Um sistema de indução de estomas agrupado por tratamento de imersão de solução de açúcar em plântulas de Arabidopsis thaliana

Resumo

O objetivo do presente protocolo é demonstrar como induzir estomas clusterizadas em cotilédones de plântulas de Arabidopsis thaliana por tratamento de imersão com uma solução de médio contendo açúcar e como observar estruturas intracelulares como cloroplastos e microtúbulos nas células guarda clusterizados usando confocal laser microscopia.

Resumo

Movimento estomático Medeia troca gasosa planta, que é essencial para a fotossíntese e transpiração. Estomática de abertura e fechamento são realizados por um significativo aumento e diminuição do volume das células de guarda, respectivamente. Porque o transporte de transporte de íons e água ocorre entre as células guarda e células epidérmicas vizinhas maiores durante o movimento estomático, espaçada distribuição dos estômatos da planta é considerada uma distribuição ideal para o movimento estomático. Sistemas experimentais para perturbar o espaçamento padrão dos estomas são úteis para examinar o significado do padrão de espaçamento. Foram identificados vários genes chaves associados à distribuição estomática espaçada, e estômatos em cluster podem ser induzidos experimentalmente, alterando estes genes. Alternativamente, estomas em cluster podem ser também induzidas por tratamentos exógenos sem modificação genética. Neste artigo, descrevemos um sistema simples de indução para estomas clusterizados em plântulas de Arabidopsis thaliana por tratamento de imersão com uma solução de médio contendo sacarose. Nosso método é fácil e diretamente aplicável às linhas transgénicas ou mutantes. Cloroplastos maiores são apresentados como uma célula biológica marca registrada de induzida em sacarose clusterizadas células guarda. Além disso, uma imagem microscópica confocal representativa de microtúbulos corticais é mostrada como um exemplo de observação intracelular de células de guarda em cluster. A orientação radial de microtúbulos corticais é mantida nas células de guarda em cluster como em células de guarda espaçadas em controlar as condições.

Introdução

O estoma de planta é um órgão essencial para a troca de gás para a fotossíntese e a transpiração e movimento estomático é realizado por mudanças significativas nas células de guarda a íon-driven captação e liberação de água. Sob um microscópio, podemos observar um padrão de distribuição espaçada de estômatos nas superfícies das folhas e caules. Esta distribuição espaçada de estomas é considerada para ajudar o movimento estomático, que é regulamentado pela troca de íons e água entre as células guarda e vizinhos células epidérmicas^1,2. Sistemas de indução experimental de estomas em cluster são úteis para investi....

Protocolo

1. preparação da solução médio de 1/2 Murashige-Skoog 3% sacarose, contendo

1. Adicione 1,1 g de sais médios Murashige-Skoog e 15 g de sacarose para um copo.
2. Adicione 490 mL de água destilada e misture bem, usando uma barra de agitação.
3. Ajuste o pH a 5.8 usando KOH.
4. Diluir para 500 mL com água destilada e transferir a solução para um frasco médio.
5. Esterilize a solução por autoclave (121 ° C, 20 min). Se não usado imediatamente, esta solução pode ser mantida a 4 ° C após a esterilização.

2. indução de estomas agrupadas por sacarose, contendo solução médio tratamento de imersão

1. Es....

Resultados

Aqui, foi apresentado o protocolo para um método simples de induzir estomática clusters com sacarose, contendo solução média em mudas da . thaliana . As células de guarda em cluster cultivadas em solução média contendo sacarose (Figura 1B) possuem cloroplastos maiores que guarda cultivados em condições de controle isento de sacarose (Figura 1A). O alargamento dos cloroplastos foi confirm.......

Discussão

Nós apresentamos protocolos para indução dos estomas em cluster em mudas da . thaliana por tratamento de imersão com uma solução de médio contendo sacarose. Como mostrado aqui, esse método é muito simples e não requer nenhuma habilidade especializada mas eficiente pode induzir estomas em cluster. Mais de 45% das células guarda estão agrupadas com 3% de sacarose, contendo solução média (valores médios de mais de 20 observações independentes)⁶. Além disso, este sistema experimental pode dir.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de 24 poços	Sumitomo Baquelite	MS-0824R
laser de 488 nm	Furukawa Denko	HPU-50101-PFS2
Laser de 488 nm	Olympus	Sapphire488-20/O
Filtro passa-longo de 510 nm	Olympus	BA510IF
524 - Filtro passa-banda de 546 nm	Semrock	FF01-535/22-25
Passa-curta de 530 nm filtro	Olympus	BA530RIF
laser de 561 nm	CVI Melles Griot	85-YCA-025-040
604 - 644 nm filtro passa-banda	Semrock	FF01-624/40-25
Cabeça de varredura a laser confocal	Yokogawa	CSU10
	Olympus	FV300
Câmera		CCD refrigeradaCoolSNAP HQ2
Software de aquisição de imagem	Molecular Devices	MetaMorph versão 7.8.2.0
Software de aquisição de imagem	Olympus	FLUOVIEW v5.0
Óleo de imersão	Óleo	de imersão Olympus Óleo de imersão Type-F	ne = 1.518 (23 graus)
Microscópio invertido	Olympus	IX-70
Microscópio invertido	Olympus	IX-71
Mistura de sal vegetal Murashige e Skoog	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	392-00591	Murashige T e Skoog F (1962) Um meio revisado para crescimento rápido e bioensaios com culturas de tecidos de tabaco. Fisiologia Plantarum 15(3), 473-497.
Lente objetiva	Olympus	UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35	NA = 1.35
Lente objetiva	Olympus	UPlanAPO 40x / 0,85 NA	NA = 0,85
Sacarose	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	196-00015

Câmera CCD refrigerada