Summary
L’objectif de ce protocole est à étiqueter, enrichir et identifier les substrats de la protéine-kinase CK2 auprès d’un échantillon biologique complex tel qu’un lysat cellulaire ou l’homogénat tissulaire. Cette méthode s’appuie sur des aspects uniques de la CK2 biologie à cet effet.
Abstract
L’étude des relations de kinase-substrat est essentielle pour avoir une compréhension complète des fonctions de ces enzymes et leurs cibles en aval dans les États physiologiques et pathologiques. CK2 est une kinase de sérine/thréonine évolutivement conservés avec une liste croissante de centaines de substrats impliqués dans plusieurs processus cellulaires. En raison de ses propriétés pléiotropes, identifier et caractériser un ensemble complet de substrats CK2 a été particulièrement difficile et reste un obstacle à l’étude de cette enzyme importante. Pour relever ce défi, nous avons élaboré une stratégie expérimentale polyvalente qui permet l’enrichissement ciblée et identification des substrats de CK2 putatifs. Ce protocole tire parti de la spécificité unique double co-substrat de CK2 permettant thiophosphorylation spécifique de ses substrats dans une cellule ou un tissu lysat. Ces substrats protéiques sont ensuite alkylées, immunoprécipitée et identifié par liquide chromatography/tandem la spectrométrie de masse (LC-MS/MS). Nous avons déjà utilisé cette approche pour identifier avec succès des substrats CK2 de Drosophila ovaires et ici nous étendre l’application du présent protocole aux cellules de glioblastome humain, illustrant la capacité d’adaptation de cette méthode pour étudier la rôles biologiques de cette kinase dans divers organismes modèles et systèmes expérimentaux.
Introduction
Protéines kinases sont des éléments clés des cascades de transduction de signal. La phosphorylation des protéines substrat de ces enzymes suscite des réactions biologiques qui régissent les événements critiques contrôlant la division cellulaire, métabolisme et la différenciation, entre autres. CK2 est une exprimée de façon ubiquitaire, acidophiles sérine/thréonine kinase qui est conservé de la levure à l’homme et qui joue un rôle important dans de nombreux processus cellulaires, allant de la régulation transcriptionnelle de progression du cycle cellulaire à l’apoptose1 ,2,3. L’enzyme est un hétérotétramère composé de deux α catalytique (ou α') sous-unités et deux de sous-unités β réglementaire4. En plus d’être hautement pléiotrope, CK2 présente deux autres caractéristiques inhabituelles qui compliquent l’analyse, à savoir l’activité constitutive5 et co-substrat double spécificité6. Cette dernière propriété CK2, dote de la capacité d’utiliser GTP comme ATP pour la phosphorylation de protéines substrats.
Délétion génétique des sous-unités catalytiques ou réglementaires de CK2 chez la souris entraîne la létalité embryonnaire indiquant qu’elle joue un rôle crucial lors du développement et de l’organogénèse7,8. CK2 est également surexprimé dans plusieurs types de cancer et représente donc un prometteur cible thérapeutique9,10,11. En effet, des inhibiteurs spécifiques cette activité cible de la kinase CK2 sont actuellement sous enquête pour ce but12,13,14. Alors que l’inhibition de la CK2 est une option viable, étant donnée sa nature pléiotropique, alternative et peut-être une approche plus rationnelle consisterait à cibler des substrats CK2 critiques qui sous-tendent la progression de certains cancers. Par conséquent, l’identification complète et la caractérisation de protéines substrats CK2 serait un bénéfice notable pour élucider l’ou les fonctions spécifique de cette kinase dans un type particulier de tissu ou une tumeur.
Nous décrivons ici une méthode biochimique polyvalente pour l’identification des substrats CK2 auprès d’un échantillon biologique complex comme une cellule ou un tissu lysat. Ce protocole tire parti de la spécificité du double co-substrat de CK2 par utilisation de l’analogue de GTP GTPγS (guanosine 5'-[γ-thio]triphosphate) qui ne peuvent pas utiliser les autres kinases endogènes. Cela permet effectivement de la kinase à « étiqueter » ses substrats au sein de cet échantillon subséquentes d’isolement et d’identification.
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Protocol
Remarque : Assurez-vous que le matériel requis est disponibles et correctement préparé (voir Table des matières).
1. préparation
- Lyse mécaniquement échantillon de tissu (1-2 mg de tissu dans 100 µL de tampon de lyse, tableau 1) ou cultivé des cellules (plaque de 10 cm qui est confluente de 80 à 90 % dans 350 µL de tampon de lyse), l’objectif étant de recueillir un total de 900 µL de l’échantillon pour l’expérience. Notez que ce volume est en léger excès de ce qui est nécessaire pour l’expérience décrite ci-dessous.
- Tournez en bas les échantillons par centrifugation à 17 500 x g pendant 3 minutes à 4 ° C. Une fois terminé, transférer 270 µL du liquide surnageant dans chacun des trois nouveaux tubes de microcentrifuge de 1,7 mL. Il y aura environ 90 µL restant. Enlever 40 µL à être utilisé comme un « contrôle d’entrée » et le place dans un nouveau tube. Placez tous les échantillons sur la glace.
2. analyse de kinase : thiophosphorylation et alkylation
- Identifier les trois tubes contenant 270 µL de chaque comme suit : « kinase rxn », « GTPγS seulement », et « PNBM (mésylate de p-nitrobezyl) seulement ». Préparer les réactions de la kinase.
- Au tube « kinase rxn », ajouter 2,7 µL (équivalent à 1 350 U) de CK2, puis ajouter 2,7 µL de 2,5 mM GTPγS.
- Au tube « GTPγS seulement », ajouter 2,7 µL de 2,5 mM GTPγS et puis ajouter 2,7 µL de tampon de lyse.
- Au tube « PNBM seulement », ajoute 5,4 µL de tampon de lyse. Mettez tous les tubes pour mélanger et ensuite placer immédiatement sur la glace.
- Incuber tous les trois tubes pendant 1 min dans un bain d’eau de 30 ° C. Après l’incubation, ajouter 13,5 µL de 12 mg/mL de PNBM à tous les trois tubes. Inverti pour mélanger les échantillons. Incuber les échantillons à la température ambiante pendant 1 h.
- Après le début de l’incubation à l’étape 2.2, préparer les colonnes dessalement dès que possibles car le processus prend environ 45 min.
3. préparation du dessalage des colonnes
- Préparer au départ colonnes (3 pour cette expérience de l’exemple) en retournant chaque colonne plusieurs fois à remettre en suspension le Sephadex G-25 résine dans le tampon de stockage. Laissez la résine de régler par assemblage de chaque colonne sur un socle de pince et laissez-la reposer pendant environ 5 min.
- Après décantation de la résine Sephadex G-25, enlever les bouchons du haut et le bas de la colonne pour laisser le tampon de stockage à vidange par gravité et ont un tube placé au-dessous de l’ouverture du bas pour recueillir le cheminement pour jeter.
- Une fois que le tampon de conservation est épuisée, ajouter environ 2,7 mL de tampon de lyse afin d’équilibrer les colonnes. Recueillir le cheminement et le jeter. Répéter 3 fois. Suite à l’équilibrage final, les colonnes sont prêts pour l’étape 4.1.
4. Elimination des PNBM
- Une fois les 1 h d’incubation (étape 2.2) et préparation (étape 3) de la colonne complètes, appliquer les échantillons aux colonnes. L’étiquette de chaque colonne comme suit : « kinase rxn », « GTPγS uniquement » et « PNBM seulement ». Charger l’ensemble de chaque échantillon sur sa colonne respective. Recueillir et éliminer les intermédiaires.
- Laver les échantillons en ajoutant 420 µL de tampon de lyse dans chaque colonne. Laisser le tampon de lyse filtrer à travers la colonne et recueillir le cheminement pour jeter. Après cette étape de lavage, placer les tubes dans la position pour la collecte d’échantillons.
- Éluer les échantillons en ajoutant 500 µL de tampon de lyse à chaque colonne. Recueillir le cheminement qui contient maintenant des thiophosphorylated et des substrats CK2 alkylés.
5. immunoprécipitation : Partie I
- Préparer les échantillons pour l’immunoprécipitation par première suppression 80 µL pour obtenir un exemple de chacun des elutions respectifs (« kinase rxn », « GTPγS uniquement » et « PNBM seulement ») recueillies à l’étape 4.3 « contrôle d’élution d’entrée ». Après le retrait de 80 µL de chaque échantillon, il y aura environ 420 µL restant par échantillon.
- Diviser chaque échantillon en 2 tubes de 200 µL de chaque. Etiqueter chaque tube respective : « kinase rxn anti-thiophosphate ester », « kinase rxn IgG », « Ester d’anti-thiophosphate GTPγS », « GTPγS IgG », « Ester d’anti-thiophosphate PNBM » et « PNBM IgG ».
- Ajouter 2,8 µg d’anti-thiophosphate ester anticorps contre chacun des tubes anti-thiophosphate ester-étiquetés et 2,8 µg d’isotype des anticorps de contrôle pour chacun des tubes IgG marquée. Placer les tubes sur un rotateur à 4 ° C pendant 2 h.
- Débutez la préparation des billes de protéine A/G durant les dernier 15 min de la 2 h d’incubation à l’étape 5.2.
6. la protéine A/G d’agarose préparation de perle
- Brièvement, vortex le tube de rangement pour perles sont complètement remises en suspension. Couper l’extrémité d’un P200 de pipette à l’aide d’une lame de rasoir propre afin d’augmenter la jauge grosseur. Ajouter 100 µL de la boue de perle par immunoprécipitation dans un nouveau tube de microcentrifuge de 1,7 mL. Pour cet exemple, un total de 6 tubes sont nécessaires.
- Centrifuger les tubes à 17 500 g pendant 1 min à 4 ° C. Retirez le surnageant et le jeter. Remettre en suspension les perles dans 200 µL de tampon de lyse et brièvement vortex. Répétez le spin et laver 3 fois les étapes.
- Après le lavage final, placez les perles sur la glace jusqu'à la fin de l’incubation à l’étape 5.2.
7. immunoprécipitation : Partie II
- Après le 2 h d’incubation de l’étape 5.2, tournez en bas les échantillons à 17 500 x g pendant 3 min à 4 ° C. Après centrifugation ajouter 200 µL de chaque échantillon dans les tubes avec les perles lavés. Placer les tubes sur un rotateur à 4 ° C pendant 1 h.
- Après l’incubation de 1 h, centrifuger les tubes à 17 500 g pendant 1 min à 4 ° C. Ensuite retirez 40 µL de surnageant de chaque échantillon et enregistrez sous un « contrôle de l’appauvrissement de la couche » (total 6 tubes). Enlever le reste du liquide surnageant et jeter. Prendre soin de ne pas pour déranger les perles.
- Laver les échantillons en ajoutant 200 µL de tampon de lyse et mélangé au vortex brièvement. Puis centrifuger à 17 500 g pendant 1 min à 4 ° C. Retirez le surnageant et le jeter. Répéter le lavage et essorage étapes 3 fois. Prendre soin de ne pas pour déranger les perles au cours de ces étapes.
- Après avoir terminé les étapes de lavage, ajouter 50 µL de tampon de 2 x dans chaque échantillon contenant des perles. Pour tous les autres échantillons, ajouter 8 µL de 6 x solution tampon : « contrôle d’entrée », « contrôles d’entrée d’élution » et « l’appauvrissement contrôles ».
- Une fois que le tampon est ajouté aux tubes, pipette de haut en bas pour mélanger et faire chauffer tous les échantillons à 95 ° C pendant 5 min avant de procéder à la SDS-PAGE.
8. analyse/Validation des résultats
- Validez l’alkylation réussie CK2 dépendant thiophosphorylation.
- Pour déterminer l’efficacité de la médiation CK2 thiophosphorylation à l’étape 2.2, effectuez SDS-PAGE et éponger occidental en exécutant 15-20 µL de « élution contrôles d’entrée » recueillies à l’étape 5.1 sur un gel de polyacrylamide de 12,5 %.
- Sonde de membranes avec les anticorps suivants : anti-thiophosphate ester, anti-CK2α et anti-GAPDH (ou autre contrôle de chargement approprié). Si cette étape s’est déroulée, un signal d’ester renforcée anti-thiophosphate devrait être évident dans la voie de « kinase rxn » par rapport aux deux autres voies (Figure 2).
- Visualiser des substrats putatifs enrichis de CK2 et déterminer l’identité de la protéine.
- Afin d’évaluer si les mesures d’immunoprécipitation ont réussi, exécutez 25-30 µL des échantillons élué de perles dans étape 7.4 sur un gel de polyacrylamide 12,5 % distinct. S’assurer que tout le matériel est propre et porter des gants en tout temps au cours de cette étape pour minimiser la contamination.
- Le gel avec le bleu de Coomassie tache bleu pour visualiser les protéines enrichies de différentes étapes du protocole expérimental (Figure 3). À l’aide de nouvelles lames de rasoir, soigneusement l’accise bandes uniques présentes dans la voie de « kinase rxn anti-thiophosphate ester IP », notant leurs poids moléculaires approximatifs.
- Soumettre ces bandes pour l’identification des protéines par liquide chromatography/tandem la spectrométrie de masse (LC-MS/MS) (Figure 4). S’il existent des anticorps dirigés contre les protéines identifiées, confirmer les résultats de la spectrométrie de masse par SDS-PAGE et immunoblotting d’input, épuisés et fractions IP recueillies dans le cadre du protocole (Figure 4).
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Representative Results
Un diagramme schématique de la procédure expérimentale est fourni à la Figure 1. Fondement de la technique est la capacité inhabituelle de CK2 utiliser GTP pour le transfert du groupe phosphoryle. Addition d’exogène CK2 holoenzyme avec l’analogue de GTP, GTPγS, d’un lysat cellulaire conduit à thiophosphorylation de substrats endogènes de CK2. Traitement ultérieur du lysat avec l’alkylants réactif p- nitrobenzyle mésylate (PNBM) génère une portion d’ester de thiophosphate sur ces protéines substrat spécifique qui peut ensuite être immunoprécipitée à l’aide d’un anticorps d’ester anti-thiophosphate et finalement identifiés par spectrométrie de masse. La figure 2 présente un résultat positif après l’ajout de CK2 et GTPγS, puis PNBM à T98G (glioblastome) lysat cellulaire. Ces résultats démontrent que thiophosphorylation CK2-dépendante et alkylation subséquente ont réussi. Comme prévu, un signal d’ester renforcée anti-thiophosphate Western Blot est observé seulement dans la voie contenant la réaction de kinase complet et pas dans le GTPγS seule - et les échantillons de traitement seulement PNBM. Illustré à la Figure 3 est un gel teinté bleu de Coomassie des protéines éluées à l’aide du contrôle d’isotype IgG ou des anticorps anti-thiophosphate ester en présence ou en absence d’excès CK2 et/ou GTPγS et immunoprécipitée. Ces données démontrent également un résultat positif que plusieurs bandes uniques sont visibles uniquement dans la voie des IP anti-thiophosphate ester dans lequel le lysat est incubé avec exogène CK2 et GTPγS. La bande marquée d’un astérisque a été excisée du gel et soumise pour l’identification des protéines par spectrométrie de masse. La figure 4 présente des données représentatives obtenues par analyse par spectrométrie de masse, y compris l’identification des protéines, pourcentage de couverture et nombre de peptides uniques identifié par la protéine à l’intérieur de la bande. Sont présentées les hits top dix de la bande de soumis (Figure 3) et des informations concernant ou non la protéine a été précédemment identifiée comme substrat de CK215,16,17. L’identité de l’un des substrats connus immunoprécipitée CK2, nucléoline15, a été confirmée par SDS-PAGE et immunoblotting les fractions indiquées à l’aide d’un anticorps anti-nucléoline.
Figure 1 : schéma de principe de la stratégie expérimentale. L’analogue de GTP, GTPγS, ainsi que de l’excès recombinant CK2 holoenzyme est ajouté à une cellule ou un tissu lysat et permet thiophosphorylation des substrats de CK2, mais pas par d’autres kinases endogènes. Thiophosphorylated substrats sont ensuite alkylées avec PNBM, générant une portion d’ester de thiophosphate sur ces protéines, qui sont ensuite capturés par immunoprécipitation (IP) pour fins d’identification par spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide ( LC-MS/MS). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Validation de CK2 dépendant thiophosphorylation à germes entiers lysat. Lysats de cellules entières préparés à partir de cellules T98G ont été incubées avec GTPγS en présence (réaction de kinase) ou absence (GTPγS seulement) d’exogène recombinant CK2 holoenzyme. PNBM a été ajouté par la suite aux réactions indiquées, et des échantillons ont été résolus par SDS-PAGE, suivi par immunotransfert avec les anticorps indiquées. Marqueurs de poids moléculaire de protéine sont indiqués en kDa. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : immunoprécipitation des protéines de substrat putatifs CK2. Enrichissement et visualisation des substrats de CK2 putatifs (troisième voie) est évident que plusieurs bandes uniques suite immunoprécipitation avec des anticorps anti-thiophosphate ester. Immunoprécipités ont été résolues par SDS-PAGE et le gel a été coloré au bleu de Coomassie. La bande marquée d’un astérisque a été excisée du gel et soumise pour l’identification des protéines par spectrométrie de masse. Marqueurs de poids moléculaire de protéine sont indiqués en kDa. IP = immunoprécipitation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Identification et confirmation des protéines comme substrats de CK2 en vitro. Les données obtenues par spectrométrie de masse montrent que tant connu précédemment15,16,17 que putatifs nouveaux substrats CK2 ont été identifiés à l’aide de cette approche expérimentale. Le top dix protéines identifiées de la bande excisée (en haut) est indiqué. L’identité de la nucléoline, un substrat connu de la CK2, a été confirmée par immunotransfert des fractions indiquées à l’aide d’un anticorps anti-nucléoline (en bas). Marqueurs de poids moléculaire de protéine sont indiqués en kDa. IP = immunoprécipitation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Réactif Concentration Stock | Concentration finale de réactif | Exemple de volumes ajoutés sur la base des concentrations stocks |
1 M Tris pH 7,4 | 20.0 mM | 200 ΜL |
4 M NaCl | 20.0 mM | 50 ΜL |
20 % Triton X-100 | 0,50 % | 250 ΜL |
1 M MgCl2 | 10. 0 mM | 100 ΜL |
TNT 1 M | 0,5 mM | 5 ΜL |
200 mM Na3VO4 | 1,0 mM | 50 ΜL |
500 mM NaF | 10. 0 mM | 200 ΜL |
β-glycérophosphate de 500 mM | 10. 0 mM | 200 ΜL |
H2O | 8,945 mL | |
+ 1 complet Mini onglet/10 mL | 1 comprimé |
Tableau 1. Recette de tampon de lyse (10 mL, 1 X).
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Discussion
Nous décrivons ici une méthode relativement simple et biochimique pour l’identification des substrats de la protéine-kinase CK2 auprès d’un échantillon biologique complex. Les étapes critiques du présent protocole sont basées sur les propriétés enzymatiques inhabituelles de CK2 et comprennent thiophosphorylation CK2 dépendant des protéines substrat spécifique à l’aide de GTPγS et leurs immunoprécipitation ultérieure et identification. Avec ces résultats, nous avons démontré l’utilité et la polyvalence de cette approche que nous appliquons maintenant cette stratégie dans les cellules du glioblastome humain et Drosophila ovaires18.
Un certain nombre d’études déjà publiées en utilisant des approches quantitatives phosphoprotéomique ont en effet prouvé efficace pour identifier les nouveaux CK2 substrats19,20,21,22, 23. Toutefois, certains de ces stratégies font utilisent des tableaux de substrat immobilisé, et il est possible que la conformation d’une protéine immobilisée peut rendre un site potentiel de phosphorylation inaccessibles à la kinase. La technique décrite ici permet la phosphorylation au sein d’un environnement plus physiologique ou indigène (c.-à-d. un lysat cellulaire), ce qui réduit la probabilité de l’inaccessibilité du site. Un autre avantage de cette stratégie est que, une fois que l’identification des protéines est déterminée par spectrométrie de masse, validation des substrats de CK2 putatifs facilement peut être effectuée sur des échantillons prélevés au cours de la procédure si les anticorps dirigés contre le substrat protéines d’intérêt sont disponibles. Par exemple, vous utilisez transfert western standard, on devrait observer une baisse du niveau de la protéine pertinente dans les échantillons d’appauvri (post-IP) et sa présence dans l’anti-thiophosphate ester immunoprécipités comme nous l’avons démontré pour la CK2 connus nucléoline de substrat (Figure 4).
Une restriction notable de cette méthode est que la dernière étape de la procédure avant l’analyse par spectrométrie de masse repose sur la capacité de discerner les différences discrètes dans des bandes jacquard sur un gel. Ainsi, il est certainement possible que les substrats CK2 spécifiques peuvent manquer si elles sont de faible abondance et donc inférieure au seuil de détection visuelle. Si on se soucie de cette possibilité, une méthode plus sensible tels que la coloration à l’argent peut être utilisée pour visualiser ces protéines au lieu d’utiliser le bleu de Coomassie. Une autre considération qui doit être reconnue, c’est qu’un certain nombre de substrats CK2 ne soient pas identifié à l’aide de cette stratégie, puisque les sites physiologiquement pertinents seront déjà phosphorylée in vivo. C’est très certainement le cas compte tenu de l’activité constitutive de CK2. Enfin, il devrait également noter que cette méthodologie identifie uniquement protéines substrats putatif de CK2 in vitro. Des essais ultérieurs pour valider qu’il s’agit des substrats physiologiquement pertinents de CK2 in vivo sont nécessaires et devraient entraîner l’identification de sites de phosphorylation dépendante CK2 et d’évaluer si la phosphorylation de ces résidus particulières est modifiées en réponse à la manipulation de l’activité kinase CK2.
En résumé, cette stratégie, couplée à des approches expérimentales en aval (cartographie des sites de phosphorylation par mutagenèse dirigée, des essais fonctionnels in vitro et in vivo , analyse de troncature/suppression, etc.) facilitera l’étude de cette kinase inhabituelle et augmenteront notre compréhension des différents rôles que CK2 joue dans plusieurs systèmes biologiques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par une subvention de valorisation de recherche universelle du Commonwealth depuis le ministère de la santé de Pennsylvanie à sit
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |
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