Summary
Målet med denne protokollen er etiketten, berike og identifisere underlag av protein kinase CK2 fra et komplekse biologiske utvalg som en celle lysate eller vev homogenate. Denne metoden bruker unike aspekter av CK2 biologi for dette formålet.
Abstract
Studiet av kinase-underlaget relasjoner er viktig å få en fullstendig forståelse av funksjonene til disse enzymer og deres nedstrøms mål i både fysiologiske og patologiske tilstander. CK2 er et evolusjonært bevarte serine/threonin kinase med en voksende liste av hundrevis av underlag involvert i flere cellulære prosesser. På grunn av pleiotropic egenskaper, identifisere og karakterisere et omfattende sett av CK2 underlag er spesielt utfordrende og forblir et hinder i studiet av dette viktige enzymet. For å møte denne utfordringen, har vi utviklet en allsidig eksperimentelle strategi som aktiverer målrettet berikelse og identifikasjon av antatte CK2 underlag. Denne protokollen utnytter unike doble co substrat spesifisiteten av CK2 tillater for bestemte thiophosphorylation av sin underlag i en celle eller vev lysate. Disse substrat proteiner er senere alkylated, immunoprecipitated, og identifiseres av flytende kromatografi/tandem massespektrometri (LC-MS/MS). Vi har brukt denne tilnærmingen å kunne identifisere CK2 underlag fra Drosophila eggstokkene og her vi utvide bruken av denne protokollen til menneskelig glioblastom celler, illustrerer tilpasningsevne denne metoden til å undersøke den biologiske rollene til denne kinase i ulike modell organismer og eksperimentelle systemer.
Introduction
Protein kinaser er sentrale komponenter av signal signaltransduksjon cascades. Fosforylering substrat proteiner av disse enzymene utløser biologiske respons som regulerer kritiske hendelser kontrollere celledeling, metabolisme og differensiering, blant andre. CK2 er en overalt uttrykte, syre serine/threonin kinase som er bevart fra gjær til mennesker og som spiller viktige roller i mange mobilnettet prosesser, fra transcriptional regulering til celle syklus progresjon til apoptose1 ,2,3. Enzymet er en heterotetramer består av to katalytisk î± (eller α') underenheter og to regulatoriske β underenheter4. Er svært pleiotropic, har CK2 to andre uvanlige egenskaper som kompliserer sin analyse, nemlig grunnleggende aktivitet5 og dobbelt co substrat spesifisitet6. Sistnevnte egenskapen endows CK2 muligheten til å bruke GTP samt ATP for fosforylering substrat proteiner.
Genetisk sletting av de katalytiske eller forskriftsmessige underenheter av CK2 i mus gir embryonale dødelighet som indikerer at den spiller avgjørende roller under utvikling og organogenesen7,8. CK2 er også overexpressed i flere typer kreft og dermed representerer en lovende terapeutisk mål9,10,11. Faktisk, bestemte hemmere som CK2 kinase målaktiviteten er under etterforskning for dette formålet12,13,14. Mens hemming av CK2 er et levedyktig alternativ, gitt sin pleiotropic natur, et alternativ, og kanskje mer rasjonell tilnærming ville være å målrette kritiske CK2 underlag underlie progresjon av visse kreftformer. Derfor ville omfattende identifikasjon og karakterisering av CK2 substrat proteiner være betydelig fordel for Klargjørende den spesifikke funksjon av denne kinase innenfor en bestemt vev eller svulst type.
Her beskriver vi en allsidig biokjemiske metode for å identifisere CK2 underlag fra et komplekse biologiske utvalg som en celle eller vev lysate. Denne protokollen utnytter dual co substrat spesifisiteten av CK2 ved bruk av den GTP analogt GTPγS (guanosine 5'-[γ-thio]triphosphate) som andre endogene kinaser ikke kan bruke. Effektivt kan kinase til "etiketten" sin underlag i dette eksemplet for påfølgende isolasjon og identifikasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Kontroller at de nødvendige materialene er tilgjengelig og skikkelig forberedt (se Tabell for materiale).
1. forberedelse
- Mekanisk lyse Vevsprøve (1-2 mg av vev i 100 µL av lyseringsbuffer, tabell 1) eller kultivert celler (10 cm plate som er 80-90% confluent i 350 µL av lyseringsbuffer), med det mål å samle totalt 900 µL av prøve for eksperimentet. Merk at dette volumet litt i overkant av hva som kreves for eksperimentet beskrevet nedenfor.
- Nedspinning prøvene med sentrifugering 17.500 x g i 3 minutter på 4 ° C. Ved ferdigstillelse, overføre 270 µL nedbryting av hver av tre nye 1,7 mL microcentrifuge rør. Det vil være ca 90 µL igjen. Fjerne 40 µL skal brukes som en "input kontroll" og plass i en ny tube. Plass alle prøvene på is.
2. kinase analysen: thiophosphorylation og alkylation
- Merke tre rør som inneholder 270 µL hver slik: "kinase rxn", "GTPγS bare", og "PNBM (p-nitrobezyl mesylate) bare". Forberede kinase reaksjonene.
- Til "kinase rxn" røret, legge til 2,7 µL (tilsvarer 1350 U) av CK2, og deretter legge 2,7 µL av 2,5 GTPγS.
- Legge 2,7 µL av 2,5 GTPγS "GTPγS" røret, og deretter legge 2,7 µL av lyseringsbuffer.
- Legge til 5,4 µL av lyseringsbuffer "PNBM bare" røret. Bla alle rør for å mikse og umiddelbart plasser på is.
- Inkuber alle tre rør i 1 min i et 30 ° C vannbad. Etter inkubasjon legge 13,5 µL av 12 mg/mL PNBM til alle tre rør. Inverter å blande prøver. Inkuber prøvene ved romtemperatur 1t.
- Når du starter inkubasjon i trinn 2.2, forberede kolonnene avsalting så snart som mulig som prosessen tar ca 45 min.
3. forberedelse av avsalte kolonner
- Først forberede kolonner (3 for dette eksemplet eksperimentet) ved å snu hver kolonne flere ganger til å suspendere Sephadex G-25 harpiks i lagring bufferen. Tillate skal avgjøre ved hver kolonne vedlegges en klemme stå og la den sitte uforstyrret i ca 5 min.
- Etter bosetting av den Sephadex G-25 harpiksen, fjerne dekslene fra både toppen og bunnen av kolonnen tillate lagring bufferen renne av gravitasjon og har en tube plassert under bunnen åpningen samle gjennomflytsenhet for kast.
- Når lagring bufferen er oppbrukt, legger du til ca 2,7 mL lyseringsbuffer for å equilibrate kolonnene. Samle gjennomflytsenhet og kast. Gjenta 3 ganger. Etter den siste balanse er kolonnene klar for trinn 4.1.
4. fjerning av PNBM
- Når 1t inkubasjon (trinn 2.2) og kolonnen forberedelse (trinn 3) er fullført, kan du bruke prøvene til kolonnene. Label hver kolonne som følger: "kinase rxn", "GTPγS" og "PNBM". Last alle hvert utvalg på sine respektive kolonnen. Samle og kast gjennomflytsenhet.
- Vask eksempler ved å legge 420 µL av lyseringsbuffer til hver kolonne. Tillate lyseringsbuffer å filtrere gjennom kolonnen og samle gjennomflytsenhet for kast. Etter denne wash trinn, plassere rør i posisjon for samling av eksempler.
- Elute eksempler ved å legge 500 µL av lyseringsbuffer til hver kolonne. Samle gjennomflytsenhet som inneholder nå thiophosphorylated og alkylated CK2 underlag.
5. Immunoprecipitation: Del I
- Forberede prøver immunoprecipitation ved første fjerne 80 µL for en "elueringsrør input kontroll" prøve fra hver av de respektive elutions ("kinase rxn", "GTPγS" og "PNBM") samlet i trinn 4.3. Etter fjerning av 80 µL fra hver prøve, vil det være omtrent 420 µL gjenværende per prøve.
- Dele hver prøve i 2 rør som inneholder 200 µL hver. Label hver respektive tube: "kinase rxn anti-thiophosphate ester", "kinase rxn IgG", "GTPγS anti-thiophosphate ester", "GTPγS IgG", "PNBM anti-thiophosphate ester" og "PNBM IgG".
- Legge til 2,8 µg anti-thiophosphate ester antistoff til hver av anti-thiophosphate ester-merket rør og 2,8 µg isotype kontroll antistoff til hver av IgG-merket rørene. Plasser rør på et rotator ved 4 ° C i 2 timer.
- Starte klargjøring av protein A/G perle under siste 15 min med 2t inkubering i trinn 5.2.
6. protein A/G agarose perle forberedelse
- Kort vortex lagring røret slik perler er helt nytt suspendert. Klipp av slutten av en P200 pipette tips med et rent razor blad for å øke måle størrelsen. Pipetter 100 µL av perle gjødsel per immunoprecipitation i en ny 1,7 mL microcentrifuge tube. For eksempel kreves totalt 6 rør.
- Sentrifuge rør 17.500 x g for 1 min på 4 ° C. Fjerne nedbryting og kast. Nytt avbryte perlene 200 µL lyseringsbuffer og kort vortex. Gjenta spinn og vask trinn 3 ganger.
- Etter siste vask, plasser perler på is til inkubasjon i trinn 5.2 er fullført.
7. Immunoprecipitation: Del II
- Etter den 2t inkubering fra trinn 5.2, Nedspinning prøvene 17.500 x g i 3 minutter på 4 ° C. Etter sentrifugering legge 200 µL fra hver prøve til rør med vasket perler. Plass rør på et rotator ved 4 ° C i 1 time.
- Etter inkubasjon 1t sentrifuge rør 17.500 x g for 1 min på 4 ° C. Neste fjerne 40 µL av nedbryting fra hver prøve og lagre som en "uttømming kontroll" (totalt 6 rør). Fjerne resten av nedbryting og kast. Ta vare ikke for å forstyrre perler.
- Vask prøvene av tilføyer 200 µL lyseringsbuffer og vortexing kort. Deretter sentrifuge 17.500 x g for 1 min på 4 ° C. Fjerne nedbryting og kast. Gjenta vask og spinne trinn 3 ganger. Ta vare ikke for å forstyrre perlene i disse trinnene.
- Etter endt vask trinnene, legge til 50 µL av 2 x prøve buffer hvert utvalg med perler. For alle andre prøver, kan du legge 8 µL av 6 x prøve buffer: "input kontroll", "elueringsrør inndatakontroller" og "uttømming kontroller".
- Når bufferen er lagt til rør, Pipetter opp og ned å blande og heten alle prøver på 95 ° C i 5 minutter før du fortsetter med SDS-side.
8. analyse/validering av resultater
- Validere vellykket CK2-avhengige thiophosphorylation og alkylation.
- For å fastslå effekten av CK2-mediert thiophosphorylation i trinn 2.2, utføre SDS side og vestlige blotting ved å kjøre 15-20 µL av "elueringsrør inn kontrollene" samlet i trinn 5.1 på en 12,5% polyakrylamid gel.
- Undersøke membraner med følgende antistoffer: anti-thiophosphate ester, anti-CK2α, og anti-GAPDH (eller andre passende lasting kontroll). Hvis dette trinnet er fullført, bør et forbedret anti-thiophosphate ester signal være i "kinase rxn" kjørefelt i forhold til de andre to banene (figur 2).
- Visualisere beriket antatte underlag av CK2 og bestemme protein identitet.
- For å vurdere om immunoprecipitation trinnene var vellykket, Kjør 25-30 µL av prøvene elut fra perlene i trinn 7.4 på en separat 12,5% polyakrylamid gel. Kontroller at alt utstyret er ren og bruk hansker til alle tider i dette trinnet å redusere forurensning.
- Stain gel med Coomassie blå å visualisere beriket proteiner fra ulike stadier av eksperimentelle protokollen (Figur 3). Bruke nye razorblades, nøye avgiftsdirektoratet unike band tilstede i "kinase rxn anti-thiophosphate ester IP" kjørefelt, bemerker deres omtrentlig molekylvekt.
- Sende disse bandene for protein identifikasjon av flytende kromatografi/tandem massespektrometri (LC-MS/MS) (Figur 4). Hvis det finnes antistoffer rettet mot identifiserte proteiner, bekrefte resultatene av massespektrometri SDS-side og immunoblotting av input, utarmet, og IP fraksjoner samlet i løpet av protokollen (Figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skjematisk diagram av den eksperimentelle prosedyren finnes i figur 1. Underliggende grunnlaget for teknikken er uvanlig mulighet til CK2 å bruke GTP for phosphoryl gruppe overføring. Tillegg av eksogene CK2 holoenzyme sammen med GTP analog, GTPγS, til en celle lysate resulterer i thiophosphorylation av endogene CK2 underlag. Påfølgende behandling av det lysate med alkylating reagens p- nitrobenzyl mesylate (PNBM) genererer en thiophosphate ester moiety på disse bestemte substrat proteiner som deretter kan immunoprecipitated bruke et anti-thiophosphate ester antistoff og til slutt identifiseres av massespektrometri. Figur 2 viser et positivt resultat etter tillegg av CK2 og GTPγS og PNBM til T98G (glioblastom) celle lysate. Disse resultatene viser at CK2-avhengige thiophosphorylation og senere alkylation var vellykket. Som forventet, er et forbedret anti-thiophosphate ester signal av vestlige blotting observert i felt som inneholder fullstendig kinase reaksjonen og ikke i GTPγS bare- og PNBM bare behandlet prøver. Vist i Figur 3 er en Coomassie blå-farget gel immunoprecipitated og elut proteiner med isotype kontroll IgG eller anti-thiophosphate ester antistoffer i tilstedeværelse eller fravær av overflødig CK2 og/eller GTPγS. Disse dataene viser også et positivt resultat som flere unike band er tydelig bare i anti-thiophosphate ester IP lane som den lysate ble inkubert med ytre CK2 og GTPγS. Bandet vises med en asterisk ble excised fra gel og sendt til protein identifikasjon av massespektrometri. Figur 4 illustrerer representant data innhentet av masse spectrometric analyse inkludert protein identifikasjon, prosent dekning og antall unike peptider identifisert per protein i bandet. Vises topp ti treff fra innsendte bandet (Figur 3) og informasjon om hvorvidt protein er identifisert tidligere som et substrat CK215,16,17. Identiteten til en av de kjente immunoprecipitated CK2 underlag, nucleolin15, bekrefter SDS side og immunoblotting av de angitte fraksjonene med et anti-nucleolin antistoff.
Figur 1: skjematisk diagram av eksperimentelle strategien. Den GTP analogt, GTPγS, sammen med overflødig rekombinant CK2 holoenzyme lagt til en celle eller vev lysate og tillater thiophosphorylation av underlag av CK2 men ikke av andre endogene kinaser. Thiophosphorylated underlag er neste alkylated med PNBM, genererer en thiophosphate ester moiety på disse proteiner, som blir deretter fanget opp via immunoprecipitation (IP) for påfølgende identifikasjon av flytende kromatografi-tandem massespektrometri ( LC-MS/MS). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: validering av CK2-avhengige thiophosphorylation i hele cellen lysate. Hele cellen lysates utarbeidet av T98G celler ble inkubert med GTPγS i tilstedeværelse (kinase reaksjon) eller fravær (GTPγS bare) av eksogene rekombinant CK2 holoenzyme. PNBM ble senere lagt til angitte reaksjoner, og prøver ble løst av SDS siden etterfulgt av immunoblotting med angitte antistoffer. Protein molekylvekt markører er oppgitt i kDa. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Immunoprecipitation antatte CK2 substrat proteiner. Berikelse og visualisering av mulige CK2 underlag (tredje lane) er tydelig som flere unike band etter immunoprecipitation med anti-thiophosphate ester antistoffer. Immunoprecipitates ble løst av SDS side og gel var farget med Coomassie blå. Bandet markert med stjerne var forbrukeravgift fra gel og sendt til protein identifikasjon av massespektrometri. Protein molekylvekt markører er oppgitt i kDa. IP = immunoprecipitation. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Identifikasjon og bekreftelse av proteiner som underlag av CK2 i vitro. Data innhentet av massespektrometri viser at både tidligere kjent15,16,17 samt antatte romanen CK2 underlag ble identifisert med dette eksperimentelle tilnærming. Vist er topp ti proteiner identifisert forbrukeravgift bandet (øverst). Identiteten til nucleolin, en kjent CK2 underlaget, ble bekreftet av immunoblotting av de angitte fraksjonene med et anti-nucleolin antistoff (nederst). Protein molekylvekt markører er oppgitt i kDa. IP = immunoprecipitation. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Reagens lager konsentrasjon | Reagens siste konsentrasjon | Eksempel volumer lagt basert på lager konsentrasjoner |
| 1 M Tris pH 7.4 | 20.0 mM | 200 ΜL |
| 4 M NaCl | 20.0 mM | 50 ΜL |
| 20% Triton X-100 | 0,50% | 250 ΜL |
| 1 M MgCl2 | 10,0 mM | 100 ΜL |
| 1 M DTT | 0,5 mM | 5 ΜL |
| 200 mM Na3VO4 | 1.0 mM | 50 ΜL |
| 500 mM NaF | 10,0 mM | 200 ΜL |
| 500 mM β-glyserol fosfat | 10,0 mM | 200 ΜL |
| H2O | 8.945 mL | |
| + 1 komplett Mini kategorien/10 mL | 1 tavle |
Tabell 1. Lysis buffer oppskrift (10 mL, 1 X).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en relativt enkel biokjemiske metode for å identifisere underlag av protein kinase CK2 fra et komplekse biologiske utvalg. De avgjørende skritt i denne protokollen er basert på uvanlig enzymatisk egenskapene for CK2 og inkluderer CK2-avhengige thiophosphorylation bestemt substrat proteiner med GTPγS og påfølgende immunoprecipitation og identifikasjon. Med disse resultatene har vi vist av og allsidighet av denne tilnærmingen som vi nå har søkt denne strategien i både menneskelige glioblastom celler og Drosophila eggstokkene18.
En rekke tidligere publiserte studier ved hjelp av kvantitative phosphoproteomics tilnærminger har faktisk vist seg vellykket identifisere romanen CK2 underlag19,20,21,22, 23. imidlertid noen av disse strategiene gjør bruk av immobilisert substrat matriser, og det er mulig at konformasjon av en immobilisert protein kan gjøre en potensiell fosforylering sted utilgjengelig for kinase. Teknikken er beskrevet her tillater fosforylering i et mer fysiologiske eller opprinnelige miljø (dvs. en celle lysate), og dermed redusere sannsynligheten for området forhindringer. En annen fordel med denne strategien er at når protein identifikasjon bestemmes av massespektrometri, validering av antatte CK2 underlag kan enkelt utføres på prøver innhentet under prosedyren hvis antistoffer rettet mot underlaget protein(s) rundt er tilgjengelig. For eksempel skal bruker standard vestlige blotting, en observere en reduksjon i relevante proteinet i utarmet (post-IP) prøvene og sin tilstedeværelse i anti-thiophosphate ester immunoprecipitates som vi har vist for den kjente CK2 substrat nucleolin (Figur 4).
En kjent begrensning av denne metoden er at det siste trinnet i prosedyren før analyse av massespektrometri er avhengig av muligheten til å skjelne diskret forskjeller i striper mønster på en gel. Dermed er det absolutt mulig at bestemte CK2 underlag kan være savnet hvis de er av lav overflod og derfor under grensen på visuell gjenkjenning. Hvis man er opptatt av denne muligheten, kan mer følsomme metode som sølv flekker brukes til å visualisere disse proteinene i stedet for Coomassie blå. Tas som bør bli anerkjent er at en rekke CK2 underlag ikke kan bli identifisert med denne strategien siden fysiologisk relevante nettsteder vil allerede være fosforylert i vivo. Dette er nesten helt sikkert å være tilfelle gitt konstituerende aktiviteten til CK2. Til slutt, det bør også bemerkes at denne metoden bare identifiserer proteiner som antatte underlag av CK2 i vitro. Påfølgende analyser til å validere at disse er fysiologisk relevante underlag av CK2 i vivo må og bør innebære identifikasjon av CK2-avhengige fosforylering områder og vurdere hvis fosforylering av disse bestemt rester endret svar på manipulering av CK2 kinase aktivitet.
I sammendraget, vil denne strategien kombinert med nedstrøms eksperimentelle tilnærminger (fosforylering nettstedet kartlegging av trunkering/sletting analyse, området-rettet mutagenese, funksjonelle i vitro og i vivo analyser, etc.) lette studien av denne uvanlige kinase og vil øke vår forståelse av de ulike rollene som CK2 spiller i flere biologiske systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet var støttes delvis av en Commonwealth Universal forskning ekstrautstyr bevilgning fra Pennsylvania Department of Health å T.I.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
| 2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
| Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
| cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
| Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
| Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
| Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
| Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
| T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
| Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |
References
- Litchfield, D. W. Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death. Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).
- Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2). Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).
- Meggio, F., Pinna, L. A.
- Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme. The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).
- Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme. Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).
- Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2. Nature Structural & Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).
- Lou, D. Y., et al. The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development. Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).
- Buchou, T., et al. Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality. Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).
- Chua, M. M., et al. CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target. Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).
- Tawfic, S., et al.
- Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).
- Siddiqui-Jain, A., et al. CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy. Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).
- Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies. Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).
- Perea, S. E., et al. CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).
- Xiao, S., et al. Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation. PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).
- Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).
- Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity. Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).
- McMillan, E. A., et al. The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis. Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).
- Turowec, J. P., et al. Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells. Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).
- Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).
- Bian, Y., et al. Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow. Scientific Reports. 3, 3460 (2013).
- Franchin, C., et al. Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).
- Franchin, C., et al. Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).
