Medição de metaloproteinase matriz celular Global e atividade metabólica em hidrogel 3D

Resumo

Aqui, um protocolo é apresentado para encapsular e cultivo de células em hidrogel de poly(ethylene glycol) (PEG) acrescida com um fluorogenic matriz metaloproteinase (MMP)-peptídeo degradável. Celular MMP e atividade metabólica são medidos diretamente a partir das culturas de hidrogel usando um leitor de microplacas padrão.

Resumo

Sistemas de cultura tridimensional (3D) célula frequentemente mais estreitamente recapitular respostas celulares na vivo e funções que os sistemas tradicionais bidimensional (2D) cultura. No entanto, medição da função de células em cultura 3D é muitas vezes mais desafiador. Muitos ensaios biológicos requerem recuperação de material celular que pode ser difícil em culturas 3D. Uma maneira de responder a este desafio é desenvolver novos materiais que permitem a medição da função da célula dentro do material. Aqui, um método é apresentado para avaliação da actividade de metaloproteinase (MMP) matriz celular em hidrogel 3D em um formato de 96 poços. Neste sistema, um hidrogel de poly(ethylene glycol) (PEG) é acrescido com um sensor de cleavable fluorogenic MMP. Atividade celular MMP é proporcional à intensidade da fluorescência e pode ser medida com um leitor de microplacas padrão. Miniaturização deste ensaio para um formato de 96 poços reduziu o tempo necessário para experimental, instituído pelo uso de 50% e do reagente em 80% por condição em comparação com a versão anterior de 24-poço do ensaio. Este ensaio também é compatível com outras medições da função celular. Por exemplo, um ensaio de atividade metabólica é demonstrado aqui, que pode ser realizada simultaneamente com medições de atividade MMP dentro a mesma hidrogel. O ensaio é demonstrado com células de melanoma humano encapsuladas em toda uma gama de célula semeadura densidades para determinar a densidade de encapsulamento apropriado para a escala de trabalho do ensaio. Após 24h de encapsulamento de célula, MMP e atividade metabólica leituras foram proporcionais à densidade de semeadura de célula. Enquanto o ensaio é demonstrado aqui com uma carcaça de fluorogenic degradável, o ensaio e a metodologia podem ser adaptadas para uma grande variedade de sistemas de hidrogel e outros sensores fluorescentes. Tais fornece uma plataforma cultivo 3D prática, eficiente e facilmente acessível para uma grande variedade de aplicações.

Introdução

Tridimensional (3D) cultura sistemas frequentemente mais estreitamente recapitular na vivo respostas celulares do que os sistemas tradicionais bidimensional (2D) cultura, consulte vários excelentes publicações^1,2,3 . No entanto, utilizando sistemas de cultura 3D para medir a função celular tem sido um desafio devido à dificuldade de recuperação celular e processamento da amostra ainda mais. Essa dificuldade limita a medição de muitas funções celulares nos sistemas de cultura 3D. Para superar esta dificuldade, novas técnicas são necessárias que permitem fácil medição ....

Protocolo

1. preparação de componentes hidrogel

1. Sintetiza os fluorescentes péptidos protease-degradáveis como descrito em outro lugar⁸, utilizando fluoresceína como a molécula fluorescente e dabcyl como o quencher. Dissolva o peptídeo em DMSO a uma concentração de 10 mM e armazenar em um freezer-80 ° C em pequenas alíquotas (~ 30 µ l) para evitar ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.
   Nota: Estes peptídeos também podem ser adquiridos comercialmente. Este protocolo requer uma cisteína C-terminal da sequência de peptídeo para permitir ligações covalente incorporação os polímeros de hidrogel.
2. Prepare 8 braço 40 kDa poli (et....

Resultados

O ensaio atual foi adaptado de um sistema de cultura de hidrogel 3D anteriormente desenvolvidos e caracterizados acrescido com um fluorogenic MMP cleavable sensor⁸. O sensor MMP fluorogenic usado aqui consiste em uma sequência do peptide, GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (geize) C (↓ indica o local de clivagem) que anteriormente foi otimizado para a segmentação por MMP-14 e MMP-11¹⁹. O peptídeo é rotulado com uma molécula fluorescente (fluoresceína).......

Discussão

Cultura de células in vitro 3D recapitula a muitos aspectos importantes do ambiente em que vivo. No entanto, cultura 3D também faz avaliação função celular e sinalização desafiador, como muitos ensaios biológicos requerem recuperação celular e um grande número de células. Portanto, o desenvolvimento de um sistema de cultura 3D simples que permite uma medição da função celular sem amostra adicional processamento aumentaria grandemente a utilidade dos sistemas de cultura 3D. O sistema 3D descrito aqui pode ser adaptado par.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1X Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	10-010-049
Carvão ativado	Sigma-Aldrich	C3345
	Marca-Tech	89093-600
Peptídeo de adesão celular (CRGDS)	GenScript USA Inc.
I	Life Technologies	17100-017
Dextran	Sigma-Aldrich	D4876
DMEM High Glucose Media	Invitrogen	11965118
Fetal bovine serum (FBS)	Seradigm	1500-500
	Hemocitômetro BioTek	Cytation 3
	Hausser Scientific Co.	3200
L-glutamina	Life Technologies	25030-081
Peptídeo reticulado degradável por MMP (KCGPQG↓ IWGQCK)	GenScript USA Inc.	personalizado
	Fisher Scientific	S318500
Penicilina /estreptomicina	Life Technologies	15140-122
Resazurin (Alamar Blue)	Life Technologies	DAL1100
luz UV	Norma UVP	95-0006-02

Placa de 96 poços de fundo redondo preto enzima colagenase tipo personalizadaLeitor de microplacas de fluorescência NaOH