Este protocolo detalha um monolayer, método soro-livre para gerar eficientemente Hepatocyte-como pilhas das pilhas de haste pluripotentes humanas (hPSCs) em 18 dias. Isto implica seis etapas como hPSCs se diferenciam seqüencialmente em tipos de células intermediárias, como a raia primitiva, endoderma definitivo, foregut posterior e progenitores de broto hepático antes de formar células como hepatócitos.
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Artigo de método
Diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas em células hepáticas
Neste artigo
Resumo
Resumo
O fígado desintoxica substâncias nocivas, secreta proteínas vitais, e executa as principais atividades metabólicas, sustentando assim a vida. Consequentemente, a insuficiência hepática — que pode ser causada por ingestão crônica de álcool, hepatite, envenenamento agudo ou outros insultos — é uma condição grave que pode culminar em sangramento, icterícia, coma e, eventualmente, morte. Entretanto, as aproximações para tratar a falha de fígado, assim como estudos da função e da doença de fígado, foram stymied na parte pela falta de uma fonte abundante de pilhas humanas do fígado. Para este fim, este protocolo detalha a diferenciação eficiente de pilhas de haste pluripotentes humanas (hPSCs) em Hepatocyte-como pilhas, guiado por um roteiro desenvolvente que descreva como o Fate do fígado está especificado através de seis etapas consecutivas da diferenciação. Manipulando as vias de sinalização do desenvolvimento para promover a diferenciação hepática e para suprimir explicitamente a formação de Fates celulares indesejados, este método gera eficientemente populações de progenitores de gemas hepáticas humanas e células como hepatócitos por dias 6 e 18 de diferenciação do PSC, respectivamente. Isto é conseguido através do controle temporally-preciso de caminhos de sinalização desenvolventes, exercitado por moléculas pequenas e por factores de crescimento em um meio de cultura soro-livre. A diferenciação neste sistema ocorre em monocamadas e produz células hepatócito-like que expressam enzimas de hepatócitos característicos e têm a capacidade de entransplantar um modelo de rato de insuficiência hepática crónica. A capacidade de gerar eficientemente um grande número de células hepáticas humanas in vitro tem ramificações para o tratamento da insuficiência hepática, para a triagem de drogas, e para estudos mecanísticos de doença hepática.
Introdução
A finalidade deste protocolo é diferenciar eficientemente pilhas de haste pluripotentes humanas (hPSCs) em populações enriquecidas de progenitores do botão do fígado e Hepatocyte-como pilhas2. O acesso a um suprimento pronto de progenitores hepáticos humanos e células semelhantes a hepatócitos acelerará os esforços para investigar a função hepática e a doença e poderá permitir novas terapias de transplante celular para insuficiência hepática3,4, a 5. Isso tem provado desafiador no passado desde hPSCs (que incluem células-tronco pluripotentes embrionári....
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Protocolo
1. preparação de meios de diferenciação
Nota: Refira a tabela de materiais para a informação do fabricante a respeito dos materiais e dos reagentes usados.
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Preparação de suportes de base quimicamente definidos (MDL)
Nota: CDM2, CDM3, CDM4 e CDM5 são meios quimicamente definidos que são usados como mídias de base para diferenciar hPSCs para células hepáticas em vários estágios. A composição dessas mídias pode ser encontrada na tabela 1.- Para fazer CDM2 ou CDM3, prepare uma solução de ações contendo álcool polivinil (PVA). Dissolver 0,5 g de pó de PVA em....
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Resultados
Após 24 h de diferenciação de APS, as colônias geralmente adotam uma morfologia diferente do que as colônias não diferenciadas concomitantes com uma perda da borda brilhante que circunscreve tipicamente colônias de hPSC. Morfologicamente, células de raia primitiva geralmente têm bordas irregulares e são mais disseminadas e menos compactas do que hPSCs-isso é evocativo de uma transição epitelial-mesenquimais como células de epiblastos pluripotentes diferenciam e entram no primitivo raia in.......
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Discussão
Este método permite a geração de populações enriquecidas de progenitores do botão do fígado, e subseqüentemente Hepatocyte-como pilhas, de hPSCs. A capacidade de gerar populações enriquecidas de células hepáticas humanas é importante para a utilização prática de tais células. Métodos prévios para gerar hepatócitos de hPSCs produziram populações de células impuras contendo células hepáticas e não hepáticas que, após transplante em roedores, produziram osso e cartilagem além do tecido hepático15. Da.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos Bing Lim para discussões e do Stanford Institute for Stem Cell Biology & medicina regenerativa para suporte de infra-estrutura. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto de medicina regenerativa da Califórnia (DISC2-10679) e pelo Stanford-UC Berkeley Siebel Stem Cell Institute (para L.T.A. e K.M.L.) e o centro de Stanford Beckman para medicina molecular e genética, bem como o Anonymous, Famílias de Baxter e de DiGenova (a K.M.L.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Geltrex | Thermofisher Scientific | A1569601 | |
| 1:1 DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 0.2 μ Filtro de membrana de poros | Millipore | GTTP02500 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Thiazovivin | Tocris Bioscience | 3845 | |
| Accutase | Gibco ou Millipore | Gibco A11105, Millipore SCR005 | |
| IMDM, GlutaMAX™ Suplemento | Thermofisher Scientific | 31980030 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Suplemento | Thermofisher Scientific | 31765035 | |
| KOSR, substituição de soro Knockout | Thermofisher Scientific | 10828028 | |
| Poli(álcool vinílico) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | ||
| Concentrado lipídico quimicamente definido | Thermofisher Scientific | 11905031 | |
| Human Activin | R & D | 338-AC | |
| CHIR99201 | Tocris | 4423 | |
| PI103 | Tocris | 2930/1 | |
| Humano FGF2 | R & D | 233-FB | |
| DM3189 | Tocris | 6053/10 | |
| A83-01 | Tocris | 2939/10 | |
| BMP4 humano | R& D | 314-BP | |
| C59 | Tocris | 5148 | |
| TTNPB | Tocris | 0761/10 | |
| Forskolin | Tocris | 1099/10 | |
| Oncostatina M | R& D | 295-OM | |
| Dexametasona | Tocris | 1126 | |
| Ro4929097 | Selleck Chem | S1575 | |
| AA2P | Cayman chemicals | 16457 | |
| Insulina recombinante humana | Sigma-Aldrich | 11061-68-0 |
Referências
- Bernal, W., Wendon, J. Acute Liver Failure. New England Journal of Medicine. 369, 2525-2534 (2013).
- Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
- Fisher, R. A., Strom, S. C.
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Reimpressões e permissões
