Fermento como um chassi para desenvolver ensaios funcionais para estudar p53 humano

Resumo

Aqui apresentamos quatro protocolos para construir e explorar cepas de levedura Saccharomyces cerevisiae reporter para estudar o potencial de transativação do p53 humano, impactos de suas várias mutações associadas ao câncer, proteínas interagindo coexpressas e os efeitos de moléculas pequenas específicas.

Resumo

A constatação de que a conhecida proteína p53 de mamíferos pode atuar como fator de transcrição (TF) na levedura S. cerevisiae permitiu o desenvolvimento de diferentes ensaios funcionais para estudar os impactos de 1) local de ligação [i.e., elemento de resposta (re)] variantes da seqüência na especificidade da transativação p53 ou 2) mutações TP53 , cofactores co-expressados, ou moléculas pequenas na atividade da transativação p53. Diferentes aplicações de pesquisa de base e translacional foram desenvolvidas. Experimentalmente, essas abordagens exploram duas grandes vantagens do modelo de levedura. Por um lado, a facilidade de edição do genoma permite a construção rápida de sistemas de repórter qualitativos ou quantitativos, explorando cepas isogênicas que diferem apenas ao nível de um específico p53-RE para investigar a especificidade da seqüência de p53-dependente transactivacao. Por outro lado, a disponibilidade de sistemas regulamentados para a expressão ectópica do p53 permite a avaliação da transativação em uma ampla gama de expressão protéica. Revisados neste relatório são amplamente utilizados sistemas que são baseados em genes de repórter de cor, luciferase, e o crescimento de levedura para ilustrar suas principais etapas metodológicas e para avaliar criticamente o seu poder preditivo. Além disso, a extrema versatilidade dessas abordagens pode ser facilmente explorada para estudar diferentes TFs, incluindo P63 e p73, que são outros membros da família gene TP53 .

Introdução

A transcrição é um processo extremamente complexo envolvendo a organização dinâmica, espacial e temporal de fatores de transcrição (TFs) e cofatores para o recrutamento e modulação de polimerases de RNA em regiões de cromatina em resposta a estímulos específicos¹ . A maioria dos TFs, incluindo o supressor do tumor p53 humano, reconhecem elementos específicos de ação cis na forma de seqüências de DNA chamados elementos de resposta (REs), que consistem em únicos (ou múltiplos) motivos únicos ~ 6-10 nucleotídeos longos. Dentro desses motivos, posições individuais podem mostrar vários graus de variabilidade², geralmente resu....

Protocolo

1. construção de cepas de levedura ADE2 ou LUC1 repórter contendo um re específico (Yafm-re ou ylfm-re)

1. Raia uma estirpe yafm-iCore ou ylfm-iCore^12,14 (iCore = i, ISCe-i endonuclease GAL1 promotor; CO = contador selecionável URA3; RE = repórter KanMX4 conferindo resistência à kanamicina; Tabela 1) de um estoque de glicerol a 15% armazenado em-80 ° c em uma placa de agar YPDA (tabela 2). Deixe crescer por 2-3 dias a 30 ° c.
2. Tomar uma colônia de levedura a partir da placa fresca (não mais de 3 semanas de idade) e c....

Resultados

Construção de ADE2 ou LUC1 cepas de levedura repórter

ODelitto perfettoapproach^12,14,15,16 foi adaptado para possibilitar a construção de cepas de levedura de repórter p53 (

Discussão

Os ensaios baseados em leveduras provaram ser úteis para investigar vários aspectos das funções da proteína p53. Esses ensaios são particularmente sensíveis para avaliar o potencial de transativação do p53 em relação a variantes de sítios alvo de RE, incluindo a avaliação de polimorfismos funcionais. O uso de repórteres de cor, bem como a miniaturização do resultado do ensaio luciferase em ensaios de custo-benefício e relativamente escalável. Além disso, o teste de inibição do crescimento é potencialmente capaz de ser ut.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
L-aspártico	SIGMA	11189
QIAquick	QIAGEN	28104
L-fenilalanina	SIGMA	78019
Peptona	BD Bacto	211677
Levedura ex + A2: C26tract	BD Bacto	212750
Base de nitrogênio de levedura Difco sem aminoácidos e sulfato de amônio	BDTM	233520
Acetato de Lítio Di-hidratado	SIGMA	517992
Ágar Bacteriológico Tipo A	Biokar Diagnostics	A1010 HA
G418 sal dissulfato	SIGMA	A1720
Sulfato de amônio	SIGMA	A2939
Monocloridrato de L-arginina	SIGMA	A5131
Sal de Hemisulfato de Adenina	SIGMA	A9126
Tampão de Lise Passivo 5x	PROMEGA	E1941
Sistema de Ensaio de Luciferase Bright-Glo	PROMEGA	E2620
5-FOA	Zymo Research	F9001
D-(+)-Galactose	SIGMA	G0750
L-Ácido Glutâmico	SIGMA	G1251
Dextrose	SIGMA	G7021
L-Histidina	SIGMA	H8125
L-Isoleucina	SIGMA	I2752
L-Lisina	SIGMA	L1262
L-Leucina	SIGMA	L8000
L-Metionina	SIGMA	M2893
PEG	SIGMA	P3640
D-(+)-Rafinose Pentahidrato	SIGMA	R0250
L-serina	SIGMA	S4500
L-triptofano	SIGMA	T0271
L-treonina	SIGMA	T8625
Uracilo	SIGMA	U0750
L-valina	SIGMA	V0500

Kit de purificação de PCR