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Artigo de método

Um protocolo de aço inoxidável para isolamento de RNA de alta qualidade do Laser capturar células de Microdissected Purkinje no cerebelo humano Post Mortem

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DOI:

10.3791/58953

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17 de janeiro de 2019

 ,  , 
1Department of Pathology and Cell Biology, Columbia University, 2Division of Movement Disorders, Department of Neurology, Yale University, 3Department of Chronic Disease Epidemiology, Yale School of Public Health, Yale University, 4Center for Neuroepidemiology and Clinical Neurological Research, Yale School of Medicine, Yale University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo utiliza uma abordagem de mancha-livre para visualizar e isolar as células de Purkinje no tecido fresco congelado do cerebelo humano post mortem através do laser microdissection de captura. O propósito do presente protocolo é gerar quantidades suficientes de RNA de alta qualidade para a sequenciação do ARN.

Resumo

Captura de laser microdissection (LCM) é uma ferramenta vantajosa que permite a recolha de células tumorais e/ou fenotipicamente relevantes ou regiões de tecidos heterogêneas. Capturado do produto pode ser usado em uma variedade de métodos moleculares para proteína, isolamento de DNA ou RNA. No entanto, a preservação do RNA do tecido do cérebro humano após a morte é especialmente desafiador. Técnicas de visualização padrão para LCM exigem histológica ou procedimentos de coloração imuno-histoquímica que ainda podem degradam o RNA. Portanto, nós projetamos um protocolo de aço inoxidável para visualização no LCM com a finalidade de preservar a integridade do RNA no tecido do cérebro humano de post-mortem. A célula de Purkinje do cerebelo é um bom candidato para visualização de aço inoxidável, devido ao seu tamanho e localização característica. O córtex cerebelar tem camadas distintas que diferem em densidade celular, tornando-os um bom arquétipo para identificar sob microscopia de alta ampliação. Células de Purkinje são grandes neurônios situados entre a camada de células grânulo, que é uma rede densamente celular de pequenos neurônios, e a camada molecular, que é escassa em corpos celulares. Por causa dessa arquitetura, o uso de visualização de aço inoxidável é viável. Outros sistemas do órgão ou célula que imitam este fenótipo também seria adequados. O protocolo de aço inoxidável é projetado para reparar o tecido fresco congelado com etanol e remover os lipídios com xilol para uma melhor visualização morfológica sob microscopia de luz de alta ampliação. Este protocolo não leva em conta outros métodos de fixação e é projetado especificamente para amostras de tecido fresco congelado capturadas usando uma radiação ultravioleta (UV)-sistema de LCM. Aqui, apresentamos um protocolo completo para corte e fixação tecido cerebelar humano fresco congelado post-mortem e purificação de RNA a partir de células de Purkinje isoladas por UV-LCM, preservando a qualidade do RNA para subsequente-a sequenciação do ARN. Em nossas mãos, este protocolo produz níveis excepcionais de visualização celular sem a necessidade de coloração reagentes e produz RNA com números elevados de integridade do RNA (≥ 8) conforme necessário para experimentos de perfil transcricionais.

Introdução

Do laser captura microdissection (LCM) é uma ferramenta valiosa pesquisa que permite a separação das células patologicamente relevantes para posterior avaliação molecularmente orientada. O uso de análises moleculares nestes espécimes de tecido heterogêneo e a correlação com dados clínicos e patológicos é um passo necessário na avaliação o significado translacional de pesquisa biológica1. Ao analisar dados da expressão do gene do RNA, o uso de seções do tecido congelado é altamente recomendado pois permite excelente qualidade de RNA bem como maximizada quantidade2. Tem sido bem estabelecida que alta qualidade e a quantidade de RNA são essenciais para dados significativos de sequenciamento de RNA3. No entanto, quando usando o RNA do tecido fresco congelado post-mortem para LCM, degradação de RNA é um grande desafio, como ocorre imediatamente após a morte e sua extensão é mediada por diversos fatores associados com o tecido coleção método4,5 . Além disso, degradação de RNA é agravada quando as técnicas de coloração são necessários para reconhecer detalhes histológicos e identificação de célula. Especializou-se de técnicas, como a hematoxilina & eosina, Nissl mancha, de coloração imunofluorescência e imunohistoquímica são úteis na diferenciação de células do estroma circundante, mas têm sido mostrados para degradar o RNA e alterar a expressão de transcrição perfis de6. Portanto, nosso laboratório criou um protocolo inoxidável projetado especificamente para preservar o RNA no cerebelo humano post mortem para fins de sequenciação do ARN, após isolamento de LCM de neurônios de Purkinje.

No processamento de tecido congelado fresco para o LCM, o método de fixação variàvel pode afetar a integridade tanto do RNA e tecido. Fixação de formalina é padrão para preservação morfológica, mas causas do cross-linking que podem fragmentar o RNA e interferir de amplificação do RNA7. Fixação de etanol é uma alternativa melhor para o isolamento de RNA, como é um hemostático fixador que não induz a do cross-linking1. Para melhorar a visualização da morfologia do tecido, xileno é a melhor escolha, como ele remove lipídios do tecido. No entanto, existem conhecidas limitações quando utilizando o xileno no LCM, como os tecidos podem secar e tornar-se frágil causando fragmentação de tecido em cima do laser captura7. Xileno também é uma toxina volátil e deve ser manuseado corretamente em uma coifa. Não obstante, xileno foi mostrado para melhorar a visualização do tecido preservando também RNA integridade8. Portanto, nosso protocolo centros em torno do uso de fixação de etanol 70% e desidratação do etanol, seguido de incubação xileno para clareza morfológica.

É importante observar os diferentes tipos de sistemas baseados em laser microdissection, como eles têm sido mostrados para diferem em velocidade, precisão e qualidade do RNA. O laser de infravermelho (IR) capturar microdissection e os sistemas de microdissection microbeam de laser ultravioletas (UV) foram as duas plataformas de LCM romance que surgiu quase simultaneamente8. O sistema IR-LCM emprega um sistema de"contacto" usando um filme termoplástico transparente colocado diretamente na seção de tecido, e as células de interesse seletivamente aderirem ao filme por pulsos de concentrado de um laser de IR. Alternativamente, o UV-LCM é um sistema "non-contact" no qual um feixe de laser focalizado corta fora as células ou regiões de interesse no tecido; dependendo da configuração em duas plataformas comerciais atualmente disponíveis que usam qualquer um microscópio invertido ou vertical design, tecido é adquirido em um dispositivo de recolha por uma onda de pressão induzida por laser que catapulta-lo contra a gravidade ou tecido é coletados por gravidade, respectivamente. Vantagens significativas do sistema UV-LCM incluem aquisição de celular mais rápida, coleção livre de contaminação com a abordagem de não-contato e dissecação mais precisa devido a um muito menor laser feixe diâmetro9. Este protocolo foi projetado especificamente para um sistema de UV-LCM e não foi testado em um sistema de IR-LCM. Em qualquer projeto de sistema de UV-LCM, quando acumuladas células na PAC coleção, o uso de uma lamela que aumenta a clareza celular durante a microscopia não é apropriada, como as células seriam incapazes de entrar o cap de coleção. Portanto, para melhorar a visualização do tecido, testamos o uso de tampões de coleção opaco, que são projetados para agir como uma lamela para visualização microscópica em sistemas UV-LCM, contra tampões coleção cheia de líquido. Tampões de coleção cheia de líquido podem ser um desafio, como o líquido está sujeito a evaporação e deve ser substituído frequentemente enquanto estiver trabalhando no microscópio. Tempo torna-se um fator importante para a estabilidade do RNA, como o tecido capturado imediatamente dissolve7.

Nosso laboratório estuda as alterações post-mortem de contrair no cerebelo dos pacientes com tremor essencial (ET) e doenças neurodegenerativas relacionadas do cerebelo. Temos demonstrado alterações morfológicas centradas nas células de Purkinje que distinguem ET casos versus controles, incluindo um número reduzido de células de Purkinje, aumentaram dendrítica regressão e uma variedade de alterações axonal, levando-na postular que Purkinje degeneração celular é um recurso biológico núcleo ET patogênese10,11,12,13. Perfil transcricional serviu em muitas doenças neurológicas para explorar a base molecular subjacente de alterações degenerativas do celulares. No entanto, perfis transcriptional de amostras heterogêneas, como regiões de tecido do cérebro, podem efetivamente mascarar a expressão de transcritos de baixa abundância e/ou diminuir a detecção de alterações moleculares que ocorrem apenas em uma pequena população de afetados células, como células de Purkinje do córtex cerebelar. Por exemplo, células de Purkinje são vastamente em desvantagem pelas células grânulo abundantes no córtex cerebelar por aproximadamente 1:3000; assim, para efetivamente alvo seu transcriptome exige isolamento específico destes neurônios. O córtex cerebelar é delineado por camadas distintas que diferem em densidade celular e tamanho da célula. Essa arquitetura celular é ideal para visualizar em uma amostra de tecido fresco congelado sem tintura contendo reagentes de coloração. Em teoria, este protocolo também poderia ser aplicado a outros tipos de tecidos que têm tecido característico semelhante organização.

Este protocolo foi projetado para trabalhar especificamente para visualização de células de Purkinje no cerebelo humano post mortem. Inúmeros protocolos existem para a fixação, de coloração, para efeitos de ambos os IR - e UV-LCM, visualização e preservação de RNA de muitos tipos de tecidos. Quando contemplando um projeto experimental para UV-LCM, indivíduos devem adaptar seu protocolo para melhor atender as necessidades e requisitos da inicial e final de materiais. Aqui, nós combinamos muitos aspectos dos diferentes protocolos de LCM para fornecer um método aprimorado para a visualização de células de Purkinje no cerebelo humano sem a necessidade de corante contendo reagentes coloração para preparar RNA de alta qualidade para transcriptome post-mortem sequenciamento.

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Protocolo

Todas as amostras humanas utilizadas neste protocolo foram obtidas com consentimento informado e foram aprovadas pelo interno Review Board (IRB), na Universidade de Columbia e Yale University.

Nota: A totalidade do presente protocolo deve seguir rigoroso RNA manipulação orientações, por meio de que uma mão enluvada sempre é usada, todas as superfícies são limpas com uma desinfecção de RNase e todos os materiais de trabalho são de RNA/DNA/Nuclease livre.

1. teste a integridade do RNA do tecido antes de começar a LCM

Nota: Teste de qualidade de RNA pode ser feito por vários métodos. Certifique-se de que o RNA da seção inteira é testado para fornecer um número representativo de integridade do RNA (RIN) para a amostra.

  1. Selecione cuidadosamente as amostras de tecido para a inclusão que se encaixam dentro do parâmetro do design experimental. Se cortar no criostato, mova-se para a etapa 1.2. Se não, processar o tecido em conformidade e mover a passo 1.11.
  2. Pegue dois recipientes de gelo seco. O tamanho vai depender do número de amostras.
    1. No primeiro recipiente de gelo seco, coloque um tubo vazio, etiquetado 2ml com o código do tecido.
      Nota: Leva 10 min para os tubos congelar. Os tubos devem ser congelados antes de colocar o tecido neles; caso contrário, o tecido vai derreter a superfície do tubo.
    2. Em um segundo recipiente de gelo seco, coloque o tecido de um freezer-80 ° C que requer verificação de RNA.
  3. Limpe o criostato. Veja passo 4.7 para detalhadas do procedimento de limpeza.
  4. Remova o tecido de gelo seco e cortar uma parte pequena do tecido com uma lâmina de barbear de RNase descontaminado. Tecido deve ser de aproximadamente 1 cm x 1 cm de tamanho.
  5. Coloque um monte de elevado aproximadamente 3 mm da temperatura de corte ideal (OCT) composto em um criostato 'chuck' e deixe congelar parcialmente. Em seguida, coloque o tecido em cima da OCT — não empurrar em OCT, simplesmente deixe-a descansar em cima.
  6. Quando OCT endurece, coloque o chuck com o tecido montado no braço de corte criostato e posição na frente da lâmina do criostato.
  7. Apare a 30 μm seções até que o tecido é o mesmo.
  8. Corte a 300 μm da tecido e coloque em um tubo congelado 2 mL. Coloque o tubo de volta em gelo seco.
  9. Retire o tecido do 'chuck' e coloque volta em gelo seco até estar pronto para guardar.
  10. Repita as etapas de 1,4-1,9 para todos os tecidos.
  11. Uma vez que todas as amostras estão completas, extraia o RNA usando o kit de extração de RNA fornecido (Tabela de materiais #15). Um protocolo detalhado é fornecido com o kit de extração de RNA. Siga todas as instruções que incluindo a etapa opcional para secar a membrana do tubo de coleta e a etapa opcional para a digestão de DNase (Tabela de materiais #16).
  12. Teste a integridade do RNA extraído através de uma avaliação de qualidade bioanalyzer14.

2. preparar antes de começar corte para LCM

  1. Limpe os suportes de slides antes de cada rodada de corte de tecido para o LCM. Execute o procedimento de limpeza o dia antes da utilização para permitir a completa secagem durante a noite.
    Nota:     suportes de lâmina são utilizados para fixação de secção de tecido em etanol e compensação em xilol.
    1. Deslize o titular procedimento de limpeza: enxaguar com desinfecção RNase seguida de dietilo pyrocarbonate Tratado (DEPC) água. Deixe secar durante a noite de cabeça para baixo em uma superfície livre de RNA/DNA/Nuclease, evitando qualquer poeira ou outros elementos de contaminação atmosférica.
      Atenção: DEPC é altamente tóxico e deve ser tratado e eliminado do uso de EH & S protocolo padrão produtos químicos perigosos.
  2. Limpar as escovas para corte com RNase decontaminator e deixe secar durante a noite. Evite toda a poeira e outros contaminadores.
  3. Coloque as lâminas de membrana sob UV luz por 30 min à temperatura ambiente. Fazer não exponha que os slides para UV mais de 1 – 2 dias antes de usam. Isso aumenta a ligação do tecido para o slide de membrana.
    Nota: Etapa 2.3 pode ser combinada com o passo 4, que permite o tratamento UV para ocorrer no mesmo dia que o tecido corte (ver passo 4.4) slide.

3. Preparar soluções de fixação com água livre de RNase e etanol de alta qualidade

Nota: Todas as soluções são preparadas fresco para cada experimento. Certifique-se de que o titular de slide limpeza procedimento de etapa 1.1 é concluído. Todas as soluções são preparadas em suportes de lâmina.

  1. Coloque 30 mL de etanol a 100% no suporte de um slide.
  2. Etanol diluído com água livre de RNase/DNase/Nuclease. Lugar 30 mL de etanol a 95% em um slide titular e colocar no gelo.
  3. Etanol diluído com água livre de RNase/DNase/Nuclease. Lugar 30 mL de etanol a 70% em um slide titular e colocar no gelo.
  4. Lugar 30 mL de xileno 100% em dois suportes de lâmina de separar e classificá-los como #1 e #2.

4. prepare o criostato para seccionamento de tecido

  1. Pegue um balde de gelo para soluções de etanol e um recipiente com gelo seco para o tecido.
    Atenção: Gelo seco é extremamente frio, portanto, use luvas de proteção. Não coloque gelo e gelo seco no mesmo recipiente. Diferentes temperaturas no gelo e gelo seco causará-los para formar juntos a uma temperatura indeterminada.
  2. Retire o tecido do congelador-80 ° C e lugar em gelo seco para o transporte para o criostato.
  3. Configurações do criostato:
    1. Defina a espessura de corte de 14 μm.
    2. Defina a espessura de guarnição para 30 μm para preservar a quantidade de tecido.
    3. Para criostatos com câmara dupla e espécime mantendo temperaturas, definir a temperatura da câmara (CT) de-18 ° C. Para criostatos com uma configuração, defina a temperatura de-17 ° C.
    4. Para criostatos com câmara dupla e espécime mantendo a temperatura, regule a temperatura do objeto (OT)-16 ° c.
      Nota: O OT precisa ser mais quente que o CT para garantir o mesmo corte. Se o tecido ainda tá arrebentando, OT pode ser aumentada para-15 ° C e o CT pode ser aumentada a-18 ° C.
  4. Coloque o tecido em criostato pelo menos 20 min permitir para vir à temperatura ideal.
    Nota: Se o tecido não é a temperatura ideal, isso vai destruir após corte. Não coloque o tecido em-20 ° C na noite anterior para preservar a integridade do RNA e para evitar a formação de cristais de gelo. Permitir que o tecido tanto tempo como necessário para equilibrar a temperatura ideal para cortar sem problemas. Aplicação opcional de incubação slide sob UV pode ocorrer aqui (veja etapa 1.3).
  5. Coloque o 'chuck' em criostato pelo menos 20 min permitir para descer a temperatura do criostato.
  6. Coloque as escovas limpas no criostato pelo menos 20 min permitir para descer a temperatura do criostato.
  7. Limpar o criostato
    1. Limpe o palco com uma mistura 1:1 de álcool etílico de desinfecção e 70% de RNase diluído com água livre de RNA/DNA/Nuclease para evitar o congelamento no palco.
    2. Limpe uma nova lâmina descartável criostato com desinfecção de RNase e coloque no porta-lâmina no palco. Permitir que pelo menos 20 min. para a lâmina criostato à temperatura do criostato.
    3. Limpe a placa anti-roll com desinfecção de RNase e anexar para o palco. Permitir que pelo menos 20 min. para a placa anti-roll vir para a temperatura do criostato.
      Nota: Uma placa não é necessária para o corte, mas é altamente recomendada. Se uma placa anti-roll não estiver disponível, um pincel limpo funciona como uma alternativa. Se a placa não estiver na temperatura correta, o tecido irá derreter ou ficar em cima do corte.

5. corte o tecido

  1. Corte um pequeno pedaço do tecido (~ 1 cm x 1 cm) para corte. Retorne o tecido restante ao congelador de ° C-80 gelo seco.
    Nota: Certifique-se de que a secção de tecido é córtex cerebelar ~ 95%, onde se situam as células de Purkinje.
  2. Coloque um monte de elevado aproximadamente 3 mm da OCT para cobrir o 'chuck'. Comece a construir as camadas por cima em um movimento circular, lento, até que haja um pequeno monte.
  3. Uma vez OCT é parcialmente congelado, mas ainda há um pouco de líquido no centro, coloque o tecido em cima da OCT. Não empurre o tecido profundamente em outubro Allow o tecido para sentar em cima de OCT até completamente congelado. Isto levará de 1 a 2 min.
  4. Coloque o 'chuck' com OCT congelado e o tecido dentro do braço de corte do criostato. Ajuste o tecido de forma nivelada com a lâmina de corte.
  5. Permitir que o tecido se sentar no braço corte por 15 – 20 min para se adaptar à nova temperatura.
    Nota: Dependendo da espessura do tecido, o tempo é necessário para a aclimatação de temperatura. Permitir que o tecido ficar quanto tempo necessário para cortar de forma limpa. Ajuste o OT e CT para ajudar com a aclimatação de temperatura do tecido.
  6. Mova lentamente o tecido mais perto da lâmina. Uma vez que o tecido alcançou a lâmina, inicie o processo de acabamento. Espessura de corte deve ser definida como 30 μm.
  7. Guarnição 2 – 3 x até as camadas do córtex são visíveis.
  8. Coloque e alinhe a placa anti-roll logo acima da lâmina do criostato.
    Nota: Uma linha de prata aparecerá da luz em criostato na interface da lâmina e placa anti-roll. Isso indica que a placa anti-roll é diretamente sobre a borda da lâmina.
  9. Comece a cortar as seções em 14 μm. Seções de corte corretamente será plana sob a placa anti-roll.
    Nota: Se o tecido é preso, certifique-se de que a placa anti-roll é fria o suficiente. Se necessário, colocar um pedaço de seco gelo na vontade externa (lado não tocar o palco) rapidamente esfriar a placa anti-roll.
  10. 4 – 6 seções de corte e alinhá-los horizontalmente no palco do criostato.
  11. Pesca do slide, pegar todas as peças do tecido de uma só vez.
    Nota: Usando os pincéis, levante as extremidades do tecido a ser mais prontamente disponível para o slide em cima da pick-up. Não pegue uma seção de cada vez. Exposição a temperatura ar degradará a integridade do RNA.
    Atenção: Não deixe que a membrana tocar a fase do criostato. Se a membrana toca o palco, ele vai começar a desconectar-se da lâmina de vidro e causará erros ao tentar LCM.
  12. Afastar-se imediatamente para a etapa 6. Não atrase a fixação.

6. fixação de tecido/mancha-menos visualização

  1. Afastar-se imediatamente para o protocolo de fixação de etanol
  2. Coloque o slide no porta corrediça com etanol a 70% por 2 min — no gelo.
  3. Coloque o slide no porta corrediça com etanol a 95% para 45 s — no gelo.
  4. Coloque o slide no porta corrediça com 100% de etanol por 2 min — no RT
  5. Mergulhe o slide 3 vezes no porta-lâmina com xilol 1 — no RT
  6. Coloque o slide no porta corrediça com xilol 2 por 5 min — no RT
  7. Deixe para secar em uma área limpa pelo menos 30 min. tempos de seca mais longos são ideais, a 60 min.
    Atenção: Levante-se slides para secar em uma coifa. Xileno é volátil. Slides postura plana causará xileno para piscina na seção de tecido, o que fará com que tecido ser muito escuro.

7. opcional — Armazenamento de Slide

  1. Coloque slides secas em tubos individuais de 50 mL (um slide por tubo) e coloque no congelador a-80 ° C por até 7 dias.
    Nota: Slides devem estar secos antes de colocar no congelador a-80 ° C. Não utilize o dessecante dentro do tubo como partículas irão incorporar no tecido e membrana. Certifique-se de que a tampa do tubo é apertada; caso contrário, a condensação ocorrerá no slide quando descongelar para uso.
    Atenção: Integridade do RNA diminui após 7 dias, como faz a qualidade de visualização do tecido.

8. descongelar armazenado Slides para uso

  1. Retire o tubo com um único slide do congelador a-80 ° C 1 h antes da utilização.
  2. Não abra imediatamente o tubo. Deixe os tubos para a temperatura. Condensação ocorrerá do lado de fora do tubo somente.
  3. Uma vez que o tubo chegou à temperatura e condensação todos desapareceu (aproximadamente 30 – 40 min), retire a tampa e expor o slide para o ar em temperatura ambiente.
  4. Permitir que o slide se adaptar à temperatura ambiente por 15 – 20 min deixe o slide dentro do tubo com a tampa removido.
    Nota: Slide está pronto para o LCM.

9. laser Microdissection de captura das células de Purkinje:

Nota: Esta seção do protocolo só irá discutir detalhes relacionados a captura de células de Purkinje para a sequenciação do ARN subsequente. Esta seção pressupõe que o usuário está familiarizado com o microscópio de captura do laser UV e o software afiliado.

  1. Limpar o palco do microscópio e a colecção de armar-se com desinfecção de RNase.
  2. Com as mãos enluvadas, coloque a lâmina no microscópio e tampa opaca de 500 μL no braço coleção.
    Nota: Sempre certifique-se de técnica adequada de RNA pela limpeza da área de trabalho com desinfecção de RNase e usar as mãos enluvadas enquanto toca o slide ou tampa opaca. As luvas podem ser removidas uma vez o slide e a tampa no lugar e tenha iniciado a captura do laser.
  3. Na ampliação baixa, alinhe a tampa opaca sobre o tecido cerebelar, garantindo que a PAC cobre toda a área visualizada na parte do olho.
    Nota: Apenas a parte do olho do microscópio mostrará se a tampa opaca é centralizada. A câmera não vai mostrar se a tampa está centrada sobre o tecido. Dependendo do design de escopo de captura do laser, a visualização através da tampa opaca ou será o pedaço de olho único ou visualizados na parte do olho e a câmera.
  4. Visualize as camadas Cerebelares com 5x - lente objetiva de 10x e coloque o cursor sobre a seção onde a camada molecular e camada de célula grânulo cruzam (a camada de células de Purkinje).
  5. Mover para 40 X e visualize as células de Purkinje.
    Nota: Consulte a Figura 1 e Figura 2 para visualizações de exemplo.
  6. Começa a captura de células de Purkinje.
    Nota: Para executar a sequenciação do ARN, pelo menos 5 ng do RNA é necessária. Cerca de 1600 – 2000 Purkinje células resultam em material suficiente do RNA para sequenciamento. RNA será estável por até 8 h no microscópio. Energia de teste UV e UV foco antes da coleção para garantir que os níveis estão corretos. Ao longo do tempo, o tecido continuará a secar e a energia UV e UV foco talvez precise ser alterado.

10. RNA coleção post LCM

  1. Preparar a lise celular (prepare fresco cada vez)
    1. Diluir com 2-Mercaptoetanol em tampão de Lise em 1: 100 (10 mL de μL:1, respectivamente). Lise (RLT) é fornecido na Tabela de materiais (#14 e #15).
  2. Adicione 50 μL de tampão de lise celular para a tampa opaca, com a tampa virada para cima. Feche cuidadosamente o tubo sobre o cap.
  3. Deixe o tubo de cabeça para baixo por 1 min.
  4. Vórtice do tubo por 30 s e girar rapidamente a Lise para o fundo do tubo.
  5. Reabrir o tubo e repita as etapas de 10.2-10.4.
  6. Coloca o tubo contendo 100 μL de tampão de Lise e RNA do freezer-80 ° C, até que todas as amostras são acabado e pronto para a extração do RNA (Tabela de materiais #14).

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Resultados

Este protocolo detalha as etapas para preparar o tecido do cérebro humano fresco congelado post-mortem para UV-LCM. Anotações e minuciosos especificações são dadas para cortes de criostato, como pode ser difícil de cortar o tecido de cérebro congelado fresco com um alto grau de precisão. O ponto mais importante a considerar é que o tecido congelado fresco é extremamente frio e requer uma quantidade significativa de tempo se aclimate à temperatura mais quente de um criostato. Esta etapa nã...

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Discussão

O protocolo aqui apresentado é modificado especificamente para ser uma abordagem de aço inoxidável em Visualizar morfologicamente distintos tecidos para UV-LCM. Este método foi projetado para maximizar a integridade do RNA para subsequentes direto a sequenciação do ARN, mantendo um nível aprimorado de visualização do tecido. A capacidade de distinguir diferentes tipos de células para captura, para criar a população de células mais pura possível, é essencial para a compreensão de diferentes perfis moleculares em tecidos h...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostaria de reconhecer o cérebro do New York Bank, Dr. Jean Paul Vonsattel e Dr. Etty Cortés, por sua assistência na corte e preservar as amostras de tecido do cérebro humano congelado para estas experiências. Os autores gostaria de reconhecer os indivíduos que generosamente doaram seu cérebro para a pesquisa contínua sobre Tremor essencial. Dr. Fausto e Dr. Martuscello gostaria de reconhecer a Columbia University departamento de patologia e biologia celular para o seu contínuo apoio e espaço de pesquisa do núcleo. Os autores gostaria de reconhecer o NIH R01 NS088257 Louis/Fausto) para financiamento de pesquisa para este projeto. Imagens de LCM foram realizadas no Confocal e especializada microscopia recurso compartilhado do Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, na Universidade de Columbia, suportado pelo NIH conceder #P30 CA013696 (National Cancer Institute). Os autores que gostaria de agradecer a Theresa Swayne e Laura Munteanu por sua assistência continuada com microscopia especializada.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
MembraneSlide NF 1.0 PENZeiss415190-9081-000Lâminas de membrana para tecido. Não recomendamos o uso de lâminas de vidro. 
AdhesiveCap 500 OpaqueZeiss415190-9201-000As tampas opacas são usadas para melhorar a visualização apenas em escopos invertidos
RNaseAway Molecular BioProducts7005-11Outros produtos de descontaminação RNase também são adequados. Use para limpar todas as superfícies antes do trabalho. 
200 Prova de EtanolDecon Laboratories2701Se estiver usando etanol alternativo, garanta alta qualidade. Essencial para a fixação do tecido. 
Xilenos (Certificado ACS)Fisher ScientificX5P-1GALSe estiver usando xileno alternativo, garanta alta qualidade. Essencial para a visualização do tecido. 
Água Destilada UltraPuraInvitrogen10977-015Outra água livre de RNA/DNA/Nuclease também é adequada. Utilizado apenas na diluição de etanol. 
Frascos de Slides Slide-FixEvergreen240-5440-G8KQualquer porta-slides/jarra também é adequado. Deve ser limpo antes do uso. Usado para fixação após seccionamento. 
Placa Anti-Roll, Assy. 70 mm 100 μ mLeica Biosystems14041933980tipo de placa estabilizadora é determinado pelo tipo de criostato e localização da fixação no palco. Todos os criostatos têm requisitos diferentes. 
Dietil pirocarbonato (DEPC)Sigma AldrichD5758-50mLDEPC de qualquer fornecedor servirá. Siga as instruções para tratamento de água.
KimwipesFisher Scientific06-666AOs Kimwipes podem ser encomendados de qualquer fornecedor e usados em qualquer tamanho. Kimwipes são para ser usados para limpar microscópio e criostato. 
Composto Tissue-Plus O.C.T. FisherScientific23-730-571Qualquer marca de OCT é aceitável. Nenhum tecido será embutido na OCT, é difícil anexar o tecido ao 'mandril'. 
Lâminas de micrótomo de baixo perfil Edge-RiteThermo Scientific4280LO tipo de lâmina é determinado pelo tipo de criostato. Todos os criostatos têm requisitos diferentes. 
Leica Microsystems 3P  MANDRIS DE CRIOSTATO DE 25 + 30 MMFisher ScientificNC0558768O tipo de mandril é determinado pelo tipo de criostato. Todos os criostatos têm requisitos diferentes. Qualquer tamanho é adequado. 
RNeasy Micro Kit (50)Qiagen74004Necessário para extração de RNA pós-LCM. O tampão de lise RLT é essencial para coletar células capturadas da tampa opaca. 
RNeasy Mini Kit (50)Qiagen74104Necessário para extração de RNA de preparações de seção, que são realizadas antes do LCM para testar a integridade do RNA dos tecidos iniciados. 
Conjunto de DNase livre de RNaseQiagen79254Dnase removerá qualquer DNA para permitir uma população de RNA puro. Garanta que o Dnase seja fresco.
2-MercaptoetanolSigma AldrichM6250-100MLVolume comprado a critério do usuário. Necessário para adição ao tampão RLT para lise celular. Previne a atividade da RNase. 
Globo Científico  Lote de Tubo de Microcentrífuga Graduado Certificado (2 mL)Fisher Scientific22-010-092Qualquer tubo de 2 mL que seja livre de RNase, DNase, DNA humano e pirogênio serve para servir. 

Referências

  1. Liu, H., et al. Laser capture microdissection for the investigative pathologist. Veterinary Pathology. 51 (1), 257-269 (2014).
  2. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  3. Romero, I. G., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12 (42), 1-13 (2014).
  4. Bevilacqua, C., Ducos, B. Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level. Molecular Aspects Medicine. 59, 5-27 (2018).
  5. Sidova, M., Tomankova, S., Abaffy, P., Kubista, M., Sindelka, R. Effects of post-mortem and physical degradation on RNA integrity and quality. Biomolecular Detection and Quantification. 5, 3-9 (2015).
  6. Wang, H., et al. Histological staining methods preparatory to laser capture microdissection significantly affect the integrity of the cellular RNA. BMC Genomics. 7, 97(2006).
  7. Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. Murray, G. I. , Springer. (2018).
  8. Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: should an ultraviolet or infrared laser be used. Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
  9. Graeme, M. I. Laser Capture Microdissection. Third edn. , Humana Press. (2018).
  10. Louis, E. D. Re-thinking the biology of essential tremor: From models to morphology. Parkinsonism & Related Disorders. 20, 88-93 (2014).
  11. Choe, M., et al. Purkinje cell loss in essential tremor: Random sampling quantification and nearest neighbor analysis. Movement Disorders. 31 (3), 393-401 (2016).
  12. Louis, E. D., et al. Neuropathological changes in essential tremor: 33 cases compared with 21 controls. Brain. , Pt 12 3297-3307 (2007).
  13. Louis, E. D., et al. Neuropathologic findings in essential tremor. Neurology. 13 (66), 1756-1759 (2006).
  14. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3(2006).
  15. Jensen, E. Laser Capture Microdissection. The Anatomical Record. (296), 1683-1687 (2013).
  16. Waller, R., et al. Isolation of enriched glial populations from post-mortem human CNS material by immuno-laser capture microdissection. Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 108-113 (2012).
  17. Lee, S., et al. Laser-capture microdissection and transcriptional profiling of the dorsomedial nucleus of the hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 520 (16), 3617-3632 (2012).
  18. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
  19. Sonne, S. B., et al. Optimizing staining protocols for laser microdissection of specific cell types from the testis including carcinoma in situ. PLoS One. 4 (5), 5536(2009).
  20. Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
  21. Schuierer, S., et al. A comprehensive assessment of RNA-seq protocols for degraded and low-quantity samples. BMC Genomics. 18 (1), 442(2017).
  22. Kumar, A., et al. Age-associated changes in gene expression in human brain and isolated neurons. Neurobiology of Aging. 34 (4), 1199-1209 (2013).
  23. Sampaio-Silva, F., Magalhaes, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval. PLoS One. 8 (2), 56507(2013).
  24. Walker, D. G., et al. Characterization of RNA isolated from eighteen different human tissues: results from a rapid human autopsy program. Cell Tissue Bank. 17 (3), 361-375 (2016).
  25. Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue. Cell Tissue Bank. 12 (4), 311-318 (2011).
  26. Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
  27. Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq. Scientific Reports. 6, 25533(2016).
  28. Carl Zeiss Microscopy. , Carl Zeiss. Germany. (2012).

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