Um protocolo de aço inoxidável para isolamento de RNA de alta qualidade do Laser capturar células de Microdissected Purkinje no cerebelo humano Post Mortem

Resumo

Este protocolo utiliza uma abordagem de mancha-livre para visualizar e isolar as células de Purkinje no tecido fresco congelado do cerebelo humano post mortem através do laser microdissection de captura. O propósito do presente protocolo é gerar quantidades suficientes de RNA de alta qualidade para a sequenciação do ARN.

Resumo

Captura de laser microdissection (LCM) é uma ferramenta vantajosa que permite a recolha de células tumorais e/ou fenotipicamente relevantes ou regiões de tecidos heterogêneas. Capturado do produto pode ser usado em uma variedade de métodos moleculares para proteína, isolamento de DNA ou RNA. No entanto, a preservação do RNA do tecido do cérebro humano após a morte é especialmente desafiador. Técnicas de visualização padrão para LCM exigem histológica ou procedimentos de coloração imuno-histoquímica que ainda podem degradam o RNA. Portanto, nós projetamos um protocolo de aço inoxidável para visualização no LCM com a finalidade de preservar a integridade do RNA no tecido do cérebro humano de post-mortem. A célula de Purkinje do cerebelo é um bom candidato para visualização de aço inoxidável, devido ao seu tamanho e localização característica. O córtex cerebelar tem camadas distintas que diferem em densidade celular, tornando-os um bom arquétipo para identificar sob microscopia de alta ampliação. Células de Purkinje são grandes neurônios situados entre a camada de células grânulo, que é uma rede densamente celular de pequenos neurônios, e a camada molecular, que é escassa em corpos celulares. Por causa dessa arquitetura, o uso de visualização de aço inoxidável é viável. Outros sistemas do órgão ou célula que imitam este fenótipo também seria adequados. O protocolo de aço inoxidável é projetado para reparar o tecido fresco congelado com etanol e remover os lipídios com xilol para uma melhor visualização morfológica sob microscopia de luz de alta ampliação. Este protocolo não leva em conta outros métodos de fixação e é projetado especificamente para amostras de tecido fresco congelado capturadas usando uma radiação ultravioleta (UV)-sistema de LCM. Aqui, apresentamos um protocolo completo para corte e fixação tecido cerebelar humano fresco congelado post-mortem e purificação de RNA a partir de células de Purkinje isoladas por UV-LCM, preservando a qualidade do RNA para subsequente-a sequenciação do ARN. Em nossas mãos, este protocolo produz níveis excepcionais de visualização celular sem a necessidade de coloração reagentes e produz RNA com números elevados de integridade do RNA (≥ 8) conforme necessário para experimentos de perfil transcricionais.

Introdução

Do laser captura microdissection (LCM) é uma ferramenta valiosa pesquisa que permite a separação das células patologicamente relevantes para posterior avaliação molecularmente orientada. O uso de análises moleculares nestes espécimes de tecido heterogêneo e a correlação com dados clínicos e patológicos é um passo necessário na avaliação o significado translacional de pesquisa biológica¹. Ao analisar dados da expressão do gene do RNA, o uso de seções do tecido congelado é altamente recomendado pois permite excelente qualidade de RNA bem como maximizada quantidade². Tem sido bem estabelecida que alta qualidade e a quantida....

Protocolo

Todas as amostras humanas utilizadas neste protocolo foram obtidas com consentimento informado e foram aprovadas pelo interno Review Board (IRB), na Universidade de Columbia e Yale University.

Nota: A totalidade do presente protocolo deve seguir rigoroso RNA manipulação orientações, por meio de que uma mão enluvada sempre é usada, todas as superfícies são limpas com uma desinfecção de RNase e todos os materiais de trabalho são de RNA/DNA/Nuclease livre.

1. teste a integridade do RNA do tecido antes de começar a LCM

Nota: Teste de qualidade de RNA pode se....

Resultados

Este protocolo detalha as etapas para preparar o tecido do cérebro humano fresco congelado post-mortem para UV-LCM. Anotações e minuciosos especificações são dadas para cortes de criostato, como pode ser difícil de cortar o tecido de cérebro congelado fresco com um alto grau de precisão. O ponto mais importante a considerar é que o tecido congelado fresco é extremamente frio e requer uma quantidade significativa de tempo se aclimate à temperatura mais quente de um criostato. Esta etapa nã.......

Discussão

O protocolo aqui apresentado é modificado especificamente para ser uma abordagem de aço inoxidável em Visualizar morfologicamente distintos tecidos para UV-LCM. Este método foi projetado para maximizar a integridade do RNA para subsequentes direto a sequenciação do ARN, mantendo um nível aprimorado de visualização do tecido. A capacidade de distinguir diferentes tipos de células para captura, para criar a população de células mais pura possível, é essencial para a compreensão de diferentes perfis moleculares em tecidos h.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
MembraneSlide NF 1.0 PEN	Zeiss	415190-9081-000	Lâminas de membrana para tecido. Não recomendamos o uso de lâminas de vidro.
AdhesiveCap 500 Opaque	Zeiss	415190-9201-000	As tampas opacas são usadas para melhorar a visualização apenas em escopos invertidos
RNase	Away Molecular BioProducts	7005-11	Outros produtos de descontaminação RNase também são adequados. Use para limpar todas as superfícies antes do trabalho.
200 Prova de Etanol	Decon Laboratories	2701	Se estiver usando etanol alternativo, garanta alta qualidade. Essencial para a fixação do tecido.
Xilenos (Certificado ACS)	Fisher Scientific	X5P-1GAL	Se estiver usando xileno alternativo, garanta alta qualidade. Essencial para a visualização do tecido.
Água Destilada UltraPura	Invitrogen	10977-015	Outra água livre de RNA/DNA/Nuclease também é adequada. Utilizado apenas na diluição de etanol.
Frascos de Slides Slide-Fix	Evergreen	240-5440-G8K	Qualquer porta-slides/jarra também é adequado. Deve ser limpo antes do uso. Usado para fixação após seccionamento.
Placa Anti-Roll, Assy. 70 mm 100 μ m	Leica Biosystems	14041933980	tipo de placa estabilizadora é determinado pelo tipo de criostato e localização da fixação no palco. Todos os criostatos têm requisitos diferentes.
Dietil pirocarbonato (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758-50mL	DEPC de qualquer fornecedor servirá. Siga as instruções para tratamento de água.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Os Kimwipes podem ser encomendados de qualquer fornecedor e usados em qualquer tamanho. Kimwipes são para ser usados para limpar microscópio e criostato.
Composto Tissue-Plus O.C.T. Fisher	Scientific	23-730-571	Qualquer marca de OCT é aceitável. Nenhum tecido será embutido na OCT, é difícil anexar o tecido ao 'mandril'.
Lâminas de micrótomo de baixo perfil Edge-Rite	Thermo Scientific	4280L	O tipo de lâmina é determinado pelo tipo de criostato. Todos os criostatos têm requisitos diferentes.
Leica Microsystems 3P  MANDRIS DE CRIOSTATO DE 25 + 30 MM	Fisher Scientific	NC0558768	O tipo de mandril é determinado pelo tipo de criostato. Todos os criostatos têm requisitos diferentes. Qualquer tamanho é adequado.
RNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	74004	Necessário para extração de RNA pós-LCM. O tampão de lise RLT é essencial para coletar células capturadas da tampa opaca.
RNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104	Necessário para extração de RNA de preparações de seção, que são realizadas antes do LCM para testar a integridade do RNA dos tecidos iniciados.
Conjunto de DNase livre de RNase	Qiagen	79254	Dnase removerá qualquer DNA para permitir uma população de RNA puro. Garanta que o Dnase seja fresco.
2-Mercaptoetanol	Sigma Aldrich	M6250-100ML	Volume comprado a critério do usuário. Necessário para adição ao tampão RLT para lise celular. Previne a atividade da RNase.
Globo Científico  Lote de Tubo de Microcentrífuga Graduado Certificado (2 mL)	Fisher Scientific	22-010-092	Qualquer tubo de 2 mL que seja livre de RNase, DNase, DNA humano e pirogênio serve para servir.