Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Улучшенная и высокой пропускной способности Assay микро нейтрализация респираторно-синцитиальный вирус (RSV)

Published: January 26, 2019 doi: 10.3791/59025
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 3, 1,2,4, 1,2
1Murdoch Children's Research Institute, 2Department of Paediatrics, University of Melbourne, 3School of Chemistry and Molecular Bioscience, University of Queensland, 4London School of Hygiene and Tropical Medicine

Summary

Это исследование описывает высокую пропускную способность, на основе изображений микро нейтрализация пробирного определить титр нейтрализующих антител специфических для респираторно-синцитиальный вирус (RSV). Этот assay формат был протестирован на различных образцов типов.

Abstract

Органов дыхания-синцитиальный вирус специфических нейтрализующие антитела (RSV NAbs) являются важным маркер защиты против RSV. Количество различных пробирного форматов в настоящее время используются во всем мире так что необходимо для точной и высок объём метода измерения RSV NAbs. Мы опишем здесь на основе изображений микро нейтрализация assay который был протестирован на RSV подгруппы A и также может быть адаптирована для RSV подгруппы B и различные примеры типов. Этот метод является весьма воспроизводимость, с вариациями между анализами для ведения антисыворотки, менее 10%. Мы считаем, что этот assay может быть легко установлена во многих лабораториях во всем мире при относительно низких затратах. Разработка улучшилось, высок объём assay который измеряет RSV NAbs представляет собой значительный шаг вперед для стандартизации этот метод на международном уровне, а также имеют решающее значение для оценки Роман RSV вакцина кандидатов в будущем.

Introduction

Респираторно-синцитиальный вирус (RSV) является ведущей причиной инфекции нижних дыхательных путей в педиатрической населения во всем мире1. Несмотря на его высокое бремя существует до сих пор нет вакцины или лечения доступны. С 2013 года Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) объявила RSV вакцина развития как приоритет крупных исследования, с ежегодной встречи ВОЗ консультации2,3. ВОЗ согласовали использование RSV, нейтрализуя антитело (NAb) измерения для мониторинга иммуногенность вакцины, как это признается в качестве основных серологических маркеров защиты4. Цапает было показано, чтобы защитить от тяжелой инфекции RSV в ряде исследований, а также клинические испытания palivizumab анти RSV моноклональных антител, в настоящее время только профилактические стратегии доступны4.

Есть несколько форматов пробирного NAb, используемых в лабораториях во всем мире, в том числе на основе клеток и молекулярные анализы, которые предприняли усилия стандартизации сложной5,6,,78. Однако обычные налета снижение нейтрализации (PRN) assay, который измеряет количество сокращение зубного налета, образуя единиц (ОРП) присутствие RSV-специфические антитела остается золотой стандарт9. Здесь мы приводим улучшение, упрощенная и высок объём PRN протокол, который может использоваться в многочисленных клеточных линий, с повышенной пробирного пропускную способность различных штаммов RSV и. Этот протокол был протестирован с помощью клинических образцов из различных параметров, а также на образцах из животных модельных экспериментов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: Все шаги должны быть выполнены в капюшоне BSL2, если не указано иначе. Вирусная титрования требуется заблаговременно PRN анализа для определения оптимальной концентрации RSV, используемых в PRN assay. Рекомендуется Алиготе запасов вируса в небольшом объеме, который будет разморожен раз и используется для калибровочных наб. Также рекомендуется использовать тот же вирусные запас для всех анализов NAb, выполняются для всех образцов из одного исследования. Убедитесь в культуре средств массовой информации и фосфат амортизированное saline (PBS) нагревается при 37 ° C перед добавлением в ячейку пластины.

1. RSV вирусных титрования

Примечание: В зависимости от количество запасов вируса и число дубликатов пробирного пластины можно настроить согласно рис. Каждого штамма вируса следует титруют в трех экземплярах вниз пробирного пластины, начиная на самую высокую концентрацию вирусной (т.е. 1:10). Серийный титрование может быть как правило 1:10. Культура клеток A549 и обслуживания, а также RSV культуры процедуры выполняются с использованием стандартных процедур и не включены в этот протокол.

  1. Заполнение пластин (1 день)
    1. Ресуспензируйте A549 клетки в Дульбекко орлы, изменение среднего (DMEM) + 10% плода телячьей сыворотки (FCS) + 1000 МЕ пенициллина/стрептомицина (ручка/воспаление) в 4 x10/5мл. Семя 96-луночных с плоским дном стерильных пластин с 100 мкл/хорошо, содержащих 4 х 104 A459 клетки.
    2. Инкубировать пластины на ночь при 37 ° C, 5% CO2 (клетки будет в лаг фаза роста).
      Примечание: Используйте новый A549 клеток флакон после 23 проходы. Рекомендуется чтобы не начать эксперименты когда новый флакон клетки все еще находится на первых трех проходов.
  2. Вирусной инфекции (день 2)
    1. Подготовка вирус серийный разрежения
      1. Быстро разморозить единого замороженных флакон RSV в ванну воды 37 ° C до тех пор, пока почти полностью разморозить и место сразу на льду. Подготовка 3 реплицирует для каждого RSV фондовой вирус быть assayed, использовать первоначальный вирус запасов разбавления 1:10 с 100 мкл разбавленного вирус/Ну и зарезервировать по крайней мере один столбец для отрицательного контроля.
        Примечание: Рисунок 1 показывает отрицательный контроль в triplicates.
      2. Добавить 100 мкл каждого разреженных вируса в 1:10 в трех экземплярах строки A 96-Ну U-дно стерильные пластины. Добавление строк B ч. 90 мкл/хорошо DMEM + 1000 МЕ перо/воспаление без FCS
      3. Выполнить последовательный 1:10 разведений вниз плита путем перевода 10 мкл от строки строки B. Mix решение дозирования содержание вверх и вниз 5 раз И продолжать десятикратный разведениях до строки H. Discard окончательного 10 мкл, так что окончательный объем в каждом хорошо 90 мкл.
        Примечание: Важно использовать новые советы для каждого разведения.
    2. Прививка вирус A549 клетки
      1. Получить A549 cell plate(s), подготовленных в предыдущий день. A549 клетки монослои в 96-луночных пластины обеспечивают ~ 80% притока. Отказаться от СМИ, нежно инвертирование пластины и слегка промокательной стерильные абсорбирующие бумажные полотенца.
      2. Вымойте все скважины с 100 мкл PBS дважды, отказаться от избыточного PBS, нежно инвертирование пластины и слегка промокательной на стерильные абсорбирующие бумажные полотенца после каждой стирки. Не позволяйте пластины для просушки.
      3. Передавать вирус разведениях от вирусных титрования пластины (рис. 1) соответствующего скважин на плите A549 клеток. Инкубируйте пластину за 1 ч при 37 ° C, 5% CO2. После инкубации 1 h сцеживаться supernatants с помощью пипетки (чтобы избежать перекрестного загрязнения). Вывезти 90 мкл/хорошо.
      4. Добавить 100 мкл 1 x среда 199 (M199, смотрите таблицу материалы) + 1,5% карбоксиметилцеллюлоза натриевая соль (CMC) низкая вязкость + 2% FCS, содержащие перо/strep для каждой скважины.
        Примечание: 2 x M199 + 4% FCS + 2% перо/воспаление и 3% CMC решения должны быть подготовлен заранее и хранить при 4 ° C для использования в будущем. Убедитесь, что решение нагревается при 37 ° C перед добавлением в плитами.
        1. Готовить 2 x M199 решение: 1 пакетик/500 мл дистиллированной воды + 20 мл FCS + 10 мл перо/стрептококк (сделать 2 x MI99). Фильтр решения с помощью блок фильтра 0.22 мкм.
        2. Для приготовления 3% CMC, добавить 15 g CMC медленно в 500 мл дистиллированной воды. Растворите CMC в воде с помощью металлических мешалкой нагреватель при 50 ° C, который занимает около 1 h подготовки. Смесь хорошо, чтобы сделать 3% CMC и автоклав решение.
          Примечание: Твердых CMC должны быть добавлены в воду, чтобы быть распущена; Добавление воды в сухой твердый производит «комок» твердых, это очень трудно растворить.
        3. Подготовить 1 x M199 + 1,5% CMC низкой вязкости, + 2% FCS, содержащих перо/воспаление путем смешивания 1:1 2 x M199 и 3% CMC подготовлен на шаге 1.2.2.4.2.
      5. Инкубируйте 3 дней при 37 ° C, 5% CO2пластины.
  3. Разработка пробирного пластины и анализа (день 5)
    1. Фиксация и развивающихся пробирного пластины
      1. Отказаться от M199 + СМС + 2% FCS содержащие перо/стрептококк, нежно инвертирование пластину. Медленно добавьте (во избежание нарушить слоя клеток) 200 мкл фиксации буфера (80% ацетона, 20% PBS, хранятся при температуре-20 ° C) исправить клетки. Инкубируйте в-20 ° С 20 мин.
      2. Отмена фиксации буфера и аккуратно пятном на абсорбирующий бумаги полотенце. Оставьте пластины лицо до сухой за 10 мин.
        Примечание: От этого шага анализа может быть выполнена вне BSL2 Худ.
      3. Подготовить 5% молока разбавителя блокирования решения в отфильтрованных PBS, содержащие 0,05% Полисорбат 20 (PBS-полисорбат, смотрите Таблицу материалы). Для одной пластины, вычислить объем, необходимые для блокирования основан на 200/110 и скважин: 200/хорошо x 110 скважин = 22 мл (1.1 мл концентрированный молока разбавителя в 20,9 мл фильтруют PBS-Полисорбат). На данном этапе также составляют достаточно блокировки решение для первичных и вторичных антител. Для одной пластины, вычислить объем, необходимый для каждого антитела решения, основанные на 50/хорошо и 110 скважин: 50/также x 110 скважин = 5,5 мл. Таким образом общий объем разбавителя молока, преграждая разрешение требуется для assay одной пластине составляет 33 мл.
      4. Добавьте 200 /well блокирования решения. Инкубируйте пластины при комнатной температуре (RT) 30 мин отменить решение, нежно инвертирование пластину и пятно на абсорбирующий бумаги полотенце.
      5. Подготовка 1: 500 X RSV коза антитела (МАБ – основное антитело) разводят в преграждая разрешение. Добавьте 50 /well раствора МАБ и Инкубируйте на 37 ° C в течение 1 ч. мыть плиты 3 раза с отфильтрованной PBS-Полисорбат.
      6. Подготовка 1:5,000 Alexa-Fluor осла анти коза IgG (вторичное антитело) разводят в преграждая разрешение. Добавьте 50 /well вторичное антитело решения и Инкубируйте на 37 ° C в течение 1 ч. мыть плита 5 раз с отфильтрованной PBS-Полисорбат.
      7. Читать пластины на читателя автоматизированной пятна с помощью флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC) канала и рассчитывать параметры как показано на рисунке 2. Обернуть тарелку в фольгу и хранить при 4 ° C. Калибровка инструмента с помощью неиспользуемых 96-луночных культуры пластины и ввод перед пробирного количество параметров.
        Примечание: Повторное сканирование в течение нескольких дней возможна, если требуется. Калибровки и настройки игр может быть сохраняются и используются для будущего сканирования, если assay использует тот же тип плиты, используемые для калибровки.
      8. Проверка изображения скважин для металлических пластинк артефакт или нарушена клеток монослои (рис. 3). Исключите скважин с монослои нарушается клеток.
        Примечание: В зависимости от размера артефакт бляшек ручной учет может потребоваться выполнить для этих скважин или этих скважин может потребоваться быть исключены из анализа данных. Критерии для допустимый результат включать не нарушается клетки однослойная или артефакт бляшек, обнаружены в более чем одной репликации хорошо и не PFU, обнаружены в отрицательных скважин (скважины без дополнительного вирус).
    2. Определить вирусную концентрации
      1. Выберите два последних разведений, где пятна могут быть подсчитаны ясно. Вычислите среднее количество пятен от реплицировать скважин на же разрежения. Вычислите вирусный титр (ОРП в мл) акций образца, используя формулу ниже:
        ОРП/мл = среднее количество металлических пластинк / (× коэффициент разбавления объем разреженных вируса добавляется колодец)
        Примечание: Концентрация вируса, определяется для каждой акции RSV теперь может использоваться в assay PRN (шаг 2).

2. RSV нейтрализации Assay

  1. Заполнение пластин (1 день)
    1. Ресуспензируйте A549 клеток в среде DMEM + 10% FCS + 1000 МЕ перо/воспаление в 4 x 105/мл. Семя 96-луночных плоскодонные стерильных пластин с 100 мкл/хорошо, содержащий 4 х 104 A459 клеток и инкубировать пластины на ночь при 37 ° C, 5% CO2 (клетки будет в лаг фаза роста).
      Примечание: Используйте новый A549 клеток флакон после 23 проходы. Не рекомендуется использовать A549 клетки до прохода номер 3.
  2. Вирус и сыворотки подготовка (день 2)
    Примечание: В зависимости от типа образца есть необходимые шаги для предварительной обработки образцов до наб assay. Рекомендуется использовать RSV международного стандарта sera, которые теперь доступны по запросу от национальном институте биологических стандартов и контроля (NIBSC).
    1. Подготовка разведения сыворотки
      1. Оттепель человека антисыворотка RSV ссылки (ссылка сыворотки, REF) и сыворотки пробы на образцы сыворотки инактивировать RT. тепла и ссылки антисыворотка на водяной бане в 56 ° C за 30 мин до использования. Приготовляют разведения согласно шаблоне пластины (рис. 4).
      2. Подготовить разбавления 1: 100 REF. подготовки минимум 110 мкл REF, разбавленных в среде DMEM + ручка/воспаление без FCS каждой пластины пробирного (например, 1,5 мкл REF в общем объеме 150 мкл). Добавить 110 мкл 1: 100 разбавленный REF в хорошо A12 96-Ну U-дна стерильные пластины.
      3. Добавьте 55 мкл DMEM + ручка/воспаление без FCS скважин B12 H12 в колонке 12. Выполните последовательный разведения 1:2 вниз плита передачи 55 мкл из строки A в строке B, Смешивание раствора путем дозирования содержание вверх и вниз 5 раз и продолжая до строки H. Discard окончательный 55 мкл СМИ так что окончательный объем в каждом хорошо 55 мкл. Используйте новые советы для каждого разведения.
      4. Подготовьте разбавления 1: 100 сыворотки испытания образцов. Как все образцы сыворотки assayed в трех экземплярах, подготовить минимальный объем 110 мкл/хорошо x 3 = 330 мкл в сыворотке испытательного образца.
      5. Добавить 110 мкл каждого испытательного образца разреженных сыворотки (1: 100; S1 = сыворотки 1, S2 = сыворотки 2 и т.д.) соответствующий скважин A1 к A9 и также E1 для E9 96-луночных стерильные пластины согласно рис.
      6. Добавление 55 мкл DMEM + ручка/воспаление без FCS для всех скважин помечены X. Perform серийный разведения 1:2 в соответствии с шагом 2.2.1.3 до строки D (для образцов 1, 2 и 3). Отказаться от окончательного 55 мкл СМИ, так что окончательный объем в каждой скважине 55 мкл. Аналогичным образом выполните грамматический определенный член серийный разведения 1:2 для образцов, 4, 5 и 6 для строк Е ч.
        Примечание: Важно использовать новые советы для каждого разведения.
      7. Добавьте 55 мкл DMEM + ручка/воспаление без FCS скважин в колонках 10 и 11.
    2. Подготовка вируса
      1. Быстро разморозить единого замороженных флакон RSV в ванну воды 37 ° C до тех пор, пока почти полностью разморозить и место сразу на льду.
      2. Разбавьте вирус в среде DMEM + ручка/воспаление без FCS, основанные на концентрации RSV Алиготе, определенный на шаге 1.3.2. Примените разрежения, которая дает примерно 200 ОРП хорошо. Подготовьте общий объем по 5,5 мл (для 100 скважин).
    3. Подготовка смеси вирус сыворотка
      1. Добавьте 55 разреженных вируса все скважины столбцов 1-9 и скважин строк E-H колонок 10 и 11 (положительный контроль) согласно шаблоне пластины (рис. 4).
      2. Добавление 55 DMEM + ручка/воспаление без FCS для всех скважин строк A-D колонок 10 и 11 (отрицательный контроль). Инкубируйте пластину за 1 ч при 37 ° C, 5% CO2.
    4. Прививка вирус A549 клетки
      1. До завершения периода инкубации получить A549 cell plate(s), подготовленную на этапе 2.1.1. A549 клетки монослои в 96-луночных пластины обеспечивают ~ 80% притока.
      2. Отказаться от СМИ, нежно инвертирование пластины и слегка промокательной стерильные абсорбирующие бумажные полотенца. Вымойте все скважины с 100 мкл PBS дважды, отказаться от избыточного PBS, нежно инвертирование пластины и слегка промокательной на стерильные абсорбирующие бумажные полотенца после каждой стирки. Не позволяйте пластины для просушки.
      3. 100 /well вирус сыворотка смеси передать соответствующий скважин на табличке клеток A549, после шаблоне пластины инкубировать пластину за 1 ч при 37 ° C, 5% CO2.
      4. После того, как 1 h, с помощью пипетки, взять 90/хорошо и добавить 100 подогретую 1 x M199 + 1,5% CMC + 2% FCS + ручка/воспаление. Инкубируйте 3 дней при 37 ° C, 5% CO2пластины.
        Примечание: Убедитесь, что решение нагревается при 37 ° C перед добавлением в плитами.
  3. Разработка пробирного пластины и анализа (день 5)
    1. Разработка фиксации и пробирного пластины, следующие шаги 1.3.1.1 до 1.3.1.8.
    2. Определить титр нейтрализации 50%
      1. Определите, что 50% нейтрализации титр путем расчета пропорциональной расстояние между разведений взаимные сыворотке выше и ниже 50% «не сыворотки» управления скважин (положительный вирус управление - в колонке 10, строки E-H).
      2. Подсчитать количество PFU (то есть, бляшками) вытекающие из отдельных вирусных инфекций в сыворотке скважин и скважин управления не сыворотки. Вычислить среднее количество PFU не сыворотки контроля скважин и определить значение 50%.
      3. Идентифицировать разведения сыворотки с графов, которые немедленно выше и ниже 50% стоимости не сыворотки контроля скважин. С помощью полулогарифмический график или шаблон электронной таблицы, участок количество ОРП на оси x (линейной шкалы) и взаимные сыворотки разрежения на оси y (журнал10 шкала). Нарисуйте линию между двумя точками и прочитать 50% нейтрализации титры испытания образцов сыворотки от этой линии.
        Примечание: RSV PRN пробирного листа (Дополнительный лист) используется для определения титра нейтрализации 50%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Титрование запасов вируса была выполнена с 1:10 до 1:108 разрежения для определения запасов концентрация вируса до пробирного PRN (представитель результаты, показанные на рисунке 5). Рисунок 5, PFU может учитываться надежно в разведениях от 1:104 и 1:10-5. Было рассчитано среднее количество ПФУ от трех экземплярах скважин на же разрежения. С среднее количество пятен в 1:10,5 разведение было 14 вирусный титра этот вирусный запас было определено следующим образом:

14 (среднее число пятен) / [10-5 (ослабление) x 0,1 мл (объем посевным материалом)] = 1.4 x 107 ОРП/мл

Используя выше описанный метод, мы измерили NAbs для обоих RSV-A и B в образцах. Рисунок 6 иллюстрирует интерпретация хорошо изображений образцов три представителя сыворотки с различной NAb титры против RSV-A. Рисунок 6A хорошо показывает изображения образца титрования реплицирует для каждого представителя сыворотки (пластину фактической пробирного имел три технических реплицирует). Сыворотка разведениях как указано различны для каждого образца. Вирус контроля скважин, содержащие только вирус и не сыворотки были их средний PFU рассчитывается и используется для определения минимально приемлемого уровня 50% нейтрализации, который в этом примере было 52. Рисунок 6B иллюстрирует, как титрования трех sera было определено с помощью этого производства. Взаимные2 журнала разведения сыворотки строится на оси x и количество ОРП в процентах от элемента управления по оси y. Символ и планки погрешностей представляют собой среднее triplicates ± стандартное отклонение. Пятьдесят процентов среднего пятен в вирус контроль скважины (обозначен горизонтальной пунктирной линией) использовался как отсчета для определения 50%, нейтрализуя антитела титр сыворотки образца. Титр нейтрализующих антител определяется как обратную величину разрежения, которая приведет к 50% ингибирования вирусной активности.

Как каждый эксперимент включает RSV ссылка антисыворотка и позитивные вируса контроля скважин, мониторинг изменчивости между анализами обеспечивает контроль качества между экспериментов. Рисунок 7 показывает результаты RSV-A PRN assay в двух различных когорт взрослых из когорты Гамбия (N = 21)10 и здоровых добровольцев в Мельбурне (N = 36). Титры RSV NAb были переменной внутри каждой популяции, с Гамбии взрослых с ниже средней NAb титр, по сравнению с взрослыми Мельбурна. RSV ссылка антисыворотка также показано (N = 52 реплицирует), демонстрируя очень низкой изменчивости с коэффициент вариации (кв) 6,82%.

Figure 1
Рисунок 1: вирусный титрования пластины макет для количественный RSV запасов. v = запас RSV вируса (v1, запас вирусных партии 1 v2, запас вирусных партии 2; v3, акции вирусный партии 3), N = отрицательный контроль, X = добавлены средства массовой информации. Цветовая кодировка поддерживается только для оказания помощи в визуализации макета пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: пример фото параметры, используемые для чтения пятна. Скриншот параметров обычно используется для подсчета вирус бляшек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: примеры артефакт и нарушается клеток монослои. (A) артефакты. (B) нарушение клетки монослои. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: шаблон пластины для assay RSV PRN. V = вирусный положительный контроль скважины, N = отрицательный контроль скважины, X = СМИ добавил, S = ссылка антисыворотка со всех разведениях (от 1: 100 до 1:12, 800) в колонке 12. Цветовая кодировка поддерживается только для оказания помощи в визуализации макета пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: пример результата вирусный титрования RSV. Показываются представитель скважин от assay в трех экземплярах. Цифры в каждой скважине ссылаются на количество металлических пластинк, учитываются с помощью reader пятна. TMC = слишком много, чтобы сосчитать. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: результаты от представителя пробирного RSV PRN. (A) количество PFU учитываются для трех отдельных образцов согласно разрежения различных диапазонов. Цифры в каждом хорошо изображения ссылаются на количество металлических пластинк учитываются. (B) наб титр интерпретации от хорошо изображения в панели A для трех образцов представитель человеческой сыворотки. Данные рассчитывается на основе минимально приемлемого уровня 50% от вируса контроля скважин. Горизонтальные полосы представляют собой среднее ± SD. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: RSV, нейтрализуя антитело титры в Мельбурне (N = 21) и Гамбии (N = 36) взрослых. Сыворотка крови человека RSV ссылка также показаны для сравнения (N = 52 реплицирует). Символы представляют отдельные титры и турники представляют собой геометрическое титр ± 95% CI. N = 52 результаты основаны на трех техников в течение двух месяцев. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure S1
Дополнительный рисунок 1: сравнение наб титры для RSV-A. (Слева) наб титры, рассчитанные с помощью модели линейной и нелинейной регрессии (N = 152 анализов). (Право) Корреляция между RSV-A наб титры, используя оба линейной и нелинейной регрессионной модели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы разработали и оптимизированы простой и эффективный RSV микро нейтрализация assay, который может быть легко адаптирована в большинстве лабораторий. Этот assay возможность измерить способность вирусной инфекции, а также измерения ингибирования вирусной инфекции на NAb на клеточном уровне, используя сканирование компьютерных изображений. Специфичность и чувствительность месте обнаружения по сравнению с традиционными налета обнаружения методы6,7, возросло использование платформу на основе изображений и конкретных систем, основанных на антитела. Это позволяет характеристика RSV штаммы с низкой инфективности и также обеспечивает точную количественную оценку RSV концентрации до использования в PRN assay.

Рекомендуется, что той же партии вирусных складе используется для каждого исследования для того, чтобы свести к минимуму любые партии партии вариации между RSV запасов. Другие важные аспекты анализа включают последовательности ввода концентрации вируса, целостность монослоя клеток A549 и с помощью же количество параметров для обеспечения анализа согласованности и точности. Количество вируса, добавлены к пластине могут быть проверены снова в отдельный налета вирусных титрования. Однако положительный контроль скважины PRN пробирного контроля также дает представление о фактической титр вирусных и стоит также для мониторинга различных анализов. Кроме того включая ссылку сыворотки в каждое блюдо является еще одной мерой контроля качества для обеспечения воспроизводимости анализов. Наши эксперименты не использовали недавно утвержденных международных стандартных антисыворотка RSV от NIBSC, как она не была доступна в то время наши исследования11. С помощью этой RSV международного стандарта антисыворотка следует рекомендовать для будущих исследований, измерения RSV NAb, так что результаты в лаборатории можно сравнить с уверенностью.

Разработка относительно простой, высок объём пробирного облегчит усилия глобальной стандартизации для использования RSV NAbs как более лабораторий во всем мире будет иметь возможность использовать этот метод. Это особенно важно, учитывая количество RSV вакцин-кандидатов в области развития, с некоторыми в настоящее время в 3 фазы. Важно, что быть сопоставимые результаты будущих клинических исследований RSV вакцин, и поэтому стандартизированных пробирного представляет собой ключевой аспект для этой цели. Хотя ряд стран с низким и средним уровнем дохода не может быть непосредственно поддерживать приобретение оборудования необходимо, связей посредством международного сотрудничества и/или программ наращивания потенциала будет иметь решающее значение в среднесрочной и долгосрочной перспективе.

Этот протокол assay NAb гибок в мочь быть адаптированы для различных клеточных линий (A549, Hep2 и Веро) и может быть использован для различных штаммов RSV. Мы также адаптировали этот метод для RSV-B успешно. Как пробирного платформа была разработана для формат 96-луночных пластины, это обеспечивает альтернативу экономически и высок объём с высокой точностью, потому что она позволяет более реплицирует и включение управления ссылка сыворотки и отрицательный контроль на каждом пластины. Также рекомендуется использовать тот же элемент управления ссылки сыворотки, как это очень важно для обеспечения контроля качества и контроля качества. В наших руках мы наблюдали очень низкой CVs 6,82% сыворотки ссылка, которая гораздо ниже, чем сообщалось CVs для других биологических анализов в диапазоне 30-40%5.

Кроме того данные изображения и количество данных (исходных данных) создается из этого протокола может храниться на неопределенный срок для будущих ссылок и/или анализа. Сохранение записи необработанных данных является важным требованием для клинических испытаний, особенно с участием будущих RSV вакцин. Наш лист (см. Дополнительный лист) предложил в этот протокол может помочь для записи всех аспектов эксперимента с целью контроля качества и обеспечения контроля. Лист обеспечивает расчет 50%, нейтрализуя титр, используя простой линейной модели, как это имеет то преимущество, не требует каких-либо специализированного программного обеспечения. Однако могут быть проанализированы необработанные данные от нашего пробирного NAb, используя модель нелинейной регрессии, который также был использован в исследование вакцин для расчета 50% нейтрализации титры, хотя это требует наличия других программных пакетов12,13 . Используя наши экспериментальные данные, результаты, полученные с помощью этих двух методов были похожи, дает уверенность в титре значения, полученные с помощью упрощенной линейной модели (см. дополнительный рисунок 1). Стоимость создания этот assay доступным для многих лабораторий с возможно самых дорогих пункта, то читатель пятна приблизительно USD $50K. Однако пятна читатель имеет преимущество, которое может использоваться для других приложений, таких как энзим соединенный immunospot (ELISpot) для цитокинов и/или антител секретирующие клетки измерение, которое делает его ценным компонентом в вакцины демонстрационного.

В заключение этот assay RSV PRN улучшилось, высокой пропускной способности может быть легко реализован во многих лабораториях и будет поддерживать международное согласование усилий ВОЗ для анализов RSV наб. Это будет иметь решающее значение для оценки Роман RSV вакцина кандидатов в будущем.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы благодарят всех участников. Мы признаем правительство викторианской оперативной инфраструктуры поддержки программы. ПВЛ является получателем NHMRC стипендий развития карьеры.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell line
A549 ATCC CCL-185 provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland
Viral strains
RSV A2 ATCC VR-1540 lot number 60430286
Reagents
Acetone Merck 1000142511
Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) Life Technologies A11055
CMC sodium salt powder Sigma-Aldrich C5678-500G
DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) Scientific Services – Tissue Culture MCRI in house supply
Foetal calf Serum (stored in 50 mL aliquots at -20 °C) Interpath SFBS-F
Goat X RSV antibody Merck AB1128
human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) BEI Resources NR-4022 Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832)
M199 powder Life Technologies 31100035
Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) Australian Biosearch 50-82-01
Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) Life Technologies 15140122
s.d.H2O from Milli-Q dispenser Merck In-house dispensation
Sterile 1x PBS for culture (stored at 4 °C) Scientific Services – Tissue Culture MCRI in house supply
Tween 20 polysorbate Sigma-Aldrich 9005-64-5
General Consumables
Conical Falcon tubes (50 mL) Invitro Technologies FAL352070
Filter unit 0.22 μm (500 mL) Thermo Fisher NAL5660020
Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) Australia PL AM12400
Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) Interpath 655180
Sterile U-bottom plates (96-well with lid) Interpath 650180
5 mL serological pipette Sigma-Aldrich CLS4487-200EA
10 mL serological pipette Interpath 607180
25 mL serological pipette Sigma-Aldrich CLS4251-200EA
Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 Fisher Biotec TF-200-L-R-S
Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 Fisher Biotec TF-20-L-R-S
Tip Pipette 100-1,000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 Fisher Biotec TF-1000-L-R-S
Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 Fisher Biotec TXLF-10-L-R-S
Equipments and softwares
ELISpot reader system AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
AID ELISpot software version 5.0 AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
Microsoft Excel 2007

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
  2. Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
  3. Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
  4. Mazur, N. I., et al. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).
  5. Hosken, N., et al. A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard. Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).
  6. Zielinska, E., et al. Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis. Virology Journal. 2, 84 (2005).
  7. van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253 (2012).
  8. Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195 (2013).
  9. Tripp, R. A., Jorquera, P. A. Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , Humana Press. (2016).
  10. Suara, R. O., et al. Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).
  11. McDonald, J. U., Rigsby, P., Dougall, T., Engelhardt, O. Report on the WHO collaborative study to establish the 1st International Standard for antiserum to Respiratory Syncytial Virus. , Available from: http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/260488/WHO-BS-2017.2318-eng.pdf?sequence=1&isAllowed=y (2017).
  12. Wang, J. W., et al. Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions. PLoS One. 9 (7), e101576 (2014).
  13. Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution. Virus Research. 218, 57-70 (2016).

Tags

Медицина выпуск 143 Респираторный синцитиальный вирус нейтрализуя антитела антитела сокращение зубного налета инфекционные заболевания стандартизации
Улучшенная и высокой пропускной способности Assay микро нейтрализация респираторно-синцитиальный вирус (RSV)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Do, L. A. H., Tse, R., Nathanielsz,… More

Do, L. A. H., Tse, R., Nathanielsz, J., Anderson, J., Ong, D. S., Chappell, K., Mulholland, K., Licciardi, P. V. An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-neutralization Assay. J. Vis. Exp. (143), e59025, doi:10.3791/59025 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter