenhuma habilidade especializada mas eficiente pode induzir estomas em cluster. Mais de 45% das células guarda estão agrupadas com 3% de sacarose, contendo solução média (valores médios de mais de 20 observações independentes)6. Além disso, este sistema experimental pode dir...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Nós estamos gratos ao Prof Seiichiro Hasezawa pelo seu apoio gentil do nosso trabalho. Este trabalho foi financiado por doações da sociedade do Japão para a promoção da ciência (JSPS) KAKENHgrant números 17 19380 K e 18 H 05492, da Fundação de Sumitomo para um subsídio para projetos de pesquisa de ciência básica conceder número 160146 e a Fundação da Canon a T.H. Este sistema experimental foi desenvolvido sob um apoio financeiro do número JSPS KAKENHgrant 26891006 para K. A. Agradecemos a Robbie Lewis, MSc, do grupo de Emilia (www.edanzediting.com/ac) para a edição de um projecto do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de 24 poçosSumitomo BaqueliteMS-0824R
laser de 488 nmFurukawa DenkoHPU-50101-PFS2
Laser de 488 nmOlympusSapphire488-20/O
Filtro passa-longo de 510 nmOlympusBA510IF
524 - Filtro passa-banda de 546 nmSemrockFF01-535/22-25
Passa-curta de 530 nm filtroOlympusBA530RIF
laser de 561 nmCVI Melles Griot85-YCA-025-040
604 - 644 nm filtro passa-bandaSemrockFF01-624/40-25
Cabeça de varredura a laser confocalYokogawaCSU10
OlympusFV300
CâmeraCCD refrigeradaCoolSNAP HQ2
Software de aquisição de imagemMolecular DevicesMetaMorph versão 7.8.2.0
Software de aquisição de imagemOlympusFLUOVIEW v5.0
Óleo de imersãoÓleode imersão Olympus Óleo de imersão Type-Fne = 1.518 (23 graus)
Microscópio invertidoOlympusIX-70
Microscópio invertidoOlympusIX-71
Mistura de sal vegetal Murashige e SkoogFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation392-00591Murashige T e Skoog F (1962) Um meio revisado para crescimento rápido e bioensaios com culturas de tecidos de tabaco. Fisiologia Plantarum 15(3), 473-497.
Lente objetiva OlympusUPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35NA = 1.35
Lente objetiva OlympusUPlanAPO 40x / 0,85 NANA = 0,85
SacaroseFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation196-00015
Câmera CCD refrigerada

Referências

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  1. Raschke, K., Fellows, M. P. Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells. Planta. 101 (4), 296-316 (1971).
  2. Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).
  3. Bergmann, D. C., Sack, F. D. Stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 58, 163-181 (2007).
  4. Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Mechanisms of stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 63, 591-614 (2012).
  5. Sakai, Y., et al. The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells. Development. 144 (3), 499-506 (2017).
  6. Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion. PLOS One. 8 (9), 72456(2013).
  7. Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).
  8. Guseman, J. M., et al. Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8). Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).
  9. Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion. Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815(2018).
  10. Akita, K., Hasezawa, S. Sugar solution induces clustered lips. Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).
  11. Holzinger, A., Buchner, O., Lütz, C., Hanson, M. R. Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana. Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).
  12. Abe, T., Hashimoto, T. Altered microtubule dynamics by expression of modified α-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants. The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).
  13. Higaki, T. Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (106), 53437(2015).

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