Edição do genoma em linhas de células de mamíferos usando CRISPR-Cas

Resumo

CRISPR-Cas é uma tecnologia poderosa para projetar os genomas complexos de plantas e animais. Aqui, detalhamos um protocolo eficiente editar o genoma humano usando diferentes endonucleases de Cas. Destacamos importantes considerações e parâmetros de projeto para otimizar a eficiência de edição.

Resumo

O sistema regularmente intercaladas curta palíndromo repetições (CRISPR) em cluster funciona naturalmente na imunidade adaptativa bacteriana, mas tem com êxito foi realocado para engenharia do genoma em muitos organismos vivos diferentes. Mais comumente, a sua CRISPR associado 9 (Cas9) ou Cas12a endonuclease é usado para decompor a locais específicos no genoma, após o qual o intervalo de dupla-hélice do DNA é reparado através de fim não-homóloga aderir a caminho (NHEJ) ou o reparo de homologia-dirigido ( Caminho HDR) dependendo se é um modelo de doador ausentes ou apresentam respectivamente. Até à data, sistemas CRISPR de diferentes espécies bacterianas foram mostrados para ser capaz de realizar a edição de genoma em células de mamíferos. No entanto, apesar da aparente simplicidade da tecnologia, vários parâmetros de projeto precisam ser considerados, que muitas vezes deixam perplexos sobre como melhor realizar seu genoma edição de experiências de usuários. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho completo de delineamento experimental para identificação de clones de células que levam a modificações de DNA desejadas, com o objetivo de facilitar a execução bem-sucedida do genoma edição experimentos em linhas de células de mamíferos. Destacamos as considerações-chave para que os usuários anotem, incluindo a escolha do sistema CRISPR, o comprimento do espaçador e o design de um modelo de doador single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN). Vislumbramos que este fluxo de trabalho será útil para estudos de gene nocaute, doença modelagem esforços, ou linhas de célula a geração de repórter.

Introdução

A capacidade para projetar o genoma de qualquer organismo vivo tem muitas aplicações biomédicas e biotecnológicas, como a correção da doença-causando mutações, construção de modelos de celulares precisos para estudos de doença, ou geração de produtos agrícolas culturas com características desejáveis. Desde a virada do século, diversas tecnologias foram desenvolvidas para a engenharia do genoma em células de mamíferos, incluindo meganucleases^1,2,3, zinco dedo nucleases^4,5, ou transcrição como ativador effector nuclease....

Protocolo

1. design de sgRNAs

1. Selecione um sistema adequado de CRISPR-Cas.
   1. Primeiro, inspecione a região de destino para as sequências de PAM de todas as nucleases Cas9 e Cas12a que foram mostradas para ser funcional em células de mamíferos^16,21-32. Cinco enzimas usadas com frequência são descritas na tabela 1 , juntamente com seus respectivas PAMs.
      Nota: além das endonucleases listados na tabela 1, há outras enzimas Cas menos comumente usadas que foram implantadas com sucesso em células de mamíferos, tais como uma nuclease Cas9 de Streptococcus thermophilus (St1Cas9) que reconhece o PAM NNAGAAW. Se o si....

Resultados

Para executar um genoma edição experimento, um plasmídeo CRISPR expressando uma sgRNA como alvo que o locus de interesse precisa ser clonado. Primeiro, o plasmídeo é digerido com uma enzima de restrição (normalmente um tipo de enzima do IIs) para linearizá-lo. É recomendável para resolver o produto digerido em um gel de agarose 1% ao lado de um plasmídeo não digerido para distinguir entre uma digestão completa e parcial. Como plasmídeo não digerido supercoiled, eles tendem a correr mais rápido do que suas contrapartes li.......

Discussão

O sistema CRISPR-Cas é uma poderosa, revolucionária tecnologia para projetar os genomas e transcriptomes de plantas e animais. Numerosas espécies bacterianas foram encontradas para conter sistemas CRISPR-Cas, que potencialmente podem ser adaptados para o genoma e transcriptoma fins⁴⁴de engenharia. Embora a endonuclease Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9) foi a primeira enzima a ser implantado com sucesso em células humanas^21,22

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
T4 Polinucleotídeo Quinase (PNK)	NEB	M0201
Camarão Fosfatase Alcalina (rSAP)	NEB	M0371
Tris-Acetato-EDTA (TAE) Tamponamento, 50X	1ª Base	BUF-3000-50X4L	Diluir para 1X antes de usar. A solução 1X contém 40 mM de Tris, 20 mM de ácido acético e 1 mM de EDTA.
Tampão Tris-EDTA (TE), 10X	1ª Base	BUF-3020-10X4L	Diluir para 1X antes de usar. A solução 1X contém 10 mM de Tris (pH 8,0) e 1 mM de EDTA.
BbsI	NEB	R0539
BsmBI	NEB	R0580
T4 DNA Ligase	NEB	M0202	400.000 unidades/ml
Kit de ligação rápida	NEB	M2200	Uma alternativa à T4 DNA Ligase.
Kit de ligação rápida de DNA	Thermo Scientific	K1423	Uma alternativa à T4 DNA Ligase.
Kit de clonagem de PCR TOPO sem corte zero	Thermo Scientific	451245	A solução salina vem com o vetor TOPO no kit.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621L	Kit para montagem Gibson.
Um tiro Stbl3 Chemical Competente E.Coli	Thermo Scientific	C737303
LB Caldo (Lennox), pó	Sigma Aldrich	L3022	Reconstituir em ddH20, e autoclave antes de usar
LB Caldo com Ágar (Lennox), pó	Sigma Aldrich	L2897	Reconstituir em ddH20, e autoclave antes de usar
meios SOC	-	-	2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM de glicose em 1 L de LB Caldo
Ampicilina (Sódio), Grau USP	Gold Biotechnology	A-301
REDiant 2X PCR Mastermix	1ª Base	BIO-5185
Agarose	1ª Base	BIO-1000
T7 Endonuclease I	NEB	M0302
Kit Miniprep de Extração de DNA de Plasmídeo	Favorgen	FAPDE 300
Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM), Hiclona de Alta Glicose		SH30081,01	4,5 g/L Glicose, sem L-glutamina, HEPES e Piruvato de Sódio
L-Glutamina, 200mM	Gibco	25030
Penicilina-Estreptomicina, 10, 000U/mL	Gibco	15140
0,25% Tripsina-EDTA, 1X	Gibco	25200
Fetal Bovino O soro	Hyclone	SV30160	FBS é inativado por calor antes do uso a 56 oC por 30 min
de solução salina tamponada com fosfato, 1X	Gibco	20012
reagente de transfecção jetPRIME	Polyplus Transfection	114-75
Solução de extração de DNA QuickExtract, 1.0	Epicentro	LUCG-QE09050
ISOLATE II Kit de DNA genômico	Bioline	BIO-52067	Uma alternativa ao
QuickExtract Q5 DNA Polimerase de Alta Fidelidade	NEB	M0491
Solução de Desoxinucleotídeo (dNTP) Mix	NEB	N0447
6X Corante de Carregamento de DNA	Thermo Scientific	R0611	10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% azul de bromofenol, 0.03% xileno cianol FF, 60% glicerol, 60 mM EDTA
Inibidor de Protease Coquetel, Set3	Merck
Membrana de nitrocelulose, 0,2µ m	Bio-Rad	1620112
tampão Tris-glicina-SDS, 10X	Bio-Rad	1610772	Diluir para 1X antes de usar. A solução 1x contém 25 mM de Tris, 192 mM de glicina e 0,1% de SDS.
Tampão de tris-glicina, 10X	1ª base	BUF-2020	Diluir para 1X antes de usar. A solução 1x contém 25 mM de Tris e 192 mM de glicina.
Solução Ponceau S	Sigma Aldrich	P7170
TBS, 20X	1ª base	BUF-3030	Diluir para 1X antes de usar. A solução 1x contém 25 mM de Tris-HCl (pH 7,5) e 150 mM de NaCl.
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
Leite desnatado para imunoensaio	Nacalai Tesque	31149-75
WesternBright Sirius-femtograma HRP	Advansta	K12043
Anticorpo para β-actina (C4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-47778 Número de	lote: C0916
Sistema MiSeq	Illumina	SY-410-1003
Espectrofotômetro	NanoDrop Thermo Scientific	ND-2000
Fluorômetro Qubit	Thermo Scientific	Q33226
EVOS FL Sistema de Imagem	Celular Thermo Scientific	AMF4300
Plasmídeo CRISPR: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)	Addgene	48138	Sistema de vetor único: O gRNA é expresso a partir do mesmo plasmídeo.
Plasmídeo CRISPR: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA	Addgene	61591	Sistema de vetor único: O gRNA é expresso a partir do mesmo plasmídeo.
Plasmídeo CRISPR: xCas9 3.7	Addgene	108379	Sistema de vetor duplo: O gRNA é expresso a partir de um plasmídeo diferente.
Plasmídeo CRISPR: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9	Addgene	42230	Sistema de vetor único: O gRNA é expresso a partir do mesmo plasmídeo.
Plasmídeo CRISPR: hCas9	Addgene	41815	Sistema de vetor duplo: O gRNA é expresso a partir de um plasmídeo diferente.
Plasmídeo CRISPR: eSpCas9(1.1)	Addgene	71814	Sistema de vetor único: O gRNA é expresso a partir do mesmo plasmídeo.
Plasmídeo CRISPR: VP12 (SpCas9-HF1)	Addgene	72247	Sistema de vetor duplo: O gRNA é expresso a partir de um plasmídeo diferente.

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