Engenharia genética de células de Dictyostelium discoideum com base na seleção e crescimento de bactérias

Resumo

Dictyostelium discoideum é um organismo modelo popular para o estudo de complexos processos celulares como migração celular, endocitose e desenvolvimento. O utilitário do organismo está dependente da viabilidade de manipulação genética. Aqui, apresentamos métodos para transfect células de Dictyostelium discoideum que superar limitações existentes de cultivo de células em meio líquido.

Resumo

Dictyostelium discoideum é um intrigante organismo modelo para o estudo de processos de diferenciação celular durante o desenvolvimento, sinalização celular e outras questões importantes de biologia celular. As tecnologias disponíveis para manipular geneticamente células de Dictyostelium são bem desenvolvidas. Transfections podem ser realizadas usando diferentes marcadores selecionáveis e marcador re-ciclismo, incluindo recombinação homóloga e mutagênese insercional. Isto é suportado por um genoma bem anotado. No entanto, essas abordagens são otimizadas para linhas de célula axénica crescendo em culturas líquidas e são difíceis de aplicar às células de tipo selvagem não-axénica, que se alimenta apenas de bactérias. As mutações que estão presentes em cepas axénica perturbam Ras sinalização, causando excessiva macropinocitose necessários para a alimentação e prejudicam a migração celular, o que confunde a interpretação de transdução de sinal e quimiotaxia experimentos nessas cepas. Tentativas anteriores de manipular geneticamente células não-axénica tem desrespeitado eficiência e procedimentos experimentais complexos necessários. Nós desenvolvemos um protocolo de transfeccao simples que, pela primeira vez, supera estas limitações. Essas séries de grandes melhorias de genética molecular de Dictyostelium permitam selvagem-tipo pilhas ser manipulada tão facilmente como cepas padrão de laboratório. Além das vantagens para estudar processos de sinalização e motilidade incorrupto, mutantes que interrompem o crescimento baseado em macropinocitose agora podem ser facilmente isolados. Além disso, o fluxo de trabalho inteiro do transfection é grandemente acelerado com células recombinantes que podem ser geradas em dias em vez de semanas. Outra vantagem é que genética molecular mais podem ser realizadas com amostras de Dictyostelium selvagem-tipo recentemente isoladas do ambiente. Isso pode ajudar a alargar o âmbito das abordagens utilizadas nestas áreas de investigação.

Introdução

O gênero Dictyostelium são solo-vida ameba social que se alimenta principalmente de bactérias. Sendo colocado no filo Amoebozoa, um grande número de espécies têm sido isolado que podem ser agrupadas em quatro clados diferentes¹. A espécie Dictyostelium discoideum (d. discoideum) tornou-se um organismo modelo popular para o estudo de complexos processos celulares, tais como a migração celular e fagocitose. Para controlar e padronizar condições experimentais, a célula axénica desenvolveram-se as linhas que são capazes de crescer em meio líquido complexo ou definido na ausência de bactérias². De particular importância são o Ax2, Ax3, e Ax4 tensões, que foram todos geradas na década de 1970 e, finalmente, derivadas de uma única selvagem isolar NC4³. Ferramentas para engenharia genética foram desenvolvidas nestas cepas axénica, resultando na primeira fase publicado em 1987^4,5. Protocolos adicionais foram desenvolvidos e otimizados para uso sob condições axénica^6,7.

Adaptação desses protocolos para o selvagem-tipo d. discoideum cepas que não são capazes de crescer em caldo líquido foram tentadas por vários laboratórios. No entanto, isto não se tornou totalmente bem sucedido desde que os protocolos de transfeccao são complexos e faltam de eficiência, em parte devido a capacidade das bactérias para agir como um dissipador para o seletivo reagentes^8,9. Como resultado, essencialmente tudo moleculares dados sobre d. discoideum vem de descendentes de um único isolado do tipo selvagem. Nós queríamos superar essa limitação e desenvolver um método para modificar geneticamente as células de d. discoideum independentes de sua capacidade de crescer em meio líquido. A necessidade de tal método pode ser explicada pela observação que foi assumido no passado que as mutações permitindo crescimento axénica eram principalmente neutras e não prejudicar a fisiologia celular. Esta suposição é apenas parcialmente correta. Em geral, existem duas diferenças notáveis; em primeiro lugar, isolaram entre as diferentes cepas axénica e segundo, quando estas cepas axénica são comparadas com estirpes selvagens não-axénica^8,9.

Talvez o fator mais crítico é o chave axénica gene, MachadoB, que foi identificado recentemente como RasGAP NF1. A função principal da NF1 como um RasGAP é conter Ras atividade³. A exclusão da enzima em todas as cepas de axénica leva a excessiva atividade de Ras que se manifesta como a formação de grandes manchas de Ras ativas. Estes patches de Ras alargadas levam ao acúmulo de PIP3 na membrana plasmática. As manchas aparecendo uma coincidência de PIP3 e Ras ativo são um modelo para a formação de um plissado circular que eventualmente fecha e leva à formação de macropinosomes¹⁰. A consequência é um aumento excessivo na atividade macropinocytic. Macropinocitose é um processo orientado por actina. Uma competição para componentes do citoesqueleto para a formação de macropinosomes ou pseudopods é o resultado. Seu impacto sobre o comportamento da célula é refletido na prevenção quase completa da quimiotaxia de células vegetativas de folato¹¹. Os patches PIP3 massivamente alargados são muito persistentes. Mesmo em células de fome, os patches PIP3 permanecem em podem ser interpretados como pseudopods, que podem causar problemas de interpretação de estudos na quimiotaxia para o acampamento.

Em alguns casos, a mutação de NF1 é experimentalmente úteis. Isso nos leva a uma segunda motivação para o desenvolvimento de um método de Transfeccao para modo adulto d. discoideum células, uma vez que o aumento da taxa de macropinocitose faz com que células axénica valioso para investigar aspectos fundamentais deste processo¹² . No entanto, a mutação nos genes necessários para macropinocitose, tais como Ras e PI3-quinase¹⁰, quase aboliram axénica crescimento, tornando-se necessário para manipular estas células através do crescimento de bactérias. Outro motivo que processa baseado em bactérias transfections valiosa é a crescente utilização de Dictyostelids para explorar questões na evolução da celularidade multi^13,14, reconhecimento de parentesco^15,16, e altruísta comportamento celular, que dependem principalmente da utilização do selvagem-tipo recentemente isolado isola¹⁷. Todas mencionadas áreas de investigação podem ser facilitadas por métodos eficientes para a manipulação genética dos isolados selvagens, que são não-axénica e não cresce em caldo líquido.

Nossos protocolos permitem a superação das limitações descritas. Tomados em conjunto, a possibilidade de realizar manipulações genéticas com bactérias crescidas d. discoideum benefícios de suspensões de células para todos os investigadores Dictyostelium , mesmo se é apenas o aumento de velocidade do processo de seleção, devido ao rápido crescimento de ameba (tempo de duplicação de 4h) sobre as bactérias em comparação com o crescimento em meios axénica (10 h tempo de duplicação).

Protocolo

1. preparação de células e materiais

1. Preparação do amortecedor de SorMC
   1. Prepare 100 mL de 100 x buffer (buffer de Sorensen incluindo MgCl₂ e CaCl₂) de SorMC, dissolvendo 20,36 g de KH₂PO₄ (15 mM) e 5,47 g de Na₂HPO₄·7 H₂O (2mm) em 100 mL de água de O ddH₂. Agitar a solução à temperatura ambiente (RT) e levar o volume a 100 mL com dH₂O.
      Nota: A reserva resultante tem um pH de 6 e não precisa de mais regulação.
   2. Produzir 1000 mL de 1x solução de trabalho em ddH₂O. Adicionar 50 µ l cada de MgCl₂ e CaCl₂ para atingir concentrações finais de 50 µM cada. Filtro de esterilizar a solução usando um filtro de 0,22 µm.
      Nota: Sempre adicione MgCl₂ e CaCl₂ ao 1 x buffer para evitar a precipitação de sais no 100 x solução.
   3. Em alternativa, prepare o tampão de₂ do KK (2,2 g de KH₂PO₄ e 0,7 g de K₂HPO₄ para 1 L de reserva), suplementado com 50 µM MgCl₂ e 50 µM CaCl₂ (aqui referida como KK₂MC). Use esse buffer ao longo em vez de SorMC.
2. Preparação de bactérias como fonte de alimento para d. discoideum
   1. Usar uma única colônia de K. aerogenes e inocular 1 L de LB-médio (caldo lisogenia). Use um frasco de 2 L. Deixe as bactérias crescem durante a noite a 37 ° C, com agitação a 220 rpm.
      Nota: Se grandes quantidades de bactérias são necessárias, usar os meios mais ricos como 2xTY (extracto de levedura triptona médio) ou SOB (super ideal caldo) em vez de LB. No caso não é permitida a utilização de bactérias K. aerogenes devido a restrições de segurança, BL21 Escherichia coli pode ser usado em vez disso.
   2. Colheita das células no dia seguinte, girando-os para baixo em dois tubos de centrífuga de 500 mL a ~ 6.600 x g por 20 min. bactérias de lavar uma vez com 500 mL de tampão de SorMC.
   3. Resuspenda o pellet em 20 mL de SorMC. Verifique o OD₆₀₀ (densidade óptica em 600 nm) usando um fotômetro. Dilua com a mesma reserva para uma OD₆₀₀ de cerca de 100.
      Nota: K. aerogenes bactérias são difíceis de pelota, portanto uma velocidade relativamente alta para fiação para baixo as bactérias é necessária para evitar a perda de água bactérias. A solução resultante de ações bacteriana podem ser armazenadas por até 4 meses na geladeira a 4 ° C e manter sua utilidade como fonte de alimento para d. discoideum. 1 L de noite K. aerogenes suspensão cultivada em meio LB geralmente rende 20 mL de uma OD₆₀₀ de cerca de 100.
      Atenção: Para garantir que as bactérias preparadas são uma monocultura de K. aerogenes, execute todas as etapas, sob uma capa.
3. Preparação do buffer de eletroporação H40
   1. Preparar 100 mL de solução-tampão, dissolver 0,952 g de HEPES em ddH₂O água e adicionar 100 µ l de MgCl₂ de uma solução 1 M. Ajustar o pH 7 usando KOH para a titulação. Esterilize o buffer usando um filtro de 0,22 µm ou autoclave. Use HEPES ácida e não sal de sódio.
4. Execute a preparação do plasmídeo seguindo o protocolo do fabricante e utilizando os kits resumidos na Tabela de materiais. Use os plasmideos resumidos na tabela 1.
   Nota: A qualidade do DNA usado para transfeccao é crucial. A seleção de transfectants de d. discoideum crescendo em bactérias tem requisitos específicos para os promotores, dirigindo a seleção e expressão de gaveta (ver discussão).

nome do plasmídeo	resistência/seleção de bactérias	resistência/seleção em Dictyostelium	marca
plasmídeos de expressão extracromossômico
pDM1203	Ampicilina	G418	Não
pDM1207	Ampicilina	G418	N-terminal GFP
pDM1208	Ampicilina	G418	MCherry N-terminal
pPI159	Ampicilina	G418	MNeon N-terminal
pPI437	Ampicilina	G418	MScarlet N-terminal
pPI54	Ampicilina	G418	MTurquoise2 N-terminal
pDM1209	Ampicilina	G418	C-terminal GFP
pDM1210	Ampicilina	G418	C-terminal mCherry
pPI143	Ampicilina	G418	C-terminal mNeon
pPI459	Ampicilina	G418	C-terminal mScarlet
pPI142	Ampicilina	G418	C-terminal mTurquoise2
plasmídeos de transporte
pDM344	Ampicilina	Não	Não
pDM1019	Ampicilina	Não	N-terminal GFP
pDM1018	Ampicilina	Não	MCherry N-terminal
pPI152	Ampicilina	Não	MNeon N-terminal
pPI418	Ampicilina	Não	MScarlet N-terminal
pPI150	Ampicilina	Não	MTurquoise2 N-terminal
pDM1021	Ampicilina	Não	C-terminal GFP
pDM1020	Ampicilina	Não	C-terminal mCherry
pPI153	Ampicilina	Não	C-terminal mNeon
pPI457	Ampicilina	Não	C-terminal mScarlet
pPI151	Ampicilina	Não	C-terminal mTurquoise2
plasmídeos de expressão extracromossômico inducible
pDM1038	Ampicilina	HptII	Não
pDM1047	Ampicilina	HptII	N-terminal GFP
pDM1046	Ampicilina	HptII	MCherry N-terminal
pPI450	Ampicilina	HptII	MNeon N-terminal
pPI452	Ampicilina	HptII	MScarlet N-terminal
pPI449	Ampicilina	HptII	MTurquoise2 N-terminal
pDM1049	Ampicilina	HptII	C-terminal GFP
pDM1048	Ampicilina	HptII	C-terminal mCherry
pPI470	Ampicilina	HptII	C-terminal mNeon
pPI460	Ampicilina	HptII	C-terminal mScarlet
pPI469	Ampicilina	HptII	C-terminal mTurquoise2
act5 porto seguro visando plasmídeos
pDM1501	Ampicilina	HptII	Não
pDM1513	Ampicilina	HptII	N-terminal GFP
pDM1514	Ampicilina	HptII	MCherry N-terminal
pPI231	Ampicilina	HptII	MNeon N-terminal
pPI419	Ampicilina	HptII	MScarlet N-terminal
pPI228	Ampicilina	HptII	MTurquoise2 N-terminal
pDM1515	Ampicilina	HptII	C-terminal GFP
pDM1516	Ampicilina	HptII	C-terminal mCherry
pPI230	Ampicilina	HptII	C-terminal mNeon
pPI458	Ampicilina	HptII	C-terminal mScarlet
pPI229	Ampicilina	HptII	C-terminal mTurquoise2
Plasmídeos de expressão REMI
pDM1220	Ampicilina	HptII	Não
pDM1351	Ampicilina	HptII	N-terminal GFP
pDM1259	Ampicilina	HptII	MCherry N-terminal
pPI465	Ampicilina	HptII	MNeon N-terminal
pPI468	Ampicilina	HptII	MScarlet N-terminal
pPI466	Ampicilina	HptII	MTurquoise2 N-terminal
pDM1352	Ampicilina	HptII	C-terminal GFP
pDM1305	Ampicilina	HptII	C-terminal mCherry
pPI471	Ampicilina	HptII	C-terminal mNeon
pPI467	Ampicilina	HptII	C-terminal mScarlet
pPI472	Ampicilina	HptII	C-terminal mTurquoise2
alvo em plasmídeos de quadro
pDM1355	Ampicilina	HptII	C-terminal GFP
pPI461	Ampicilina	HptII	C-terminal mCherry
pPI462	Ampicilina	HptII	C-terminal mNeon
pPI464	Ampicilina	HptII	C-terminal mScarlet
pPI463	Ampicilina	HptII	C-terminal mTurquoise2
plasmídeos de mata-mata
pDM1079	Ampicilina	Blasticidin	Não
pDM1080	Ampicilina	Nourseothricin	Não
pDM1081	Ampicilina	HptII	Não
pDM1082	Ampicilina	G418	Não
Plasmídeos de expressão CRE
pDM1483	Ampicilina	Nourseothricin	Não
pDM1489	Ampicilina	HptII	Não
pDM1488	Ampicilina	G418	Não

Tabela 1: Lista de plasmídeo para transfections não-axénica.

5. Criação de células de Dictyostelium para transfeccao
   1. Crescer K. aerogenes a confluência no meio SM (meio de ricos em nutrientes) pernoite no RT. culturas pode ser armazenado por até 2 semanas a 4 ° C.
   2. Adicionar cerca de 400 µ l da suspensão bacteriana em uma placa de ágar de SM (peptona 10 g/L; levedura extrato 1 g/L; glicose 10 g/L; KH₂PO₄ 1,9 g/L; K₂HPO₄ x 3 H₂O, 1,3 g/L; MgSO₄ anidro 0,49 g/L; 1,7% de ágar) e espalhe uniformemente. Pegue uma ansa estéril e inocular Dictyostelium células. Espalhe as células em uma borda da placa.
   3. Incube a placa a 22 ° C, durante 2 dias para garantir que as zonas de crescimento suficientemente grande para transfeccao.
      Nota: Para Dictyostelium cepas que não zonas de grande crescimento (por exemplo, Ax3, DH1 ou JH10), ou para experimentadores inexperientes, usar placas de compensação em vez disso. Para isso, siga as instruções em passos 1.5.4 para 1.5.6.
   4. Pegue uma ansa estéril e inocular Dictyostelium células (aproximadamente 2-4 x 10⁵ células). As células de transferência de 800 µ l de uma densa K. aerogenes suspensão nas células SM Mix pipetando para cima e para baixo.
   5. Transferi 50 µ l, 200 µ l, 100 µ l e 400 µ l em placas de ágar SM frescas. Adicionar a cada µ de placa 400 l de suspensão de SM K. aerogenes adicional, espalhe uniformemente e secar.
   6. Incube as placas a 22 ° C durante cerca de 2 dias até que as placas se tornar translúcidas.
      Nota: Devido a sua taxa de crescimento mais rápida, as bactérias produzem inicialmente um gramado confluente, e as amebas posteriormente "limpar" a placa das bactérias. O tempo necessário para este processo pode diferir dependendo do fundo de tensão e a capacidade das células mutantes para crescer em bactérias.

2. a transfeccao de Dictyostelium células com base em seleção bacteriana

Figura 1 : Fluxo de trabalho para o transfection das pilhas de Dictyostelium bactérias cultivadas. As etapas para transfeccao são listadas a seguir. Desenvolvem-se células de d. discoideum num prato SM inoculado com bactérias K. aerogenes (vermelho). Colher células apenas de alimentação frente (verde), evitando as células que estão já a desenvolver (verde escuro). Lave as células em H40. Ressuspender as células para uma densidade final de 2-4 x 10⁷ células/mL. Misture a suspensão de células com 1-2 µ g de DNA. Transfira a mistura para um electroporation cubeta e pulso de células. Transferi as células diretamente após electroporation para um prato com SorMC e bactérias. Permitir que as células para se recuperar por 5h antes de adicionar o marcador selecionável. Para plasmídeos extracromossômico, adicione a seleção diretamente ao prato. Transfectants são geralmente visíveis depois de ~ 2 dias. Linear de construções de que aponta para integração único no genoma, configurar três diluições indicadas e adicionar a seleção. As bactérias são retiradas os OD₆₀₀ = 100 solução estoque. Misture os tubos bem e transferir as células em placas de cultura de tecidos de 96 poços de fundo plano. Use duas placas por diluição. Pipete 150 µ l de suspensão de células para cada poço. Demora cerca de 5 dias até colônias apertadas são visíveis. Os poços vermelhos mostram um exemplo da quantidade habitual de transformada com sucesso células obtidas (painel superior modificado de anterior publicação²²). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Para preparar pratos com K. aerogenes suspensão, adicionar 10 mL de tampão de SorMC contendo K. aerogenes bactérias para uma densidade de OD₆₀₀ = 2 (adicionar 200 µ l do preparado de OD₆₀₀ = 100 K. aerogenes solução estoque para o desejado concentração de bactérias) em um 10 cm, cultura de tecidos tratados placa de Petri.
   Nota: Esta placa é necessário mais tarde para cultivar o transfectadas d. discoideum células. Alternativamente, pode ser usada uma placa de cultura de tecidos de 6-poços. No caso de transfeccao dos Plasmideos extracromossômico, a placa de cultura de tecidos de 6-poços é mais eficiente de recursos. Usar 2 mL de SorMC K. aerogenes (OD₆₀₀ = 2) suspensão por bem.
2. Preparação de células de Dictyostelium
   1. Utilizando uma ansa de inoculação descartável 10 µ l, raspe as células provenientes das zonas de crescimento (cerca de 3 cm) da placa de cultura (borda da área desminada) ou placa de compensação. Transferência de células para um tubo de 1,5 mL contendo 1 mL de tampão de H40 gelada.
      Nota: O tempo de colheita de células de chapas de compensação é crucial. Colheita rendimento muito cedo uma quantidade muito pequena de células, enquanto a colheita para tarde aumenta o risco de ceder parcialmente desenvolvido células.
   2. Lavar as células por girando para baixo por 2 min em 1.000 x g ou flash-fiação para 2 s a 10.000 x g. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em H40 buffer para uma densidade final de 2-4 x 10⁷ células/mL. Não deixar as células durante o procedimento inteiro do transfection. Use uma pasta de água gelada para garantir o contato direto dos tubos e gelo.
3. Electroporation
   1. Adicione 100 µ l de células para um tubo com 1-2 µ g de DNA. Misturar cuidadosamente pipetando para cima e para baixo.
   2. Transfira a mistura de DNA/célula em uma cubeta de eletroporação pre-refrigerados (gap de 2 mm).
   3. As células com as seguintes configurações de onda quadrada de pulso: 350 V, 8 ms, 2 pulsos e 1 intervalo de pulso de s.
      Nota: Não adicione mais de 2 µ g de DNA. Quantidades mais elevadas são tóxicas para as células e diminuem a eficiência do transfection. O total adicionado DNA volume não deve exceder 5 µ l.
   4. Células de transferência imediatamente para o anteriormente preparado 10 cm placa de Petri com SorMC K. aerogenes e permitir que as células para se recuperar por 5h.
      Nota: Verifique as células no prato de Petri sob um microscópio invertido. Células aparecerão redondas diretamente após electroporation, mas voltará à sua forma ameboide após cerca de 30 min, quando eles tiveram tempo suficiente para fixar corretamente a superfície.
4. Seleção de transfectants: dependendo se transfeccao destina-se para gerar um nocaute, bater-em ou bater-em act5 , ou para expressar uma proteína fluorescente repórter de um plasmídeo extracromossômico, realizar o processo de seleção através de um dos a seguir descritos métodos.
   Nota: Ao contrário de células axenically crescidas, células bacteriana adultos são altamente resistentes à blasticidin. Seleção, portanto, é sempre realizada usando G418 ou hptII (ver discussão).
   1. Nocautes, TOC-ins e act5 bater-ins
      1. Desanexe as células cuidadosamente a placa de Petri, repetidamente, forçando o líquido de uma pipeta para a superfície.
      2. Configurar três diluições na suspensão de SorMC K. aerogenes (OD₆₀₀ = 2) e adicionar o agente selectivo de acordo com o resistência utilizado (ver Figura 1).
      3. Baixa diluição: misturar 9 mL de suspensão de células com 20,4 mL de SorMC e 600 µ l de solução-mãe de K. aerogenes .
      4. Diluição média: 900 µ l de suspensão de células se misturam com 28,5 mL de SorMC e 600 µ l de solução-mãe de K. aerogenes .
      5. Alta diluição: 90 µ l de suspensão de células se misturam com 29,3 mL de SorMC e 600 µ l de solução-mãe de K. aerogenes .
      6. Adicione 30 µ l de marcador selecionável (100 x solução estoque).
      7. Distribua as preparadas diluições em placas de 96 poços de fundo plano de cultura de tecidos por pipetagem 150 µ l de suspensão de células em cada poço.
         Nota: Este procedimento tem como objetivo único clones de tela, ao invés de populações. A seleção leva cerca de 5-7 dias, dependendo da construção usada.
   2. Plasmídeos extracromossômico
      1. Adicionar o marcador selecionável diretamente para o prato de 10 mL (ver Figura 1).
         Nota: Não há nenhuma necessidade de configurar diluições, desde que não há nenhum desejo para populações clonais. O processo de seleção para plasmídeos extracromossômico é mais rápido devido ao número de cópias de alta presente nas células de d. discoideum . Transfectants pode ser esperada após 32 h a 2 dias.
         Atenção: Os antibióticos usados como marcador selecionável são tóxicos. Use luvas.
5. Os clones obtidos por tranfectants positiva da tela. Para tentativas de mata-mata ou bater-nos, siga as instruções na etapa 2.5.1. Verifique o sucesso de Transfeccao para plasmídeos extracromossômico usando as instruções na etapa 2.5.2.
   1. Knock-outs, TOC-ins e bater act5 -ins, executam a tela inicial através de PCR para confirmar a integração da construção para o locus genômico correto.
      Nota: Para maximizar a probabilidade de populações clonais, use a maior diluição possível que produz transfectants após a seleção. Aponte para as placas que são um máximo de um terço dos poços ocupados.
      1. Para expandir as populações clonais, transferir clones que cresceram após a seleção da placa de 96 poços-cultura do tecido em uma placa de cultura de tecidos de 12-poços crescer células suficientes para o isolamento do DNA genômico. Fornecer a cada poço com 1 mL de SorMC K. aerogenes (OD₆₀₀ = 2) e marcador selecionável fresco.
         Nota: 1 dia é geralmente suficiente para obter um confluente bem adequado para o isolamento do DNA.
      2. Para executar mini isolamento de DNA genômico, colher as células de um poço confluente e isolar o DNA genômico, usando um mini kit de extração de DNA seguindo as instruções do fabricante.
      3. Usar o DNA genômico isolado juntamente com primers adequados e Taq-polimerase (ver Tabela de materiais) para tela PCR para integrandos positivos.
         Nota: Após a confirmação de uma integração positiva o locus genômico correta, deve ser realizada uma análise de Southern blot. Isso garante maior confiança que não ocorreram eventos inserção adicional nas regiões genômicas inespecíficos.
   2. Para proteínas fluorescentes repórter, visualmente identificar células fluorescentes positivas e verificar com um microscópio de fluorescência. Alternativamente, realize um western blot com anticorpos apropriados para identificação bioquímica.

Programa PCR
passo	temperatura	tempo
Desnaturação inicial	94 ° C	30 s
30 ciclos	94 ° C	15-30 s
	42 ° C	15-60 s
	68 ° C	1min/kb
Extensão final	68 ° C	5 min
Segure	4-10 ° C
Composição de reação
componente de	Reação de 25 μL	concentração final
10 µM Primer para a frente	0,5 Μ l	0,2 ΜM
10 µM Primer reverso	0,5 Μ l	0,2 ΜM
Modelo de DNA	variável (ca. 5 µ l)	< 1.000 ng
2 x Master Mix com Buffer padrão incluindo polimerase (ver tabela de materiais)	12,5 Μ l	1 x
Água livre de nuclease	a 25 µ l	< 1.000 ng

Tabela 2: composição de programa e a amostra PCR para a amplificação de D. discoideum DNA genômico.

Resultados

Extracromossômico plasmídeos são utilizados para estudos de repórter, que visam identificar a localização de certas proteínas dentro de uma célula ou alterações na estrutura celular das células mutantes. Para muitas abordagens, tais como controlo do ciclo celular, é fundamental expressar dois repórteres ao mesmo tempo. Isso agora é possível usando o nosso sistema de plasmídeo extracromossômico repórter dual (tabela 1). No dia 1, as células foram transfectadas antes de adicionar o marcador selecionável G418 após 5 h (Figura 1). No exemplo, NC4, DdB, Ax2 e os isolados selvagens independentemente derivados, V12M2 e WS2162 (complementar a tabela 1) foram transfectadas com o plasmídeo pPI289, que codifica para GFP-TubulinA, um marcador para microtúbulos e mCherry-PCNA, uma proteína que é usado para o monitoramento do ciclo celular(Figura 2). Após 32 h, as células foram observadas ao microscópio. A maioria das células expressa de ambas as proteínas da fusão fluorescente-etiquetadas, consistente com as anteriores relatórios essa expressão de dois jornalistas dos mesmo plasmídeo mostra expressão níveis semelhantes, que é quase impossível quando usando dois diferentes plasmídeos ^18,19. Uma célula representativa para cada linha de celular (NC4, DdB, Ax2, V12M2 e WS2162), expressar o repórter dual desejado é mostrado na Figura 2B. As eficiências de transfeccao estão resumidas na Figura2C. NC4-derivado de célula linhas mostram as melhores eficiências de transfeccao. No entanto, para linhas de células V12M2 e WS2162, obteve-se um número consideravelmente elevado de transfectants.

Figura 2 : Expressão de um plasmídeo extracromossômico. (A) extracromossômico plasmídeos são diretamente transfectados em forma circular. Por exemplo, é mostrado o repórter dual pPI289. Os sites MIV ONGindicam a inserção do segundo repórter no plasmídeo de expressão extracromossômico. (B) Z-projeção de uma célula representante expressando GFP-TubulinA (citoplasmática) e mCherry-PCNA (em grande parte nuclear) para cinco linhas diferentes selvagem-tipo de pilha usada (NC4, DdB, Ax2, V12M2, WS2162). (C) o transfeccao eficiências para as linhas de cinco célula retratadas em (B) foram calculadas. É mostrada a média dos dois experimentos. Barras de erro indicam ± SD. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Integração de um vetor de direcionamento em um locus genômico especificado é mais desafiador e exige uma análise mais cuidadosa da linhagem celular gerada. Na Figura 3, um act5- mCherry KI em NC4 é tentada. Primeiro, o plasmídeo deve ser linearizado para aumentar a frequência de eventos de recombinação seguindo do transfection. Por isso, o pDM1514 de plasmídeo é cortado com ONGMIV. Duas bandas são obtidas depois de executar o resumo em um gel de agarose. A banda de 4127 bp contém a construção desejada (Figura 3). Para transfeccao, o DNA digerido deve ser extraído do gel e purified usando um kit de extração de gel seguindo as instruções do fabricante.

Figura 3 : Preparação de act5 bater e DNA para transfeccao. Um exemplo do uso de um agir5 bata no pDM1514 o plasmídeo é mostrado. As etapas de preparação estão listadas a seguir. (A) antes de eletroporação, linearizar o plasmídeo usando os sites MIV ONGindicados. (B, C) Execute o plasmídeo cortado em um gel de agarose, até que as duas bandas esperadas são devidamente separadas. Cortar a banda de bp 4127 contendo o brasão de recombinação, mCherry e a resistência-gaveta, e gel de extrair o DNA. O DNA está agora pronto para transfeccao. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O DNA purificado foi usado para transfeccao de células NC4. Depois de 5-6 dias de seleção, foram obtidos clones. Representante do transfection eficiências e a quantidade de clones identificados positivos para vários act5 bater-em tentativas estão resumidos na tabela 3. Dois clones de transfection NC4 foram aleatoriamente escolhidos e analisados por PCR(Figura 4), e ambos mostraram os padrões de banda prevista esperado de um batida-no e mais foram validados com análise de Southern blot para garantir uma integração única evento da construção para o genoma de²⁰. O Borrão mostra uma integração clara único no locus a desejada act5 (Figura 4B). A linha de celular gerada NC4::act5-mCherry agora pode ser usada em experimentos.

Figura 4 : Validação de act5- mCherry KIs no NC4. (A) esquema e controle PCRs para a validação das integrações positivas em act5 locus. Os primers indicados foram usados para analisar dois clones independentes e o pai. Ambos os clones mostram as bandas esperadas para a resistência-gaveta e a jusante (P1) ou montante da primeira demão (P2), que não estão presentes na estirpe parental. A combinação da primeira demão (P1/P2) confirma a integração correta de gaveta mCherry e resistência para o locus act5 . O selvagem-tipo NC4 mostra a banda de bp de 2800 esperado, enquanto os dois clones KI faltam essa banda e em vez disso, exibir um produto PCR cerca de 1400 maiores de pares de bases. (B) esquema para a restrição usados digest e Southern blot. Ambos os clones de bater-se em mostram a menor banda de bp 3400, que é o resultado da integração da construção para o locus agir5, especificamente adicionais do Bcleu site na gaveta hptII resistência. Os shows do selvagem-tipo controle o esperado kb 5,8 resultantes de dois localizado a jusante Bclde sites. O Borrão foi cortado e emendado pela clareza. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

construção orientada para o locus act5	nome do plasmídeo	número de ocupados poços	número de clones verificados	Clones positivos	Corretas clones (%)	Dictyostelium estirpes utilizadas	eficiência de transfeccao (transfectants / 2 x 10 ^ 6/1 µ. g DNA)
LifeAct-mCherry	pPI226	7	7	1	14.2	AX2	3.5 x 10 ^ -6
LifeAct-GFP	pPI227	12	12	5	41,6	AX2	6 x 10 ^ -6
GFP	pDM1513	3	3	2	66,6	AX2	1,5 x 10 ^ -6
mCherry	pDM1514	3	3	1	33.3	AX2	1,5 x 10 ^ -6
GFP	pDM1513	66	9	5	55,5	AX2	3.3 x 10 ^ -5
mCherry	pDM1514	221	12	10	83,3	AX2	1.1 x 10 ^ -4
H2B-mCherry	pPI420	3	3	1	33.3	AX2	1,5 x 10 ^ -6
H2B-mCherry	pPI420	7	7	6	85,7	AX2	3.5 x 10 ^ -6
mCherry	pDM1514	10	10	7	70	DdB	5 x 10 ^ -6
mCherry	pDM1514	240	12	11	91,6	DdB	1.2 x 10 ^ -4
mCherry	pDM1514	320	12	12	100	NC4	1.6 x 10 ^ -4

Tabela 3: Transfection eficiências e a quantidade de obtidos transfectants positivo para a geração de act5 KIs em fundos de estirpe diferente ²² .

O locus de agir5 oferece a expressão relativamente homogênea do repórter integrada²¹. As células de NC4::act5-mCherry geradas permitam experiências de mistura com outros act5 batida-ins usando uma proteína fluorescente diferente como GFP. Para enfatizar a grande vantagem deste sistema, são mostrados experimentos misturando com Ax2::act5-GFP . Devido à impossibilidade de transfect não-axénica selvagem-tipo pilhas, este tipo de abordagem não pôde ser realizado antes. Experimentos de mistura são uma ferramenta importante para analisar o comportamento da célula, porque eles permitem uma comparação direta entre linhas de células diferentes, experimentando condições experimentais idênticas. NC4 células crescem mais rápido em gramados bacterianos do que células Ax2 (Figura 5A). Isto pode ser devido a uma maior capacidade de fagocitar bactérias ou melhorada capacidade de mover e mostrar a quimiotaxia para uma fonte de alimento. Usando um ensaio do chemotaxis de folato Under agar, comparação direta de uma população de NC4::act5-mCherry e Ax2::act5-GFP foi realizada, mostrando que a NC4::act5-mCherry são muito mais eficientes na detecção de ácido fólico. Após 4 h, mais NC4::act5-mCherry de células foram capazes de rastejar sob o agarose de células Ax2::act5-GFP (Figura 5B). Analisar métricas padrão da quimiotaxia das células migrando sob o agarose revelou que as células de NC4::act5-mCherry foram mais rápido e mostraram resposta quimiotático mais forte do que células Ax2::act5-GFP (Figura 5C-E ).

Figura 5 : Usando o KIs agir5 para experiências de mistura de quimiotaxia baseada em imagem. (A) NC4::act5-mCherry e Ax2::act5-GFP expressando a proteína fluorescente indicada do locus agir5 foram analisados para a capacidade de crescer em um gramado bacteriano. Após 4 dias, foram medidos o diâmetro de placa surgido a partir de células de Dictyostelium chapeadas solitárias. Non-axénica act5:: NC4 células fazer placas significativamente maiores do que axénica células de Ax2::act5-GFP (média ± DP, * * * p < 0,0001, n = 3, escala bar 5 mm). (B) para uso da quimiotaxia de folato sob-agarose ensaio²² para comparar diretamente as habilidades Quimiotáticos dos NC4::act5-mCherry e Ax2::act5-GFP usado no (A), bactérias-crescido amibas de ambas as cepas foram misturadas na proporção de 50: 50. As células foram autorizadas a rastejar sob o agarose. Após 4 h, as células que estavam migrando para o gradiente de folato foram fotografadas usando um microscópio confocal. O número de células de NC4::act5-mCherry e Ax2::act5-GFP foi então determinado. NC4::act5-mCherry células foram mais eficientes na detecção de ácido fólico. Sobre 10 vezes mais NC4::act5-mCherry células foram encontradas em comparação com as células Ax2::act5-GFP (média ± DP, * * * p < 0,0001, n = 6, escala bar 100 µm). (C, D) As células foram filmadas por 60 min, e sua velocidade e índice de quimiotático foram calculados. Após a pré-selecção das células chemotactically mais responsivos (somente aqueles que migraram sob o agarose), Ax2::act5-GFP células apresentaram valores inferiores para velocidade de célula e quimiotaxia. Foram analisadas 50 células por linha celular. (média ± DP, * 0,01 < p, n = 3). (E) as faixas de NC4::act5-mCherry e Ax2::act5-GFPact5 bate-ins são plotadas mais de 60 min, mostrando o movimento mais direcionado para a fonte de chemoattractent das células NC4::act5-mCherry (média ± DP, * * * p < 0,0001, n = 6). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As linhas de batida-na célula act5 também podem ser usadas por citometria de fluxo. Com o crescimento de bactérias, existem grandes diferenças de desenvolvimento entre cepas axénica e selvagem-tipos não-axénica. Após o desenvolvimento, os corpos frutíferos dos NC4 as células são aproximadamente duas vezes tão grandes quanto aqueles derivados de células Ax2. Se as células são misturadas, um corpo de frutificação tamanho intermediário é obtido. Para analisar a contribuição de ambas as linhas celulares mais quantitativamente, citometria de fluxo foi usada. Essas análises mostraram claramente que os corpos frutíferos de tamanho intermediário são devido aos diferentes níveis de contribuição de ambas as linhas de célula. Enquanto as células de NC4::act5-mCherry é composta por cerca de 75% dos esporos medidos, Ax2::act5-GFP contribuiu com apenas 25%, revelando uma potencial vantagem de aptidão para estirpes não-axénica (Figura 6). Desde que a análise não monitora a população da pilha de haste, existem duas possibilidades para explicar o desequilíbrio no desenvolvimento entre Ax2 e NC4. Uma possibilidade é que células Ax2 contribuam principalmente para a população da pilha de haste, ao invés de inserir a população celular do esporo. Como alternativa, mais células NC4 podem entrar no ciclo de desenvolvimento, com Ax2 relativamente atrasado, e são consequentemente incapazes de contribuir para a montagem de um corpo frutífero. A possibilidade de transfect não-axénica selvagem-tipo pilhas desenvolve ainda outras abordagens e simplifica procedimentos experimentais.

Figura 6: ato5 KIs permitem a análise das experiências de mistura usando citometria de fluxo. (A) NC4::act5-mCherry e Ax2::act5-GFP foram desenvolvidos separadamente ou em uma mistura de 50: 50 em placas de ágar não-nutriente. NC4::act5-mCherry células formam corpos frutíferos maiores do que Ax2::act5-GFP. Em vez disso, o mix mostra um tamanho intermediário (escala bar 5 mm). Microscopia de fluorescência confocal luz sugere uma maior quantidade de esporos de NC4::act5-mCherry nas cabeças dos esporos derivados de misturas. (B) para quantificar esta observação, os montantes de esporos no spore colhido cabeças da mistura experimental no (A) foram analisadas por citometria de fluxo. Cerca de 75% dos esporos originou-se de células de NC4::act5-mCherry , com apenas 25% de células Ax2::act5-GFP . (C) representante distribuição de esporos de ambas as linhas de célula mostradas em uma dispersão de citometria de fluxo. Cerca de 0,05% mostrar positivo mCherry e GFP sinaliza, sugerindo que os processos de fusão parassexuais ocorreram ou que esporos são colam uns aos outros. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Linha celular	Geneticamente, fundo	Número de referência	Publicado antes	Tipo
AX2 (Ka)		DBS0235521	Bloomfield et al., 2008	tipo selvagem
NC4 (S)			Bloomfield et al., 2008	tipo selvagem
act5::mCherry Clone 5	NC4	HM1912	Paschke et al, 2018	batida-em act5
act5::GFP 2 Clone	AX2	HM1930	Paschke et al, 2018	batida-em act5
V12M2			Bloomfield et al., 2008	tipo selvagem
WS2162			Bloomfield et al., 2008	tipo selvagem

Suplementares tabela 1: diferentes cepas de Dictyostelium estudou.

Discussão

O uso de células de Dictyostelium não-axénica, selvagem-tipo tem sido muito limitado até agora na investigação molecular. Métodos disponíveis para a engenharia genética destas cepas tem desrespeitado a confiabilidade e eficiência²³, impedindo sua aprovação geral. Os materiais gerados e os protocolos aqui apresentados podem ser usados para qualquer tipo de d. discoideum independente de sua capacidade de crescer em meio líquido. Deve ser mencionado que este protocolo é otimizado para linhas celulares NC4-derivado. Eficiências de Transfeccao para recém isoladas estirpes do selvagem diferem NC4, como temos observado antes e são mostrados aqui para V12M2 e WS2162^8,9. As condições de eletroporação em particular parecem ter uma influência considerável na eficiência do transfection e podem requerer novas otimização para algumas estirpes. Em geral, uma quantidade suficiente de transfectants foram observadas em todas as cepas testadas até o momento, mostrando que esses métodos são praticáveis. O número de transfectants positivos obtidos usando cepas NC4-derivado é superior comparado a outras estirpes de tipo selvagem não-axénica, mas em todos os casos, um número suficiente de transfectants é obtido para permitir novas experiências. Isto, mais a simplicidade do nosso protocolo, é a grande melhoria em comparação com anteriores tentativas^8,9.

Estes novos protocolos não-axénica cobrem todos os procedimentos padrão de genéticos e adicionar outras vantagens, já que transfections podem ser realizadas rapidamente e eficientemente em paralelo. Clones positivos podem ser obtidos em dias em vez de semanas, desde que o crescimento em metades de bactérias o tempo de divisão. Os recém-criada plasmídeos também trabalham sob condições axénica e podem ser usados rotineiramente em ambas as condições de crescimento, que é outro avanço esta methology²². Introduzido no protocolo, o plasmídeo utilizado para a seleção de bactérias têm necessidades especiais que são cruciais para o sucesso do transfection. Em particular, os promotores as fitas de expressão e a resistência de condução são importantes para o sucesso do transfection. O promotor usado frequentemente act6 (actina 6)²⁴ para conduzir as fitas de resistência ou expressão carece de eficiência quando as células são cultivadas em bactérias. Em nosso sistema de plasmídeo, o promotor altamente ativo act15 (actina 15) dirige todas as fitas de expressão, enquanto as fitas de resistência estão sob o controle de um promotor de coA (coactosin A), ambos dos quais são ativos em condições axénica e em células cultivadas em bactérias. Requisitos para a expressão da repórter constrói assim como TOC-no e nocaute construções tornam necessário usar nosso repertório do plasmídeo, mas infelizmente limita o uso de vetores já criado que usam o promotor ineficiente act6 .

A eficiência de promotor é especialmente crítica para transfections que dependem de um evento de integração único para o locus genômico correto. Devido a nossa melhoria dos promotores dirigindo a expressão do gene de resistência, proteína suficiente resistência é produzida a partir de integrações único locus. Das principais preocupações foi o favorecimento de múltiplas integrações no genoma da quando usando hptII ou G418 conforme descrito. Não há favorecimento de múltiplas integrações tem sido observado até agora, como relatado anteriormente para seleções de G418 usando de sistemas mais velhos promotor²⁵. Isto significa que tanto hptII e G418 são marcadores selecionáveis apropriados para a geração de nocautes limpos e batida-ins. infelizmente, o marcador selecionável blasticidin não funciona em condições não-axénica. Esta é uma grande desvantagem do nosso método, desde que a fita de resistência blasticidin rotineiramente é usada para gerar construções de mata-mata em d. discoideum. Construções que já foram geradas com fitas de resistência blasticidin precisará ser rederived usando um dos marcadores selecionáveis praticáveis. Outra possibilidade para superar essa limitação é combinar a recém criada axénica d. discoideum CRISPR tecnologia com este protocolo de transfeccao²⁶. A geração de guia apropriada, único RNAs (sgRNAs) é mais simples e mais rápido do que a reconstrução das construções de nocaute completas. Para direções futuras, a possibilidade de gerar vários nocautes usar CRISPR/Cas9 combinado com este protocolo de transfeccao é atraente e pode pavimentar o caminho para muitos pesquisadores na Comunidade Dictyostelium . No entanto, a viabilidade do sistema estabelecido expressão transiente usado para CRISPR/Cas9 em células cultivadas axénica deve ser cuidadosamente examinada.

O act5 bater no sistema apresentado oferece um sistema de integração confiável e seguro para a geração de linhas de células estáveis em d. discoideum, com a vantagem de sites semelhantes estabelecidos em outros organismos²². Isso também depende de um evento de integração único no genoma e oferece muitas possibilidades para as direções de pesquisa diferente. O promotor de act5 é fortemente ativo e garante a expressão quase homogênea²⁷ independente das condições de cultivo. Proteínas fluorescentes repórter podem ser facilmente integradas neste locus de porto seguro usando o plasmídeo engenharia de direcionamento. Isso pode ser útil, por exemplo, para fins de rastreamento de celular, como mostrado aqui em um experimento de mistura. As células mostram a variabilidade de expressão mínima de célula para célula, que pode auxiliar na célula automatizada de rastreamento. Importante, a inserção de uma sequência desejada para o locus agir5 aparece fenotipicamente neutro^28,29. Como a expressão não depende de um marcador selecionável para manter a expressão da proteína, como pode ser visto em interagentes aleatório ou linhas de células extracromossômico vector-rolamento, o sistema de act5 pode ser útil para experimentos de resgate, também. Desde que as linhas de célula são homogêneas, todas as células podem ser analisadas. Isso não é possível usar um plasmídeo extracromossômico para expressão, em que há considerável heterogeneidade na expressão.

Além dessas melhorias gerais para todas as estirpes, a capacidade de usar células não-axénica do selvagem-tipo para a investigação molecular permite uma avaliação dos efeitos das mutações acumuladas em cepas de laboratório atual. Vários rearranjos genéticos foi encontrado desde a adopção da estirpe Ax2 em 1970, como mostrado por microarray previamente publicado análises²⁶. Fenótipos sintéticos são observados devido à presença destas mutações. Por exemplo, um mutante relatado phg2 mostra diminuição da adesão em um plano de estirpe de laboratório e adesão aumentada em mais³. Tais dados conflitantes podem ser resolvidos agora, repetindo o experimento na estirpe ancestral comum (no caso, DdB). A força desta abordagem tem sido mostrada recentemente para a pequena GTPase RasS^30,31.

A capacidade de realizar experiências genéticas em qualquer estirpe de d. discoideum expande o potencial de novas direções de pesquisa que dependem da utilização de isolados silvestres, notadamente aqueles que envolvem o ciclo sexual²², reconhecimento de parentesco e evolução social.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Equipment
Eppendorf Microcentrífugas 5424/5424R	ThermoScientific	05-400-002
Centrífugas Eppendorf 5702R com Rotor Modelo A-4-38	ThermoScientific	12823252
Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal Cyclers	Sigma Aldrich	EP6331000025
Gene Pulser X Cell, incluindo CE & Módulos para PC	BioRad	1652660
Armário de segurança Foruna - SCANLAF	Labogene
Biofometer Plus	Eppendorf
CLSM 710	Zeiss
Media & Agaroses
LoFlo Medium	Formedium	LF0501
Seakem GTG Agarose	Lonza	50071
Low EEO Agarose	BioGene	300-200
Purificado Agar	Oxoid	LP0028
SM caldo	Formedium	SMB0102
2x LB caldo	Formedium	LBD0102
Chemicals
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoScientific	S33102
1 Kb Plus DNA Ladder	ThermoScientific	10787018
1 Kb DNA Ladder	NEB	N3232L
HEPES ácido livre	Sigma Aldrich/Merck	391340 EMD
KH2PO4	VWR	P/4800/53
Na2HPO4 * 2 H2O	VWR	10028-24-7
MgCl2 * 6 H2O	Sigma Aldrich/Merck	5982 EMD
CaCl2 * 2 H2O	Sigma Aldrich	442909
Ácido fólico	Sigma Aldrich	F7876
KOH	VWR	26668.263
Cultur Dishes
96 Cluster de cultura de células de poço, fundo plano com tampa de baixa evaporação,	Corning Incorporated	3595	tratado com cultura de tecidos
Cultura de Células de 6 Poços, Fundo Plano com Tampa, Placa	Corning Incorporated	3516
Estilo 100 x 20 mm,	353003 de		da Corning Incorporated
No1.5	MatTek Corporation	P50G-1.5-30-F
Antibióticos
Geneticina G418-sulfato Gibco	da Life Technologies	11811-023
Hygromycin B Gold	InvivoGen	ant-hg-1
Consumíveis adicionais
2 mm gap eletroporation cuvettes, eletrodo longo	Geneflow Limited	E6-0062
10 µ L, Azul 10 Micro L	Espalhador 129399		ThermoScientific
, em forma de L, greiner estéril	bio-one	730190
Combitips advanced 5 mL	Eppendorf BIOPUR	30089669
Kits
ZR Plasmid Miniprep Classic	Zymoresearch	D4016
Quick DNA Kit Miniprep	Zymoresearch	D3025
Kit de recuperação de DNA Zymoclean	Zymoresearch	D40002
< enzimas > fortes< / enzimas >
	NEB
OneTaq 2X Master Mix com tampão padrão	NEB	M0482L
T4 DNA Ligase	NEB	M0202S
PrimeSTAR Max DNA Polimerase	TakaraBio	R045A