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Medição de metaloproteinase matriz celular Global e atividade metabólica em hidrogel 3D

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DOI:

10.3791/59123

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22 de janeiro de 2019

 , 
1Department of Biomedical Engineering, The Ohio State University, 2The Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Arthur G. James Cancer Hospital and Richard J. Solove Research Institute, 3Biomedical Technology Department, King Saud University

Neste artigo

Resumo

Aqui, um protocolo é apresentado para encapsular e cultivo de células em hidrogel de poly(ethylene glycol) (PEG) acrescida com um fluorogenic matriz metaloproteinase (MMP)-peptídeo degradável. Celular MMP e atividade metabólica são medidos diretamente a partir das culturas de hidrogel usando um leitor de microplacas padrão.

Resumo

Sistemas de cultura tridimensional (3D) célula frequentemente mais estreitamente recapitular respostas celulares na vivo e funções que os sistemas tradicionais bidimensional (2D) cultura. No entanto, medição da função de células em cultura 3D é muitas vezes mais desafiador. Muitos ensaios biológicos requerem recuperação de material celular que pode ser difícil em culturas 3D. Uma maneira de responder a este desafio é desenvolver novos materiais que permitem a medição da função da célula dentro do material. Aqui, um método é apresentado para avaliação da actividade de metaloproteinase (MMP) matriz celular em hidrogel 3D em um formato de 96 poços. Neste sistema, um hidrogel de poly(ethylene glycol) (PEG) é acrescido com um sensor de cleavable fluorogenic MMP. Atividade celular MMP é proporcional à intensidade da fluorescência e pode ser medida com um leitor de microplacas padrão. Miniaturização deste ensaio para um formato de 96 poços reduziu o tempo necessário para experimental, instituído pelo uso de 50% e do reagente em 80% por condição em comparação com a versão anterior de 24-poço do ensaio. Este ensaio também é compatível com outras medições da função celular. Por exemplo, um ensaio de atividade metabólica é demonstrado aqui, que pode ser realizada simultaneamente com medições de atividade MMP dentro a mesma hidrogel. O ensaio é demonstrado com células de melanoma humano encapsuladas em toda uma gama de célula semeadura densidades para determinar a densidade de encapsulamento apropriado para a escala de trabalho do ensaio. Após 24h de encapsulamento de célula, MMP e atividade metabólica leituras foram proporcionais à densidade de semeadura de célula. Enquanto o ensaio é demonstrado aqui com uma carcaça de fluorogenic degradável, o ensaio e a metodologia podem ser adaptadas para uma grande variedade de sistemas de hidrogel e outros sensores fluorescentes. Tais fornece uma plataforma cultivo 3D prática, eficiente e facilmente acessível para uma grande variedade de aplicações.

Introdução

Tridimensional (3D) cultura sistemas frequentemente mais estreitamente recapitular na vivo respostas celulares do que os sistemas tradicionais bidimensional (2D) cultura, consulte vários excelentes publicações1,2,3 . No entanto, utilizando sistemas de cultura 3D para medir a função celular tem sido um desafio devido à dificuldade de recuperação celular e processamento da amostra ainda mais. Essa dificuldade limita a medição de muitas funções celulares nos sistemas de cultura 3D. Para superar esta dificuldade, novas técnicas são necessárias que permitem fácil medição da função da célula dentro de ambientes 3D. Uma maneira de atender a essa necessidade é o desenvolvimento de materiais que não só apoiar a cultura de células 3D, mas também incorporam sensores para medir a função celular. Por exemplo, vários sistemas de hidrogel incorporaram partes cleavable de fluorogenic protease para habilitar a visualização de atividade de protease em ambientes 3D4,5,6,7. Enquanto estes sistemas foram originalmente utilizados para a geração de imagens microscópica, estes sistemas podem também ser adaptados para uso em um ensaio da atividade global matriz metaloproteinase (MMP) usando um leitor de placa padrão, permitindo fácil medição de uma função de célula em um 3D ambiente8.

MMPs, uma superfamília de proteases de zinco, desempenham um papel fundamental na homeostase do tecido normal e em muitas doenças. MMPs degradam e remodelam a matriz extracelular (ECM), cleave citocinas e receptores de superfície celular e ativar outros MMPs9,10. MMPs desempenham um papel crítico em processos fisiológicos como a cicatrização de feridas e em doenças como artrite, arteriosclerose, Alzheimer e câncer (veja comentários em 9,10,11). Em câncer, altos níveis de expressão de MMP estão fortemente correlacionados com metástase do cancro e de mau prognóstico12. Além disso, MMPs contribuam para progressão do tumor, promovendo a invasão de células de câncer e migração, processos celulares que são fenômenos inerentemente 3D13,14. Portanto, há muito interesse na capacidade de medir a atividade da MMP na cultura 3D em muitos contextos, incluindo estudos biológicos fundamentais e ensaios de despistagem de drogas.

Hidrogel PEG é amplamente utilizados para cultura de células 3D devido ao seu alto teor de água, resistência à adsorção de proteínas e a natureza ajustável. Hidrogel PEG ter sido acrescida com um número de partes para função direta da célula, tais como com peptídeos miméticas de ECM como RGD, RLD e IKVAV para facilitar a aderência de célula, ou direcionar o tethering de fatores de crescimento tais como transformar o fator de crescimento-β (TGF-β) 15,16. Mais recentemente, PEG hidrogel tem sido acrescida com peptídeos de sensor que permitem a mensuração da função celular, bem5,8. Especificamente, o uso de um sistema de hidrogel PEG acrescida com um fluorogenic medição de peptídeo habilitado MMP-degradáveis da atividade celular de MMP em culturas 3D com um leitor de placa padrão e não exigido nenhum processamento adicional. Estes sistemas também são compatíveis com outras medições da função celular, incluindo a atividade metabólica. Aqui, um protocolo é descrito para a medição da atividade da MMP de células cultivadas em um hidrogel de PEG 3D acrescida com um peptídeo de MMP-degradáveis fluorogenic e resultados apresentados demonstrando as experiências de otimização inicial necessárias para o uso do presente do ensaio. Células de melanoma humano (A375) foram encapsuladas no hidrogel fluorogenic sobre uma escala de densidades para determinar as densidades de semeadura adequadas que estão dentro da faixa de trabalho do ensaio de semeadura. Após 24h de encapsulamento, MMP e atividade metabólica foram medidos utilizando um leitor de microplacas padrão. Em seguida, MMP atividade foi normalizada a atividade metabólica para determinar as densidades de semeadura dentro da escala linear do ensaio. Finalmente, o coeficiente intraplaca das percentagens de variação (% CV) foram calculados entre triplica para refletir a reprodutibilidade dos resultados obtidos. Esse método permite que a cultura de células 3D simples e rápido e fácil medição de atividade de protease com processamento de amostra mínima.

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Protocolo

1. preparação de componentes hidrogel

  1. Sintetiza os fluorescentes péptidos protease-degradáveis como descrito em outro lugar8, utilizando fluoresceína como a molécula fluorescente e dabcyl como o quencher. Dissolva o peptídeo em DMSO a uma concentração de 10 mM e armazenar em um freezer-80 ° C em pequenas alíquotas (~ 30 µ l) para evitar ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.
    Nota: Estes peptídeos também podem ser adquiridos comercialmente. Este protocolo requer uma cisteína C-terminal da sequência de peptídeo para permitir ligações covalente incorporação os polímeros de hidrogel.
  2. Prepare 8 braço 40 kDa poli (etileno glicol) amina (PEG)-norbornene (NB) como descrito17. Verificar functionalization de grupo final de mais de 90% usando 1H NMR. Dissolva o PEG-NB em solução salina de tampão de fosfato estéril (PBS) no 25% w/v e guarde no congelador-80 ° C em alíquotas (~ 300 µ l).
    Nota: PEG acrescida com norbornene também pode ser adquirido comercialmente.
  3. Sintetiza a foto-iniciador de lítio fenil 2.4.6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP), conforme descrito em outro lugar,18. Dissolver o colo em água estéril para uma concentração de 68 mM e armazenar em um freezer-80 ° C em alíquotas (~ 300 µ l).
    Observação: como alternativa, Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) pode ser usado como foto-iniciador. COLO e Irgacure podem ser adquiridos comercialmente.
  4. Dissolver o crosslinker peptídeo MMP-degradável (KCGPQG↓IWGQCK) e o peptídeo de adesão celular (CRGDS) em água estéril para uma concentração de 200 mM e 100 mM, respectivamente e armazená-los em um freezer-80 ° C (~ 300 µ l e ~ 30 µ l) alíquotas, respectivamente.

2. preparação de meios de ensaio

  1. Preparar o calor-inativado, carvão despojado de soro fetal bovino (FBS) para o ensaio MMP:
    Nota: Proteases em FBS podem produzir um sinal de fundo elevado com o ensaio MMP; Portanto, é recomendável para inactivar a calor e carvão tira o FBS para os meios de ensaio.
    1. Inativar 100 mL de FBS por aquecimento durante 30 min a 55 ° C.
      Nota: 100 mL de FBS foi utilizada aqui para alíquotas e armazenamento a-20 ° C para uso futuro. Volumes menores podem ser usados quando necessário.
    2. Adicionar 0,25% w/v de carvão ativado e 0.025% w/v de dextrano a uma pequena quantidade de FBS (cerca de 5 mL) e mexa até um chorume é formado. Em seguida, adicione o restante do FBS e mexa durante 30 min a 55 ° C.
    3. Centrifugar 1.962 x g por 20 min a 4 ° C. Depois de transferir o sobrenadante para outro navio.
    4. Repita a etapa 2.1.2 mas a 37 ° C, seguido de passo 2.1.3. Esterilize o sobrenadante usando um filtro de 0,45 µm e em seguida um filtro de 0,2 µm.
  2. Preparar a mídia de ensaio usar meios suplementados com 1% de carvão despojado FBS, 2 mM L-glutamina, 10 penicilina U/mL, 10 estreptomicina µ g/mL.
    Nota: A mídia sem vermelho de fenol é recomendada porque tem menos interferência de fluorescência. Outras adições para a mídia de ensaio como insulina, fatores de crescimento, etc.. pode ser adicionado enquanto a absorvência e picos de espectro de fluorescência não se sobrepõem com o sensor (494 nm/521 nm).
  3. A enzima colagenase bacteriana diluído tipo I em 10 e 1.000 µ g/mL na mídia do ensaio como um controle positivo.

3. hidrogel preparação e célula de encapsulamento

  1. Prepare a solução de precursor de hidrogel.
    1. Adicionar os reagentes a um tubo de 1,5 mL, na seguinte ordem, num Vortex após a adição de cada componente: 20 mM 8 braço 40 kDa PEG-NB, peptídeo de 12,75 mM crosslinker MMP-degradável, 17,8 mM NaOH, 1 mM CRGDS, 2mm LAP e peptídeo fluorogenic MMP-degradáveis de 0,25 mM.
      Nota: A tabela 1 mostra o conteúdo de solução de precursor de hidrogel, concentrações estoque, concentrações de trabalho, fórmulas de cálculo de volume e os volumes necessários necessários para fazer 120 µ l de solução de precursor de hidrogel, que é suficiente para conduzir um experiência com 10 hidrogel. Para compensar a perda da solução de hidrogel devido a pipetagem, aumente o volume total de 20%. Os peptídeos comerciais são fornecidos frequentemente em uma solução ácida de cloreto de hidrogênio; Portanto, o NaOH é adicionado para obter um pH final de 7. pH da solução final deve ser confirmada pelo usuário.
    2. Dividir a solução do precursor de hidrogel em vários tubos de 1,5 mL, um tubo por condição a ser testado.
      Nota: Várias condições de controle em que o hidrogel é preparados sem a adição de células são sugeridas. Para um controle negativo, para compensar a degradação inespecífica do sensor fluorogenic, uma condição de hidrogel pode ser incubada com o controle do veículo ou a mídia experimental sozinha se não houver nenhuma condição de tratamento. Para um controle positivo e calibração entre experiências, hidrogel pode ser incubadas com uma protease conhecida para decompor o sensor fluorogenic. Por exemplo, duas concentrações de colagenase bacteriana foram usadas aqui.
  2. Encapsule células em hidrogel.
    1. Prepare uma suspensão de célula única conforme apropriado para o tipo de célula a ser usado. Por exemplo, lave um prato de 10cm de células de melanoma A375 com 10 mL de PBS. Trypsinize células usando a tripsina 0,05% e incubar a 37 ° C e 5% CO2 por 3 min. contagem de células com um hemocytometer para determinar o número total de células.
    2. Centrifugue a solução de célula a 314 x g durante 3 min, Aspire meios de cultura e, em seguida, re-suspender as células em PBS em aproximadamente três vezes maior exigida semeadura densidade para o experimento. Por exemplo, uma suspensão de células com uma densidade de 21 x 106 células foi usada aqui para conseguir uma densidade encapsulada final de 7 x 106 células/mL.
    3. Conte as células novamente para garantir uma concentração exata de célula.
    4. Adicione células suspensas e PBS a cada tubo de solução de precursor de hidrogel de acordo com a densidade de semeadura necessária (0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7 x 106 células/mL neste exemplo). Adicione PBS para condições com nenhuma célula em vez de células suspensas.
      Nota: Todas as condições devem ter o mesmo volume de solução de precursor de hidrogel final para garantir a relação entre os componentes de hidrogel e PBS é constante. Fazer não tubos de vórtice que têm células neles, Pipetar para cima e para baixo vigorosamente sem criar bolhas para misturar a solução de precursor.
    5. Diluir 10 µ l da solução de precursor de hidrogel em um estéril preto redondo placa de 96 poços de fundo, assegurando-se de que a ponta é centralizada no meio de cada poço, durante o fornecimento.
    6. Polimerizar-se solução de precursor de hidrogel, expondo a placa de luz ultravioleta (UV) em 4 mW/cm2 para 3 min.
      Nota: A lâmpada de UV (lâmpada de UV Handheld UVL-56, UVP, Upland, CA) produz luz UV-A em um comprimento de onda UV longo (365 nm), que não afeta a viabilidade celular.
    7. Adicione 150 µ l de mídia de ensaio para todos os poços excepto as condições de controlo positivo sem células encapsuladas. Para os controles positivos, adicione 150 µ l de solução de enzima colagenase.
    8. Adicione 150 µ l de PBS aos poços da placa para reduzir a evaporação durante a incubação externas.

4. MMP e medição de atividade metabólica

  1. Medir a fluorescência imediatamente pós-encapsulamento para estabelecer uma medida de fluorescência de referência e assegurar uniformidade na polimerização de hidrogel. Leia a placa usando uma fluorescência microplate leitor utilizando um protocolo de opaco placa de 96 poços, com uma área digitalizar configuração a 494 nm/521 nm (excitação/emissão). Este será o h 0 ler.
  2. Incube a placa numa incubadora umidificado a 37 ° C e 5% de CO2 para 18 h.
  3. Adicione o reagente de atividade metabólica (resazurina) às 01:10 (v/v) para cada poço.
  4. Incube a placa numa incubadora umidificado a 37 ° C e 5% de CO2 para um adicional 6 h.
    Nota: Este tempo de incubação pode variar dependendo do tipo de célula.
  5. Medir a fluorescência no pós-encapsulamento 24 h. Leia a placa usando uma fluorescência microplate leitor utilizando um protocolo de opaco placa de 96 poços, com uma área digitalizar configuração em 494 nm/521 nm (excitação/emissão) para a atividade MMP e 560 nm/590 nm (excitação/emissão) para a atividade metabólica.

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Resultados

O ensaio atual foi adaptado de um sistema de cultura de hidrogel 3D anteriormente desenvolvidos e caracterizados acrescido com um fluorogenic MMP cleavable sensor8. O sensor MMP fluorogenic usado aqui consiste em uma sequência do peptide, GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (geize) C (↓ indica o local de clivagem) que anteriormente foi otimizado para a segmentação por MMP-14 e MMP-1119. O peptídeo é rotulado com uma molécula fluorescente (fluoresceína)...

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Discussão

Cultura de células in vitro 3D recapitula a muitos aspectos importantes do ambiente em que vivo. No entanto, cultura 3D também faz avaliação função celular e sinalização desafiador, como muitos ensaios biológicos requerem recuperação celular e um grande número de células. Portanto, o desenvolvimento de um sistema de cultura 3D simples que permite uma medição da função celular sem amostra adicional processamento aumentaria grandemente a utilidade dos sistemas de cultura 3D. O sistema 3D descrito aqui pode ser adaptado par...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostaria de reconhecer Ohio Cancer Research (OCR), OH, EUA para financiamento deste trabalho, bem como rei Saud University (KSU), Riade, KSA para patrocinar o primeiro autor. Peso molecular do sensor fluorescente peptídeo foi medido usando matriz assistida, dessorção do laser-ionização, espectrometria de massa de tempo-de-voo (MALDI-TOF) com assistência do Campus química instrumento centro de espectrometria de massas e proteômica Instalação da Ohio State University.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1X Phosphate Buffered SalineFisher Scientific10-010-049
Carvão ativado Sigma-AldrichC3345
Marca-Tech89093-600
Peptídeo de adesão celular (CRGDS)GenScript USA Inc.
I Life Technologies17100-017
DextranSigma-AldrichD4876
DMEM High Glucose MediaInvitrogen11965118
Fetal bovine serum (FBS) Seradigm1500-500
Hemocitômetro BioTekCytation 3
Hausser Scientific Co.3200
L-glutaminaLife Technologies25030-081
Peptídeo reticulado degradável por MMP (KCGPQG↓ IWGQCK)GenScript USA Inc.personalizado
Fisher ScientificS318500
Penicilina /estreptomicinaLife Technologies15140-122
Resazurin (Alamar Blue)Life TechnologiesDAL1100
luz UV Norma UVP95-0006-02
Placa de 96 poços de fundo redondo preto enzima colagenase tipo personalizadaLeitor de microplacas de fluorescência NaOH

Referências

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