Abordagens comportamentais para estudar estresse inato em zebrafish

As respostas ao estresse são Estados comportamentais e fisiológicos alterados resultantes de estímulos potencialmente prejudiciais ou aversivos. As respostas ao estresse são conservadas em todo o reino animal e são críticas para a sobrevivência de um organismo¹. Décadas de pesquisa expandiram enormemente nosso conhecimento de alguns dos mecanismos genéticos e neuronais subjacentes aos Estados de estresse. Hoje, as áreas do cérebro, como a amígdala e o estriado², e fatores genéticos como o hormônio liberador de corticotropina (CRH), e os receptores de glicocorticóide (gr) e Mineralocorticoide ( Mr) foram estudados extensivamente^3,4,5,6. Apesar destes resultados críticos, muito permanece desconhecido sobre a regulação genética e neuronal do stress. Como tal, muitos distúrbios relacionados com o stress sofrem de uma falta de terapêutica.

Organismos modelo geneticamente modificáveis fornecem uma ferramenta útil no estudo do controle genético e neuronal do comportamento. Os modelos de peixes, em particular, são extremamente poderosos: eles são pequenos organismos com tempos de geração curtos, seu uso em um ambiente laboratorial é facile, seus genomas são facilmente modificados, e, como um vertebrado, eles compartilham não só genética, mas também neuroanatômica homologia com seus homólogos mamíferos^7,8. Os ensaios padrão para o stress de medição podem ser emparelhados com as linhas do zebrafish que abrigando mutações genéticas, ou aquelas em que a manipulação de subconjuntos neuronal precisos é possível, e os efeitos de únicos genes ou de neurônios definidos podem ser avaliados ràpida e eficientemente.

Comportamentalmente, as respostas ao estresse podem ser caracterizadas em peixes como períodos de hiperatividade ou períodos prolongados de inatividade (semelhante a "congelamento")⁹, redução da exploração¹⁰, respiração rápida, ingestão reduzida de alimentos¹¹, e um lugar-preferência para o fundo de um tanque¹². Por exemplo, quando colocado em um tanque desconhecido, o zebrafish adulto e outros modelos pequenos do peixe mostram uma preferência inicial para a metade inferior do tanque, contudo, sobre o tempo, os peixes começam a explorar as metades superiores e inferiores com freqüência próximo-igual¹². Tratamento de adultos com drogas conhecidas para reduzir a ansiedade causa peixe para explorar imediatamente a metade superior^10,13. Inversamente, as drogas que aumentam a ansiedade causam o peixe a mostrar forte preferência pela metade inferior do tanque^12,14,15. Assim, a exploração e a preferência reduzidas para a metade inferior do tanque são indicadores simples e de confiança do esforço.

Como a maioria dos vertebrados, as respostas ao estresse em peixes são impulsionadas pela ativação do eixo hipotálamo-hipófise-interrenal (HPI; análoga ao eixo hipotálamo-hipófise-adrenal [hPa] em mamíferos)^14,15. Neurónios hipotalâmicos expressando o sinal de hormônio liberador de corticotropina (CRH) para a hipófise, que por sua vez libera hormônio liberador Adrenocorticotrópico (ACTH). ACTH então sinaliza para a glândula interrenal para produzir e secretar cortisol, que tem um número de alvos a jusante¹⁶, sendo um deles feedback negativo dos neurônios hipotalâmicos produtores de CRH^{3,17, 18,19}.

Aqui, nós descrevemos um método para avaliar medidas comportáveis do stress inata. Para o comportamento, nós detalha protocolos usando o teste novo do mergulho do tanque^12,14. Em seguida, demonstramos, como exemplo, que uma droga ansiolítica conhecida, buspirona, reduz as medidas comportamentais do estresse.

O protocolo foi aprovado pela instituição de cuidados institucionais de animais e uso Committeeat Florida Atlantic University.

1. preparação

1. Designe um quarto isolado para executar estudos comportáveis, ou feche fora de uma seção de um quarto de modo que seja isolado.
   Nota: o quarto deve ser imperturbável e ter tráfego baixo para evitar interromper o comportamento normal dos peixes.
2. Mova os seguintes materiais e equipamentos para a sala comportamental: (i) uma câmera e lente, (II) um filtro infravermelho que pode ser anexado à lente, (III) um suporte de câmera, (IV) um computador com software de aquisição de câmera, (v) uma mesa firme e estável para executar o ensaio em, (vi) luzes infravermelhas (luzes do IR; 850 nanômetro ou 940 nanômetro), (VII) um difusor acrílico branco, que seja mais longo do que o comprimento do tanque da gravação (VIII) 1,8 L tanque plástico trapezoidal do ensaio (referido como o "tanque novo"; o um usado aqui é 12 x 18 polegadas) , e (IX) um balde de água do sistema de peixes.
   Nota: para o novo tanque, o nosso laboratório utiliza embarcações de plástico disponíveis comercialmente, que são trapezoidais em forma. As dimensões do tanque são aproximadamente 6 em x 9 em (as dimensões detalhadas são fornecidas na Figura 1A). A placa do difusor que nós nos usamos é ligeiramente maior do que o tanque novo (12 em x 18 dentro). Experimentos com tanques novos foram realizados com reservatórios com diferentes formas, como aqueles que são retangulares ou com dimensões trapezoidais distintas^20,21. Tipicamente, o comportamento dos peixes é similar em todos os tanques não obstante suas dimensões: para todos os recipientes, os peixes preferem inicialmente a metade inferior, contudo sobre o tempo começam a explorar a metade superior com maior freqüência.
3. Fixe o filtro de infravermelhos à objectiva da câmara. Os comprimentos de onda das tiras de luz infravermelha tipicamente variam de 850 nm a 940 nm. O filtro é um filtro de passe longo que restringe a luz de comprimentos de onda inferiores a 720 Nm de transmitir através da câmera.
4. Selecione os parâmetros adequados para o software de aquisição da câmera. Para a maioria das gravações, defina a aquisição da câmera para uma taxa de 30 quadros por segundo e duração de gravação para 10 min.
   Observação: esses parâmetros podem diferir, dependendo do experimento. Por exemplo, para estudar a habituação em um novo tanque^22,23, gravações mais longas podem ser necessárias.

2. configuração

Nota: as etapas nesta seção descrevem a configuração do novo ensaio do tanque. Um diagrama do produto final é indicado na Figura 1B.

1. Coloque o novo tanque no meio da mesa.
2. Posicione as luzes infravermelhas atrás do tanque e coloc a tela acrílica branca da folha ou do difusor entre o tanque e a fonte luminosa do diodo emissor de luz.
   1. Coloc o difusor de modo que espalhe màxima a luz que vem dos LEDs, e a intensidade da luz é bastante para iluminar o tanque novo. Quanto mais perto a placa é a fonte de luz, o mais brilhante as luzes serão, mas quanto menos ele vai difundir. Pelo contraste, coloc a placa do difusor longe da fonte luminosa reduzirá a intensidade clara, mas espalha a luz melhor.
3. Encha aproximadamente três quartos do tanque novo com água do sistema de peixes.
   Nota: a água do sistema é gerada usando a osmose reversa da água da torneira, seguida pela dosagem tal que a condutibilidade iguala 900 ± 100 μS, esse pH é neutro (7,2), e que a temperatura é 27 ± 1 ° c.
4. Fixe a câmara ao suporte da câmara e ligue a câmara ao computador. Abra o software de aquisição de vídeo e ajuste a câmera para enfrentar a frente do tanque e garantir que todo o novo tanque pode ser visto e que não há áreas obscurecidas no vídeo. Ajuste o tanque e as luzes infravermelhas de modo que haja suficiente e mesmo a iluminação durante todo o tanque quando observado através da câmera.
   Nota: antes de prosseguir para experimentos, muitas vezes pode ser útil para executar uma execução de avaliação, em que o vídeo de um peixe é capturado e rastreamento é realizado. Isso garantirá que a configuração seja suficiente para a experimentação do comportamento.

3. novo tanque de configuração de teste

1. Prepare uma taça de 250 mL pré-cheia com água do sistema de peixes, e pelo menos dois tanques de retenção.
2. Na manhã do teste, transfira pelo menos 10 zebrafish adulto do teste para ser usado para cada condição experimental (controles e adultos experimentais) da facilidade de pesca em um tanque de exploração, transfira-os à sala do comportamento, e permita-os de aclimatar para pelo menos um Hora.
   Nota: uma análise de potência deve ser realizada antes da experimentação, ainda em nossas mãos, um n = 10 é geralmente suficiente para detectar significância estatística. Além disso, o tanque de retenção não deve conter mais de cinco indivíduos por litro de água. Uma aclimatação de uma hora é suficiente, uma vez que os adultos com zebrafish demonstraram habituar-se dentro de 30 minutos de um novo tanque²². Além disso, os ritmos comportamentais são afetados por processos circadianos e, assim, repetições experimentais realizadas em dias diferentes devem ser realizadas dentro das mesmas horas. Normalmente realizamos todas as experiências entre as horas de 11:00 am e 6:00 PM.
3. Rotular os tanques de forma que a condição ou o genótipo dos animais é cego para o experimentador.
   Nota: experimentos podem ser facilmente cegos para o experimentador, rotulando tanques usando um sistema de letras ou números (ou seja, um tanque é rotulado como ' A ', outro ' B ', etc.). Uma parte não envolvida nos experimentos rotula os tanques com tal sistema, e mascara as identidades do experimentador até que após a conclusão da pós-análise.
4. Usando uma rede, coloc delicadamente um único adulto no copo pre-enchido da etapa 3,1. Permita que o peixe adulto aclimatar no copo por 10 minutos.
   Nota: grave o sexo do adulto, porque pôde ser borne-análise importante para procurar diferenças sexo-específicas.
5. Após aclimatização na taça, introduzir o peixe no tanque de novela (criado na seção 1), derramando suavemente a água e o adulto da taça.
6. Após ter introduzido o adulto no tanque novo, comece a gravação da câmera, e afaste-se da instalação para impedir a aflição adicional aos peixes.
7. Depois que a gravação terminar, retire o indivíduo do tanque de novela e coloque em um novo tanque de retenção.
   Nota: um tanque de retenção diferente do um na etapa 3,2 deve ser usado para evitar testes repetidos nos mesmos indivíduos.
8. Repita as etapas 3,4 a 3,7 para cada adulto até que todos os animais tenham sido testados.
   Nota: além de condições cedendo ou genótipos, Randomize ensaios. Use um gerador de números aleatórios ou qualquer ferramenta que permita randomizar entre os ensaios. Isto deve ser feito antes da experimentação de modo que cada experimentação esteja determinada antes que os experimentos comecem.
9. No final de todos os testes, devolver o peixe de volta para a instalação de peixes.

4. pré-tratamento com drogas

Nota: o objetivo das seguintes etapas é comparar o comportamento de um indivíduo antes e depois do uso de drogas. Esta comparação é conseguida primeiramente realizando um teste novo do tanque como em etapa 3,4 a 3,6, seguido pelo tratamento da droga, e então um segundo teste novo do tanque (Figura 3a).

1. Prepare uma solução conservada em estoque da droga, incluindo controles positivos e negativos.
   Nota: se o fármaco tiver sido previamente utilizado na literatura, encontre uma dose de trabalho adequada e utilize-a. Por exemplo, para buspirona nos resultados representativos, fazemos uma solução de estoque de 100x e utilizamos 0, 5 mg/ml como a concentração final, conforme descrito na literatura^13,14. Se a dose sugerida for desconhecida, uma curva de resposta da dose deve ser realizada examinando várias concentrações. Configurar mais taças com diluições seriais de medicina. Se a droga não for dissolúvel em água, use dimetil sulfóxido (DMSO) como um solvente.
2. Diluir as drogas para a concentração de trabalho em 250 ml copos com sistema de água. Por exemplo, se uma solução 100x foi feita, diluir 1:100 na água do sistema. Configure um copo com apenas água do sistema como um controle.
   Nota: se o DMSO foi usado como um solvente na etapa 3,1, use um volume igual de DMSO na taça de controle.
3. Com a ajuda de outro pesquisador, mascarar as identidades da droga e taças de controle para garantir que o testador é cego para as condições de tratamento até a pós-análise.
   Observação: um número ou sistema de letras pode ser usado.
4. Realize um novo teste de tanques seguindo as etapas 3,1 a 3,6 para obter uma resposta de estresse comportamental basal.
5. Após a gravação da linha de base, use uma rede para remover imediatamente o peixe adulto do tanque de novela e coloque-o na Taça dosada com droga ou veículo, como descrito na etapa 4,2. Deixe o adulto ficar na taça por 10 min.
   Nota: Assegure-se de que a rede não toque a água nos copos para impedir a contaminação cruzada das drogas. Garantir a dosagem adequada e tempo de administração, dependendo da droga usada. Um tempo de tratamento de 10 minutos pode não funcionar para todas as drogas.
6. Após o tratamento, use uma rede para remover o adulto do béaker na etapa 4,5 e coloc o em um outro copo enchido com a água fresca do sistema somente. Este é o período de washout para minimizar mais a dose durante o segundo teste novo do tanque. Permita que o adulto permaneça na lavagem para fora o copo por uns 10 minutos adicionais.
   Nota: as redes separadas devem ser usadas para cada condição da droga para impedir todo o tratamento transversal indesejável com medicina. O período de lavagem pode ser ignorado se o experimentador desejar.
7. Realize o novo teste de mergulho de tanque uma segunda vez, removendo esse adulto da taça no passo anterior, coloque-o em uma nova novela tanque, e siga as etapas 3,5 a 3,6.
8. Após o segundo teste novo do tanque, remova o indivíduo em um tanque de terra arrendada separado. Despeje afastado a água do sistema no segundo tanque novo e encha-o com água fresca do sistema para o teste seguinte. Esta etapa impede a contaminação cruzada de qualquer droga.
   Nota: dependendo da semivida das drogas, os copos frescos que contêm drogas devem ser feitos a cada 3 horas. Para Buspirone, fazer soluções frescas a cada 3 horas. Além disso, seguindo a nota na etapa 3,8, os ensaios devem ser randomizados entre controles e tratamentos medicamentoso.
9. No final de todas as provações, devolva os indivíduos de volta para a instalação de peixes.
   Nota: dependendo do tipo de medicamento utilizado, os efeitos destes tratamentos em indivíduos podem ser duradouros. Portanto, não use esses indivíduos em outros experimentos.

5. análise de vídeo

1. Depois de todos os ensaios, carregar arquivos de vídeo em software de rastreamento de escolha.
   Nota: normalmente usamos software de rastreamento disponível comercialmente, mas vários pacotes de software disponíveis gratuitamente podem ser usados. As etapas para alcançar o rastreamento podem diferir de acordo com o pacote de software usado.
2. Usando um quadro ainda a partir do vídeo, definir limites imaginários ao redor (i) toda a novela Arena tanque que é preenchido com água, e os limites em torno (II) o terço superior, (III) terço médio, e (IV) terço inferior do tanque. Use estes para estabelecer o tempo que os peixes gastados em cada parcela do tanque novo.
3. Calcule o deslocamento x-y por quadro para cada Arena definida na etapa 5,2.
4. Defina as áreas superior, média e inferior do tanque. Cada região deve ser semelhante em tamanho. Um método breve para determinar essas regiões é calcular o comprimento do tanque na direção y e dividi-lo por 3.
   Nota: existem variações para o protocolo geral. Por exemplo, alguns laboratórios usam metades em vez de terços¹⁴.
5. Determine o tempo gasto em cada Arena, a distância e a velocidade.
   Observação: a maioria dos pacotes de rastreamento automaticamente calculará esses para o usuário. No entanto, se o software de rastreamento não, eles podem ser calculados facilmente a partir dos valores de deslocamento x-y. Por exemplo, a distância pode ser determinada usando a fórmula:
   
   e a velocidade pode ser determinada seguindo a fórmula:
   
6. Repita as etapas 5,2 para 5,4 para adquirir faixas e medições para todos os ensaios.
   Nota: as variações deste protocolo geral

6. teste de normalidade

1. Realize estatísticas antes de prosseguir para calcular as diferenças estatísticas. Verifique para ver se os dados são distribuídos normalmente usando um teste de Shapiro-Wilk.
2. Se a hipótese nula de que os dados são normalmente distribuídos é rejeitada (ou seja, os dados não seguem uma distribuição gaussiana), executar todos os testes usando testes não paramétricos. Inversamente, se os dados forem encontrados para seguir uma distribuição normal, prossiga para usar testes paramétricos.
   Nota: utilizamos software comercialmente disponível para realizar estatísticas; no entanto, a linguagem de programação R também pode ser usada. Uma análise de Shapiro-Wilk pode ser executada usando a função Shapiro. Test de R.

Examinando o stress no zebrafish
Para examinar o comportamento de estresse ao longo do tempo em zebrafish tipo selvagem, testamos peixes adultos da cepa AB24 no teste de tanque novo. Os adultos do AB foram submetidos ao protocolo como descrito acima. Momentaneamente, os peixes foram dados um período da Aclimação 1-h em um tanque na sala do comportamento. Um indivíduo foi colocado em um copo para 10-min, e depois colocado suavemente em um tanque desconhecido (novo tanque) preenchido com água fresca do sistema. A atividade locomotora foi registrada por 10 min, e o rastreamento foi realizado off-line usando softwares disponíveis comercialmente. A comparação da atividade locomotora entre o primeiro e o último minuto mostrou diferenças dramáticas (Figura 2a, B). Quando introduzido pela primeira vez no tanque, os peixes passaram a maior parte do tempo no fundo (Figura 2b), mas ao longo do tempo, os adultos tiveram um aumento gradual na quantidade de tempo gasto no topo (Figura 2b, C). A duração total despendido no primeiro minuto em relação ao último minuto revelou diferenças significativas (6,29 ± 8,21 s vs. 23,23 ± 9, 2 s; teste t pareado, p < 0, 5) (Figura 2C). Em contrapartida, a distância total percorrida entre o primeiro e o último minuto não revelou diferenças significativas (440,4 ± 110,3 cm vs. 405,5 ± 49,71 cm; teste t pareado, p = 0,375) (Figura 2D). Como a preferência inata era diferente entre o primeiro e o último minuto, e não a distância percorrida, acreditamos que a mudança de comportamento representa uma resposta ao estresse, e não apenas uma mudança na atividade locomotora. Estes resultados demonstram que o zebrafish exibe uma resposta de stress inata facilmente mensurável. Essa abordagem também estabelece uma base para comparar as diferenças de estresse entre diferentes grupos de animais e avaliar as diferenças de estresse entre eles.

Efeitos de drogas ansiolíticas sobre o comportamento de estresse em zebrafish
O zebrafish é um poderoso sistema de triagem de drogas, uma vez que a aplicação da medicina pode ser aplicada de forma não invasiva, simplesmente adicionando à água25,26,27. Para validar que a habitação inferior no zebrafish representa uma resposta inata do esforço, nós comparamos o comportamento nos grupos de zebrafish adulto testados antes e depois da exposição a uma droga ansiolítica; como um controle, nós seguramos um separado dos adultos similarmente, contudo aplicado somente o veículo (água do sistema) em vez da medicina. Utilizou-se o buspirona agonista do receptor 5HT1a , que não é uma substância controlada e é prescrito para pacientes humanos que sofrem de transtorno de ansiedade generalizada28. A buspirona foi validada para causar redução nas respostas ao estresse comportamental em vários modelos de peixes e mamíferos10,13, 21,29,30, 31,32,33,34 . Como descrito no protocolo, o zebrafish foi gravado primeiramente no teste novo do tanque, recuperado então e coloc em um copo da droga ou do veículo por 10 minutos. os peixes foram dados então um período do wash-out do ', onde foram coloc em um copo novo por 10 minutos e regravado no novo teste do tanque (Figura 3a).

A análise das vias locomotoras revelou pouca diferença antes e após o tratamento para grupos de adultos expostos ao veículo isoladamente (Figura 3B). Em contrapartida, os adultos expostos à buspirona gastaram uma grande quantidade de tempo no topo em comparação com as vias locomotoras do mesmo peixe antes da exposição à droga (Figura 3B, C). A quantificação da duração do tempo gasto no topo não revelou diferenças significativas entre pré e pós-tratamento em animais controle (183,9 ± 90,46 s antes vs. 113,8 ± 81,88 s após; ANOVA One-Way seguida pelo teste de comparações múltiplas de Sidak, p = 0,4254), mas os animais expostos à buspirona gastaram significativamente mais tempo no topo em relação ao pré-tratamento, e controle dos indivíduos após o tratamento (buspirona: 201,4 ± 49,95 s antes vs. 552,2 ± 42,97 s após; ANOVA One-Way seguida por múltiplos de Sidak teste de comparações, p < 0, 1; Controle versus buspirona pós-tratamento: p < 0, 1.) (Figura 3C). Para examinar se as diferenças foram devidas a menos locomoção em geral, medimos a distância total percorrida. Esses dados não revelaram diferenças significativas para nenhum dos grupos (4134 ± 601,9 cm antes vs. 3471 ± 766 cm após o controle; Teste de Kruskal-Wallis, p > 0, 5; 3904 ± 301,3 cm antes vs. 3644 ± 566,3 cm depois para buspirona; Teste de Kruskal-Wallis, p > 0, 5) (Figura 3D). Tomados junto, estes dados demonstram que a habitação inferior no zebrafish adulto é uma medida do stress inato, e estabelece uma Fundação para umas experiências farmacológicas mais adicionais no zebrafish adulto.

Figura 1 . Diagrama da nova configuração do tanque. (A) dimensões do tanque de novela trapezoidal 1,8 L como visto a partir do lado de gravação do tanque. (B) diagrama da configuração, incluindo as posições das luzes infravermelhas, câmera e barreiras usadas para minimizar a interferência humana. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 . Examinando respostas inatas do stress no selvagem-tipo zebrafish. (A) caminhos de natação representativos de um adulto individual no novo teste do tanque no primeiro minuto (à esquerda) e último minuto (à direita) de uma gravação de 10 min. Linhas imaginárias que definem as zonas superior, média e inferior do tanque são indicadas com linhas pontilhadas. (B) quantificação do gasto total de tempo na zona superior para cada minuto da gravação de 10 min. (C &Amp; D) Comparações da duração total gasta na zona superior (C) e distância total percorrida (D) no primeiro e último minuto de todos os ensaios. Os testes t pareados foram utilizados para análise, uma vez que os dados passaram pelo teste de Shapiro-Wilk para normalidade. n = 5; *: p = 0, 28. As barras de erro indicam o erro padrão da média. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 . Examinando os efeitos de drogas ansiolíticas sobre o comportamento do estresse. (A) esquema do fluxo experimental. B) os percursos de natação representativos, antes e após o tratamento, de um indivíduo de um indivíduo controle Tratado apenas com água do sistema, e outro indivíduo tratado com buspirona no novo teste do tanque. As linhas pontilhadas definem a separação das zonas superior, média e inferior do tanque. As faixas cinzentas representam o indivíduo do controle, e as trilhas azuis representam o indivíduo Buspirone-Tratado. (C &Amp; D) Comparações da duração total gasta na zona superior (C) e distância total percorrida (D) entre os ensaios de controle (Ctrl) e buspirona (busp). Um teste para a normalidade usando o teste de Shapiro-Wilk foi feito primeiramente. Quando o teste de normalidade falhou, utilizou-se o teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de comparações múltiplas de Dunn (C); e se os dados passaram a normalidade, utilizou-se a ANOVA One-Way, seguida pelo teste de comparações múltiplas de Sidak (D). n = 5 para cada condição; : p = 0, 1. As barras de erro indicam o erro padrão da média. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram que não têm interesses concorrentes ou financeiros.