Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

Resumo

Apresentamos um método para a purificação, detecção e identificação de peptídeos diGly que se originam de proteínas ubiquitinadas de amostras biológicas complexas. O método apresentado é reprodutível, robusto e supera os métodos publicados em relação ao nível de profundidade da análise ubiquitinome.

Resumo

A modificação pós-tralácida das proteínas pela pequena ubiquitina proteica está envolvida em muitos eventos celulares. Após a digestão tripé de proteínas ubiquitinadas, peptídeos com um remanescente diglíino conjugado ao grupo epsilon amino de lysina ('K-ε-diglycine' ou simplesmente 'diGly') podem ser usados para rastrear o local original de modificação. A imunopurificação eficiente dos peptídeos diGly combinados com a detecção sensível por espectrometria de massa resultou em um enorme aumento no número de locais de ubiquitinação identificados até o momento. Fizemos várias melhorias neste fluxo de trabalho, incluindo o fracionadode em fase inversa de pH off-line de peptídeos antes do procedimento de enriquecimento, e a inclusão de configurações mais avançadas de fragmentação de peptídeos no multipólo de roteamento de íons. Além disso, a limpeza mais eficiente da amostra usando um plugue baseado em filtro para reter as contas de anticorpos resulta em uma maior especificidade para peptídeos diGly. Essas melhorias resultam na detecção rotineira de mais de 23.000 peptídeos diGly de células cancerígenas do colo uterino humano (HeLa) sobre a inibição proteasome na célula. Mostramos a eficácia dessa estratégia para análise aprofundada dos perfis ubiquitino dos vários tipos de células diferentes e de amostras in vivo, como tecido cerebral. Este estudo apresenta uma adição original à caixa de ferramentas para análise de ubiquitina proteica para descobrir a ubiquitinome celular profunda.

Introdução

A conjugação de ubiquitina às proteínas marca-as para a degradação pelo proteasome e é um processo crucial na proteostasis. O grupo carboxyl c-terminal de ubiquitina forma uma ligação isopeptídeo com o grupo lysine ε-amino da proteína alvo^1,2. Além disso, a ubiquitina pode ser anexada a outros módulos de ubiquitina, resultando na formação de estruturas homogêneas (ou seja, K48 ou K11) ou ramificadas (i.e., heterogêneas ou mistas) estruturas de poliubiquitina^1,3. A função mais conhecida da ubiquitina é seu papel na degradação proteasômica, mediada pela ....

Protocolo

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (EDC) da Erasmus MC.

1. Preparação da amostra

1. Células cultivadas
   1. Selecione uma linha de interesse celular (por exemplo, HeLa ou osteossarcoma [U2OS]) e crie as células no Minimal Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco, complementada com 10% de soro bovino fetal inativado pelo calor (FBS) e 100 unidades/mL penicilina/estreptomicina.
   2. Para experimentos de proteômica quantitativa, as células de cultura no DMEM não possuem arginina e lysina. O meio deve ser suplementado com soro bovino fetal dialisado de 10% (FBS), 100 uni....

Resultados

As proteínas ubiquitadas deixam um remanescente de diglycine 114,04 no resíduo de lysina alvo quando as proteínas são digeridas com tripsina. A diferença de massa causada por este motivo foi usada para reconhecer inequivocamente o local da ubiquitina em um experimento de espectrometria de massa. A estratégia que descrevemos aqui é um método de última geração para o enriquecimento e posterior identificação de peptídeos diGly por nanofluxo LC-MS/MS(Figura 1

Discussão

O protocolo descrito aqui foi aplicado a amostras de diversas fontes biológicas, como células cultivadas e tecido in vivo. Em todos os casos identificamos milhares de peptídeos diGly, desde que a quantidade total de entrada de proteínas fosse de pelo menos 1 mg. O enriquecimento utilizando anticorpos específicos é altamente eficiente, uma vez que apenas no máximo 100-150 peptídeos diGly muito baixos abundantes foram identificados a partir de lysatos celulares inteiros se não foram aplicados procedimentos de enriqueciment.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1,4-Ditioeritritol	Sigma-Aldrich	D8255
3M Empore C18 Octadecyl disks	Supelco	66883-U	produto descontinuado na Supelco; CDS Analytical é o novo fabricante (https://www.cdsanalytical.com/empore)
Formato de amônio	Sigma-Aldrich	70221
Bortezomib	UBPbio
CSH130 resina, 3.5 μ m, 130 &	Waters
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	34869
DMEM	ThermoFisher
EASY-nanoLC 1200	ThermoFisher
FBS	Gibco
GF/F plugue de filtro	Whatman	1825-021
Iodoacetamida	Sigma-Aldrich	I6125
Lisina, Arginina	Sigma-Aldrich
Lisina-8 (13C6; 15N2), Arginina-10 (13C6; 15N4)	Cambridge Isotope Laboratories
Lysyl Endopeptidase(LysC)	Wako Pure Chemicals	129-02541
NanoLC forno	MPI design, MS Wil GmbH
Sal de sódio N-Lauroilsarcosina	Sigma-Aldrich	L-5125
Orbitrap Fusion Lumos espectrômetro de massa	ThermoFisher
Kit de Ensaio de Proteína BCA Pierce	ThermoFisher / Pierce	23225
PLRP-S (300 Å, 50 µ m) partículas poliméricas de fase reversa	Agilent Technologies	PL1412-2K01
PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit	Cell Signaling Technologies	5562
Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartucho	Waters	WAT036790	Remova o material tC18 do cartucho antes de encher o cartucho com PLRP-S
Desoxicolato de sódio	Sigma-Aldrich	30970
Tris-base	Sigma-Aldrich	T6066
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941
Tripsina, TPCK tratado	ThermoFisher	20233