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Artigo de método

Uma bateria de testes comportamentais para a avaliação repetida das habilidades motoras, humor e cognição em ratos

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DOI:

10.3791/58973

⸱

2 de março de 2019

 ,  , 
1Nanjing Key Laboratory of Pediatrics, Children's Hospital of Nanjing Medical University, 2Nanjing Key Laboratory of Pediatrics, Nanjing Medical University, 3Laboratory of Neurodegenerative Disease, Li Ka Shing Faculty of Medicine, University of Hong Kong, Pokfulam, Hong Kong Special Administrative Region (HK SAR)

Neste artigo

Resumo

Uma bateria de testes comportamentais abrangente das habilidades motoras, humor — incluindo a interação social, depressão e ansiedade — e cognição destina-se a avaliação repetida das alterações comportamentais relacionadas à neurodegeneração em camundongos.

Resumo

Estudos farmacológicos e toxicológicos na neurodegeneração exigem abrangente análise comportamental em ratos porque disfunções motor e disfunções de humor e cognição são comuns e compartilhado muitas vezes sintomas em doenças neurodegenerativas. Mostrado aqui é uma bateria de testes comportamentais para motor, humor e cognição, que pode ser testada repetidamente em um estudo longitudinal. Esta bateria avalia o fenótipo comportamental em geral em ratos, examinando cada domínio de comportamento pelo menos dois testes bem aceitas independentes (ou seja, teste de campo aberto e rotarod teste para a função motora, teste de interação social, elevados além de teste de labirinto, e teste de natação forçada para função emocional e teste de labirinto de água de Morris e teste de reconhecimento de objeto romance para função cognitiva). Portanto, esta bateria de teste sensível e abrangente é uma poderosa ferramenta para o estudo da alternância comportamental na neurodegeneração.

Introdução

Doenças neurodegenerativas destaque devastadoras comportamentais sintomas, incluindo comprometimento cognitivo, disfunções de humor, como ansiedade e depressão ou disfunção motora1. A patogênese dos vários tipos de doenças neurodegenerativas é claro2. Acumulativos estudos indicam que fatores genéticos e ambientais podem tanto contribuir para a patogênese de doenças neurodegenerativas. Identificar o fator de risco de neurodegeneração requer análise comportamental. Embora cada tipo de doença neurodegenerativa tem seu sintoma comportamental de assinatura (por exemplo, a doença de Alzheimer [AD] é caracterizada com comprometimento cognitivo e a doença de Parkinson [PD] com disfunção motora). Com a progressão da doença, os pacientes manifestam comorbidade de anormalidades comportamentais diferentes3. Por exemplo, pacientes apresentam sintomas de disfunção do humor no estágio avançado4,5. Pacientes com DP podem progredir em demência PD-relacionados e desenvolver comprometimento cognitivo6. Baseado sobre esses recursos, a análise comportamental na neurodegeneração modelos geralmente é abrangente e repetidas.

Para atingir este objetivo, uma bateria que contém testes comportamentais clássicos e amplamente utilizados com excelente validade foi projetada para análises comportamentais no motor, humor e cognição. A função motora pode ser testada pelo teste de campo aberto7,8 e o teste de rotarod a aceleração. Disfunção do humor, incluindo disfunção social, depressão e ansiedade, são mais comumente vistos em de doenças neurodegenerativas5. Portanto, esta bateria inclui um teste de interação social para sociabilidade9, a elevada mais teste de labirinto para ansiedade10e o teste de natação forçada para depressão11. Comprometimento cognitivo é um dos sintomas mais característicos em doenças neurodegenerativas, como AD e de demência lobar frontotemporal12. Domínios cognitivos, incluindo a curto prazo e a memória episódica, são suscetíveis a neurodegeneração13,14,15. Portanto, o teste de labirinto de Morris água para aprendizagem espacial e memória de16 e o teste de reconhecimento de objeto romance para curto prazo memória17 estão incluídos na bateria. Estes testes são compatíveis uns com os outros. A ordem dos testes foi projetada para maximizar a habituação e a minimizar as interferências, para aumentar ainda mais a compatibilidade dentro da bateria. Desde que cada função é testada pelo menos dois testes independentes que são diferentes em princípio e método, os resultados de cada teste podem ser validados ainda mais. Além disso, os protocolos de alguns testes são destacados para testes repetidos, facilitando o estudo longitudinal do desenvolvimento de doenças neurodegenerativas. Portanto, esta bateria de testes de comportamento estuda diferentes subdomínios de mudanças de comportamento vistos em vários estágios de neurodegeneração enquanto custando um número mínimo de animais. Esta bateria tem sido utilizada em um estudo longitudinal que avaliou as alterações comportamentais em jovens adultos (3 meses) masculino C57BL/6N os ratos após exposição respiratória de nanopartículas de sílica, que é um factor de risco potencial de ofício Neurodegeneração18. No entanto, cepas ou outros modelos, tais como idade ratos e manipulado geneticamente ratos, podem se comportar de forma diferente de jovens camundongos C57BL/6N. Portanto, cuidado pode ser exigido ao usar esta bateria nestes ratos.

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Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comité sobre o uso de animais vivos no ensino e pesquisa (CULATR), Universidade de Hong Kong.

1. geral protocolo

Nota: Esta seção baseia-se diácono19.

  1. Instalação de sala comportamental
    1. Livrar-se da estimulação/distração independente, incluindo luz direta no aparato experimental, odor, barulho e outros animais irrelevantes, na sala comportamental (que deve ser cerca de 10 m2 com ajustável iluminação e, de preferência, ter uma antecâmara).
      Nota: Desde que o rato é um animal noturno, iluminação abaixo dos 15 lux no teste de campo aberto, romance objeto reconhecimento e teste de interação social poderiam minimizar o stress/interferência da luz e ajudar o mouse para focar o teste.
    2. Configurar a câmera para pelo menos 1,5 m acima do piso, garantindo que é fora do alcance do mouse teste de gravação de vídeo.
  2. Habitação e habituação
    1. Grupo-casa os ratos em uma unidade animal sob observação (por exemplo, Alojamento em grupo não mais que quatro ratos adultos).
      Nota: Aqui, utilizaram-se camundongos C57BL/6N machos de 3 meses de idade e alojados em uma gaiola de 1144B. Descarta os ratos doentes, feridos ou severamente estressados. Experiências de fome, sede ou bullying podem afetar o desempenho do mouse.
    2. Providencie o mesmo manipulador de animais realizar todos os testes comportamentais, para diminuir a variabilidade. Realizar o transporte, manuseio e experimentar durante o ciclo de luz de 07:00 a 19:00 Se possível, organize todas as outras manipulações, tais como a administração de qualquer droga/toxina (por exemplo, a instilação intranasal de nanopartículas de sílica) ou limpeza de gaiola, depois do teste.
    3. Reclassificar as gaiolas com números aleatórios para cegar o experimentador antes de cada experimento. Se habituar os ratos no ambiente experimental no quarto comportamental por 15 a 30 min em suas gaiolas para casa. Manter as gaiolas em casa no quarto comportamental durante todo o experimento.
    4. Antes de iniciar o experimento, coloca um rato C57BL/6N nonexperimental no aparelho, para que a condição experimental para o primeiro mouse é o mesmo que o resto. Em seguida, limpar o aparelho da seguinte forma: remover a urina e fezes com uma toalha de papel limpo, limpar o dispositivo experimental com água da torneira e em seguida, cobrir o odor deixado pelo mouse por limpar o aparelho com uma toalha de papel levemente pulverizada com etanol a 70%.
    5. Para minimizar a distração causada pelo experimentador, pedir o experimentador para sair da sala comportamental durante a gravação de vídeo, ou ficar atrás da cortina, durante o teste de labirinto de água de Morris.
  3. Arranjo do teste comportamental
    1. Providenciar o teste comportamental na ordem, como mostrado na figura 1A. Plano para a realização de testes espaçados por 24 h, com excepção da elevada além de teste de labirinto.
      Nota: Uma vez que todo o procedimento exige até 2 semanas, simplifica a bateria escolhendo entre os testes semelhantes antes da aplicação de um estudo de curto prazo ou aguda.
      Atenção: O teste de campo aberto dia 2 garante habituação apropriada para o teste de reconhecimento de objeto romance. Teste o teste de natação forçada última como pode causar estresse em camundongos C57BL/6N.

2. BehavioralTest protocolo

  1. Teste de campo aberto8,18,19,20
    1. Realize o teste de campo aberto em um 60 cm (comprimento [L]) x 60cm (largura [W]) x arena de plástico branco não transparente 40 cm (altura [H]).
      Nota: Usar várias arenas pode aumentar a taxa de transferência do teste.
    2. Iniciar a gravação de câmera e gentilmente colocou o mouse ao lado no meio de uma parede da arena, enfrentando essa mesma parede. Registre o comportamento do rato durante 10 minutos antes de retorná-lo para a gaiola em casa. Limpe o aparelho conforme descrito na etapa 1.2.4.
      Nota: O ponto de início do teste de campo aberto também pode ser o centro da arena. Ser consistentes entre os ratos.
    3. Repita até que todos os ratos terminar o protocolo. Contrabalançar a ordem teste entre grupos.
    4. Realizar a análise de dados da seguinte maneira.
      1. Divida a arena em quatro quadrados por quatro quadrados (grade imaginária) na tela do computador. Para avaliar a função motora, conte o número de linhas que cruzou com o mouse na arena19.
        Nota: A definição de "cruzar uma linha" é quando ambos os membros posteriores cruzá-la. Esta definição também se aplica para a elevada e mais teste de labirinto.
      2. Medir o tempo gasto na área central, como um indicador da ansiedade. A área central é as quatro praças no centro da arena.
        Nota: Parâmetros adicionais, tais como a criação (ambas as patas dianteiras do chão, com as patas da frente contra uma parede ou de pé), a latência para a retaguarda de primeira e aliciamento e congelamento indicam a emotividade do mouse.
      3. Como alternativa, use um software de rastreamento, conforme descrito em detalhe por Seibenhener e Wooten8, para medir a distância percorrida, a velocidade e o tempo gasto na área central.
  2. Acelerando rotarod teste18
    1. Realize no dia 3, formação da aceleração rotarod teste antes de qualquer tratamento de drogas ou toxinas/modelagem/início da doença e testar a função motora para 1 dia, como previsto na figura 1A.
      Nota: O rato recebe três ensaios por dia, durante o treinamento e teste. Cada julgamento começa com a rotação da haste e termina com a queda do mouse.
    2. Coloque o aparelho rotarod no banco no quarto comportamental. Evite a iluminação direta no equipamento. Programe o equipamento como a partir de 4 rpm e acelerando a 40 rpm dentro de 5 min.
    3. Em cada julgamento, coloque o mouse sobre a haste de estática, olhando para a parede da máquina. Inicie o dispositivo quando o mouse estiver resolvido. Parar o dispositivo, uma vez que o rato cai e registrar o tempo o rato gastou na haste. Repita imediatamente para outro dois ensaios antes de retornar o mouse volta para a jaula para casa.
    4. Repita o procedimento nos outros ratos.
    5. Medir o tempo médio gasto na haste de três ensaios durante o ensaio para estimar a função motora.
      Nota: O tempo médio na haste durante o terceiro dia de treinamento é a base da função motora.
  3. Interação social teste18
    1. Para o teste de interação social, use uma campo aberto arena com duas câmaras transparentes idênticas (8 cm [L] x 6 cm [W] x 12 cm [H]) com orifícios na superfície — e um rato romance (auxiliar), que é um conspecific juvenil do mesmo-sexo que tem não teve nenhum contato anterior com o rato do assunto. A figura 1B mostra o esquema do procedimento. Limpe a arena e as câmaras, conforme descrito na etapa 1.2.4.
      Nota: O romance mouse não pode ser um companheiro littermate ou gaiola do rato assunto. É saudável e alojados em grupo. Se habituar o mouse romance a sala comportamental por 15 a 30 min conforme descrito na etapa 1.2.3.
    2. Separadamente, coloque as duas câmaras no meio de duas paredes opostas da arena. Introduza o mouse do assunto na arena como descrito na etapa 2.1.2 e mostrada na figura 1B, para uma exploração de 3 min. Retorne o mouse do assunto da gaiola em casa e remover qualquer urina ou fezes na arena.
    3. Colocar o auxiliar em uma das câmaras. Reintroduzir o mouse do assunto para a arena e gravar por 3 min. depois, retorno ambos os ratos para cada uma das suas próprias gaiolas em casa. Repita os procedimentos com outros ratos de assunto como descrito acima.
      Nota: Contrabalançar o lado do programa auxiliar ou atribuí-lo aleatoriamente dentro do grupo.
    4. A partir do vídeo, estimar o parâmetro descrevendo a atividade de interação social dos ratos como tauxiliar/tvazio, que significa a proporção do tempo interagindo com a câmara de auxiliares (thelper) e o vazio (tvazio), um ou usar o reconhecimento do índice tauxiliar/ (tauxiliar + tvazio).
      Nota: Uma interação entre o mouse do assunto e a câmara é definida como quando o nariz do rato está a 2 cm da câmara e apontando em direção a ela.
  4. Elevados, além disso, teste de labirinto 10
    1. Conduta da elevada mais labirinto teste no mesmo dia depois que todos os ratos são testados no teste de campo aberto. Limpe o aparelho conforme descrito na etapa 1.2.4.
      Nota: A configuração da elevada plus labirinto é um "+"-forma. Tem dois braços abertos (30 cm x 5 cm x 0,5 cm) em frente um do outro e perpendicular aos dois braços fechados (30 x 5 x 16 cm) com uma plataforma de centro (5 x 5 cm x 0,5 cm). O labirinto é elevado a 40 cm do solo.
    2. Posicione o mouse na junção dos braços abertos e fechados, enfrentando o braço aberto que é o oposto do experimentador (Figura 1). Registre o comportamento por 5 min antes de retornar o rato da gaiola em casa. Repita até que todos os ratos são testados.
      Nota: Entrar no labirinto com seu rosto com o braço aberto poderia aumentar a exploração do rato do braço aberto.
    3. Medir o tempo que o rato passou nos braços abertos (tabrir) e nos braços fechados (tfechar) baseados no vídeo: tabrir/tfechar indica o nível de ansiedade.
  5. Teste de natação forçada11
    1. O aparato do teste de natação forçada é um tanque cilíndrico que é de 30 cm de altura e 20 cm de diâmetro. Encha o depósito até 15 cm de altura com água da torneira à temperatura ambiente (23-25 ° C).
      Nota: Use água fresca para cada rato.
    2. Iniciar a gravação de vídeo e Coloque suavemente o mouse na água, no centro do aparelho. Gravar o vídeo para 6 min antes de colocar o mouse de volta à sua jaula em casa sob luz infravermelha.
      Nota: Não perturbe o mouse por afogamento, ou torcer o rabo.
    3. Medir o tempo de imobilidade nos último 5 min do vídeo gravado. Mobilidade significa qualquer movimentos além dos necessários para equilibrar o corpo e para manter a cabeça acima da água.
  6. Reconhecimento de objeto romance teste17,18
    1. Configurar o teste de reconhecimento de objeto romance para incluir 2 dias de habituação, 1 dia de familiarização e 1 dia de teste (Figura 1); cada sessão é de 10 min por rato, e o intervalo de intercessão 24 h.
      Nota: A habituação usando o teste de campo aberto é executada conforme descrito na seção 2.1. O mouse interage com dois objetos idênticos (objetos velhos) em familiarização. No teste, o mouse interage com os objetos antigos e um novo objeto, ambos colocados no mesmo lugar que os objetos na familiarização. O aparato do teste de reconhecimento de objeto romance inclui uma campo aberto arena e dois conjuntos de objetos. Cada conjunto contém dois objetos idênticos (objetos A e A e B e B). Objetos A e B são semelhantes em tamanho, mas diferentes em textura (papel, plástico e vidro), forma (redonda/cúbico) e cor (claras/escuras). Os objetos devem ser livre de odor e grande o suficiente para o mouse explorar dentro de 10 min. O tamanho adequado para adultos camundongos C57BL/6N é 8 cm de altura e 5 cm de largura/em diâmetro.
    2. Marca as posições dos dois objetos na familiarização e teste, 5 cm de lado e 7 cm da parte superior da arena.
      Nota: Marca a posição na noite antes de familiarização para evitar o cheiro do marcador.
    3. Na familiarização, o mouse interage com um conjunto de objetos idênticos. Limpe a arena e objetos conforme descrito na etapa 1.2.4 antes de colocar o mouse na arena, enfrentando o meio da parede, como mostrado na Figura 1. Recorde de 10 min antes de retornar o rato da gaiola em casa. Repita até que todos os ratos são acabados e retornam todas as gaiolas à unidade animal.
      Nota: Contrabalançar os objetos usados na familiarização dentro do grupo para diminuir o preconceito (por exemplo, ratos n. º 1 e 2 explorar objetos A e A e ratos n º 3 e 4 explorar objetos B e B; desta forma, o romance objeto é objeto B para ratos no. 1 e 2 e objeto A para ratos não. 3 e 4).
    4. Realize o teste 24 h após a familiarização. Use o mesmo procedimento para a familiarização, exceto substituir um dos objetos com um de outro conjunto (Figura 1). Repita até que todos os ratos têm de executar o teste e, depois, retornam todas as gaiolas à unidade animal.
      Nota: Contrabalançar o lado do novo objeto dentro do grupo para diminuir o preconceito (por exemplo, apresentar os ratos n. º 1 e 3 objetos A e B e ratos n º 2 e 4 para objetos B e A). Desta forma, o objeto do romance mostra no lado direito para ratos n. º 1 e 4 e no lado esquerdo para ratos no. 2 e 3. Aqui, o lado esquerdo é o lado esquerdo do experimentador ao enfrentar a arena.
    5. Medir o tempo que cada mouse interage com o novo objeto (tnovo) e o objeto antigo (tvelho) separadamente, desde as imagens de vídeo em fase de testes. Uma interação entre o animal e o objeto é descrita na nota seguinte passo 2.3.4. Calcular a memória do mouse como a preferência para o novo objeto = tnovo/tantigo; ounovat / (nova t + tvelho).
      Nota: tnovo/tvelho é igual a 1 ou tnovo/ (nova t + tantigo) é igual a 0,5 significa que o mouse não tem nenhuma preferência para o novo objeto (ou seja, deficiência de memória). O tempo interagindo com objetos na familiarização pode servir como um controle do experimento. O tempo total indica a atividade de exploração do mouse, e sugere tesquerda/tcerto viés espacial.
  7. Labirinto de água Morris teste16
    1. Configure o aparelho como segue.
      1. Colocar o labirinto de água, uma piscina circular (de 120 cm de diâmetro e 60 cm de profundidade), no centro de uma sala de comportamental e marcar a posição do labirinto para assegurar que a posição permanece a mesma durante todo o experimento.
      2. Divida o labirinto em quatro quadrantes imaginário igual. Pendure as indicações visuais (por exemplo, círculo, quadrado, triângulo e Pentágono) no centro de cada quadrante, 130 centímetros acima do chão e 53 centímetros longe da parede do labirinto.
        Nota: O labirinto e o taco devem ficar na mesma posição durante o teste inteiro, para que o rato pode formar memória espacial exata.
      3. Coloque uma plataforma de 25 cm de distância da parede, no centro do quarto quadrante e marcar a posição. A plataforma para o mouse é 10 cm de diâmetro.
        Nota: A posição e o diâmetro da plataforma determinam a dificuldade da tarefa. O mais próximo é na parede do labirinto, ou quanto maior a plataforma, mais fácil a tarefa.
      4. Encha o labirinto de água com água (com temperatura de 23 a 25 ° C, coloridas em branco e feita opaco pelo branqueamento pó de leite em pó/alimentos) até o nível de água é maior do que a plataforma 1 cm. Trazer os ratos no quarto por 15 a 30 min de habituação comportamental, como mostrado na etapa 1.2.3 e acender a luz infravermelha acima as gaiolas, que será usado para secar os ratos.
        Nota: Cubra a parte superior da plataforma com pano branco e rede para que o rato pode facilmente subir nela. Certifique-se que não há nenhuma iluminação direta acima da água.
    2. Realizar a fase de formação como segue.
      1. A fase de treinamento leva 5 dias, quatro ensaios por dia. Organize semi aleatoriamente os pontos de partida em cada dia, conforme demonstrado na literatura16. Este esforço impede que o mouse que estabelece a memória associativa, que é a maneira mais comum para "enganar" o teste.
      2. No início de cada julgamento, iniciar a gravação de vídeo e Coloque suavemente o mouse o labirinto.
        Nota: Não solte o mouse no tanque ou torça seu rabo, o que pode causar desorientação e stress extra.
      3. Pedir o experimentador de permanecer fora de vista do rato e voltar a levar o mouse de volta para sua gaiola em casa quando qualquer um dos seguintes acontece: (i) o mouse não é possível localizar a plataforma dentro de 60 s; (ii) o mouse encontra a plataforma dentro de 60 s e permanece nela por 10 s. Circunstância (i), pedir o experimentador Coloque o mouse sobre a plataforma e deixá-lo ficar lá por 10 s.
        Nota: Ponto (ii), que o mouse localizado com sucesso a plataforma.
      4. Pare o vídeo e coloque o mouse de volta na gaiola casa sob luz infravermelha.
        Nota: Manter a temperatura corporal de ratos é crítico para seu desempenho porque hipotermia salienta ratos e pode afetar os seguintes testes.
      5. Repita o procedimento com outro rato.
      6. Baseado no vídeo, registro a latência de fuga, que é a duração do período que no labirinto, de entrar no labirinto até o momento em que o mouse gasta com êxito localiza a plataforma. Se o mouse não consegue encontrar a plataforma ou estadias lá por menos de 10 s em 60 s, a latência de fuga conta como enredo s. 60 a curva de aprendizado contra os dias de treinamento com a latência de fuga média por dia.
        Nota: A latência de fuga não inclui os 10 s passar na plataforma.
    3. Execute a fase de sonda como segue.
      1. No sexto dia do teste de labirinto de água Morris, configurar o aparelho conforme descrito na etapa 2.7.1., tirar uma foto do labirinto para gravar a posição da plataforma e em seguida, remover a plataforma do tanque.
      2. Iniciar o gravação de vídeo e Coloque suavemente o mouse no labirinto no quadrante diagonalmente oposto ao quadrante alvo.
      3. Pergunte o experimentador para ficar fora da vista do mouse durante a gravação de vídeo de 1 min. Depois, tem o experimentador pegar o mouse fora do labirinto e colocá-lo de volta na gaiola em casa.
      4. Use a imagem tirada pelo passo 2.7.3.1. como referência para medir a duração de qualquer cruzamento de plataforma. Tempo de duração que o mouse fica no quadrante alvo (talvo), de acordo com o vídeo. O tempo total é ttotal. Medir a preferência ao quadrante alvo como t alvo/ttotal.

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Resultados

Esta bateria de testes comportamentais foi projetada para a análise comportamental abrangente e válida de motor, humor e cognição, que são comumente afetados na neurodegeneração5. Nós aplicamos esta bateria para estudar as mudanças comportamentais em jovens adultos C57BL/6N ratos após exposição respiratória de nanopartículas de sílica por 1 mês e 2 meses18. Os resultados revelaram que camundongos C57BL/6N expostos a nanopartículas de sílica ...

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Discussão

Análise comportamental de ratos é crítico para a pesquisa de neurodegeneração. Enquanto a função cognitiva é, muitas vezes, o domínio mais suscetível de comportamento afetado em doenças neurodegenerativas, disfunção do humor, como depressão e ansiedade, muitas vezes é comórbidos. Além disso, a função motora muitas vezes afeta a interpretação dos resultados de alguns testes, tais como o teste de reconhecimento de objeto do romance, a elevada plus teste de labirinto e o teste de interação social. Baseado nestes pensamentos...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecer Dr. Cora SW Lai da escola de ciências biomédicas, Universidade de Hong Kong, para empréstimos a elevada além de teste de labirinto e o departamento de Anestesiologia da Universidade de Hong Kong para a aparelhagem de ensaio rotarod os empréstimos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
câmaras em teste de interação socialcaseiro(8 cm (L) x 6 cm (L) x 12 cm (A)), transparente com furos,
tanques cilíndricos de plástico usados em teste de nado forçadocaseiro 30cm de altura, 20 cm de diâmetro, vidro
elevado mais labirintocaseirobraços abertos (30 cm x 5 cm x 0,5 cm), braços fechados (30 cm x 5 cm x 16 cm), plataforma central (5 cm x 5 cm x 0,5 cm), 40 cm de altura. Aparelho de plástico não transparente
IITC Roto-Rod IITClife science Inc.755, série 8
arena de campo abertofeita em60 cm (C) x 60 cm (L) x 40 cm (A), plástico,
labirinto aquáticofeito em120 cm de diâmetro, 60 cm de profundidade, aço
casa não transparente casa

Referências

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