Artigo de método

Fluxo Cytometric análise das vesículas extracelulares de célula-condicionado Media

DOI:

10.3791/59128

⸱

12 de fevereiro de 2019

 ,  ,  , 
1Cellular and Molecular Cardiology Laboratory, Cardiocentro Ticino Foundation, Switzerland, 2Molecular Cardiology Institute, Dept. of Cardiology, University of Zürich, 3Faculty of Biomedical Science, Università Svizzera Italiana, Switzerland

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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O protocolo descreve um método reprodutível, projetado para uso com sobrenadantes de cultura celular para detectar epítopos superficiais em pequenas vesículas extracelulares (EV). Ele utiliza a imunoprecipitação de EV específica usando grânulos juntamente com anticorpos que reconhecem o antígeno de superfície CD9, CD63 e CD81. O método é otimizado para análise de citometria de fluxo a jusante.

Resumo

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Citometria de fluxo (FC) é o método de escolha para medição semi quantitativa de marcadores de antígeno de superfície da célula. Recentemente, esta técnica tem sido usada para análise fenotípica das vesículas extracelulares (EV), incluindo exosomes (Exo) no sangue periférico e outros fluidos corporais. O pequeno tamanho da EV exige o uso de instrumentos dedicados, tendo um limite de deteção em torno de 50-100 nm. Alternativamente, o EV pode ser vinculado a microbeads látex que pode ser detectado pelo FC. Microbeads, conjugados com anticorpos que reconhecem EV-associado marcadores/Cluster de diferenciação CD63 CD9 e CD81 pode ser usado para captura de EV. EXO isolada de CM pode ser analisado com ou sem pré-enriquecimento por ultracentrifugação. Esta abordagem é adequada para análises de EV usando instrumentos convencionais de FC. Nossos resultados demonstram uma correlação linear entre os valores de intensidade de fluorescência dizer (IFM) e concentração de EV. Perturbar o EV através de sonication drasticamente diminuída IFM, indicando que o método não detecta os restos de membrana. Nós relatamos um exato e confiável método para a análise de antígenos de superfície EV, que pode ser facilmente implementado em qualquer laboratório.

Introdução

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As células secretam vesículas extracelulares (EV) de tamanhos diferentes, incluindo aumentada (MV) e exosomes (Exo). Este último pode ser distinguido MV por ambos o tamanho e o compartimento subcelular de origem. MV (200 – 1.000 nm de tamanho) são liberados de células pai derramando da membrana plasmática. Por outro lado, Exo (30-150 nm) originam CDDP membranas e são liberados no espaço extracelular, quando os corpos multivesiculares (MVB) se fundem com a membrana celular1,2.

EV são cada vez mais utilizados como biomarcadores de diagnósticos, bem como, potencialmente, ferramentas terapêuticas em muitos campos, incluindo oncologia, Neurologia, Cardiologia e doenças músculo-esqueléticas3,4,5. A grande maioria dos estudos em andamento usando EV como agentes terapêuticos exploram o isolamento das vesículas da célula-condicionado médio (CM) de células cultivadas in vitro. Células-tronco mesenquimais (MSCs) exercem efeitos benéficos em diversos contextos, e MSC-derivado EV demonstraram benefícios em modelos de isquemia/reperfusão do miocárdio lesão6 e cérebro lesão7. MSC-derivado EV também apresentam atividades moduladora imunológica que podem ser exploradas para tratar a rejeição imune, como demonstrado em um modelo de terapia refractários doença enxerto - versus - host8. Células tronco de líquido amniótico (hAFS) ativamente enriquecer CM com MVs e Exo, heterogénea em tamanho (50 – 1.000 nm), que mediam vários efeitos biológicos, tais como a proliferação de células diferenciadas, angiogênese, inibição da fibrose, e Cardioprotection4. Recentemente mostramos que EV e particularmente Exo, secretado pelas células progenitoras cardíacas-derivado humano (Exo-CPC) reduzem o tamanho do infarto do miocárdio em ratos5,9.

EXO compartilhar um conjunto comum de proteínas em sua superfície, incluindo tetraspanins (CD9 CD63, CD81,) e o complexo principal de histocompatibilidade de classe I (MHC-eu). Além desse conjunto comum de proteínas, Exo também contêm proteínas específicas para o subconjunto de EV, o tipo de células do produtor. EXO marcadores estão ganhando maior importância porque eles desempenham um papel crucial na comunicação intercelular, regulando, assim, muitos processos biológicos5,10. Por causa de seu tamanho pequeno, de encontrar uma maneira fácil de analisar EV usando clássica fluxo cytometry (FC) permanece uma tarefa desafiadora.

Aqui, apresentamos um protocolo simplificado para análise de EV usando FC, que pode ser aplicado em pré-enriquecidas amostras obtidas através de ultracentrifugação ou diretamente em CM (Figura 1). O método usa pérolas revestidas com anticorpo específico que se liga canônicos epitopos superfície Exo-associados (CD63, CD9, CD81) sem lavagens adicionais. Análises FC podem ser realizadas usando um citômetro convencional sem necessidade de ajustes antes da medição. Métodos para a caracterização dos antígenos em partículas pequenas individuais usando citômetros têm sido descritos por outros grupos no que diz respeito a várias aplicações11,12,13. Aqui, usamos funcionalizados grânulos magnéticos para a captura de partículas pequenas e Exo, seguido por fenotipagem de partículas capturadas pelo FC. Embora esse método pode ser usado para caracterizar a composição antigênica de pequenas vesículas lançado por qualquer tipo de células in vitro, aqui nós fornecemos condições de cultura de células específicas que se aplicam para a cultura de células progenitoras cardíacas humanas (CPC) e a maioria ambiente adequado para a produção de EV por essas células.

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Protocolo

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1. coleta e processamento de mídia condicionado

  1. Casaco 55 cm2 placas de Petri com gelatina de pele suína 0,02% em PBS.
  2. Placa CPC (8.000/cm2) em pratos revestidos com 7 mL de modificado Dulbecco do Iscove médio (IMDM) suplementado com 20% FBS (soro Fetal bovino) e 1% penicilina/estreptomicina (P/S).
    Nota: O termo "CPC" refere-se a células do explante humana derivada que têm sido descritos em outros lugares14. CM pode ser coletada de diferentes tipos de células cultivados em condições de cultura específica. Usar luvas e sob uma capa biológica.
  3. Uma vez que as células alcançar sobre 80% confluência, remover o meio de cultura, lave duas vezes com a Dulbecco PBS (PBS) Ca e Mg-livre de células e substituí-lo com 10 mL de meio de Exo-produção livre de soro (modificado águia de Dulbecco médio [DMEM] alta glicose, 4,5 g/mL).
    Nota: Prosseguir com uma progressiva diminuição da concentração de soro em meio de cultura, adaptar-se gradualmente as células a condição livre de soro (SF). Para as células que são sensíveis ao meio livre de soro prepare um suporte contendo FBS mas empobrecido de EV. Prepare suplementado com todos os nutrientes, além de 10 – 20% (v/v) FBS. Centrifugue o meio durante a noite a 100.000 × g, 4 ° C. Esteja ciente de que este procedimento não garante 100% de remoção de EV FBS-derivado.
  4. Após 7 dias, recolha a CM em um tubos de centrífuga de polipropileno.
    Nota: O tempo para o condicionamento médio depende do tipo de célula. Para as células que são sensíveis ao meio livre de soro, aumentar o volume inicial de meio e diminuir o tempo para coleta CM de 24-48 h.
  5. Clear CM de detritos de células por centrifugação a 3.000 x g por 20 min 4 e 10 ° c. Recolha o sobrenadante em um tubo de filtro de centrifugação kDa 100.
  6. Concentre-se desmarcada CM, girando o tubo a 2.000 x g por 20 min 4 e 10 ° c.
    Nota: Esta etapa irá reduzir o volume inicial do CM, permitindo a utilização de tubos de pequeno volume para etapas de centrifugação de alta velocidade e contribuirá para eliminar os agregados de pequenas proteínas.
  7. Recolha o concentrado em um tubo de microcentrifugadora. Centrifugar a 10.000 x g por 15 min 4 e 10 ° c.
  8. Recolher o sobrenadante e prossiga para a seção 2 (enriquecimento EV). Se não houver um se passar directamente à secção 3 (quantificação de análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)).
    Nota: Pré-enriquecimento da fração EV melhora a leitura final da intensidade de fluorescência (ver resultados representativos e Figura 4). Apuradas CM (do ponto 1.8) pode ser armazenada a 4 ° C para não mais então 1-2 dias ou, alternativamente, −80 ° C durante vários meses. 5 CM deve ser previamente limpo para remover quaisquer restos celulares antes do armazenamento a-80 ° C para assegurar que os restos exossomo de tamanho não é formado no processo de congelamento e descongelamento.

2. extracelular vesículas enriquecimento por se (opcional)

  1. O sobrenadante do passo 1.8 num tubo policarbonato espessura parede se de lugar. Encha o tubo com solução salina tampão de fosfato (PBS) de 1x até atingir a capacidade máxima (3,2 mL).
  2. Carregar amostras em um rotor de ângulo fixo de titânio (8 x 3,2 mL, fator k-13). Carrega o rotor em uma mesa se. Se a 100.000 x g durante 3 h 4 e 10 ° c.
  3. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 100 µ l de 1X PBS.

3. nanopartículas rastreamento quantificação de análise (NTA)

  1. Dilua 1 µ l de amostra (a partir de qualquer etapa 2.3 ou 1.8) em 999 µ l de PBS 1x. Carrega a amostra em uma seringa de 1 mL, evitando a formação de bolhas. Carrega a seringa na porta de entrada da câmara do exame.
  2. Ligue o laser. Abra a câmera com o botão de captura . Ajuste o foco.
  3. Gravar pelo menos 3 diferentes quadros de 60 s cada.
  4. Analise as 3 aquisições diferentes usando a opção de Processamento em lote no software.
    Nota: Se a tecnologia NAT não estiver disponível, execute uma quantificação da proteína pelo ensaio de Bradford (1 x 108 partículas correspondem a 1-2 µ g da proteína total após ultracentrifugação ou a 50 – 60 µ g proteína total se quantificação é realizada diretamente para CM como Ele inclui os contaminantes de proteínas diferentes de EV; consulte a tabela 1)5.

4. preparação da amostra

  1. Preparar um pool dos 3 tipos de grânulos de captura (CD9 grânulos, grânulos CD63 e CD81 grânulos em um 1: proporção 1:1; Ver Tabela de materiais) e vortex.
    Nota: A piscina foi testada para ser estável por 1 mês. Pode ser utilizado um único tipo de captura do grânulo, isto irá permitir a detecção de sub-populações EV não discriminable com piscina de grânulos. Usando o único antígeno capturando grânulos, será possível ao comtemporâneo demonstrar a presença de proteínas tetraspaninas, como CD9, CD81 ou CD63, e o antígeno de interesse detectado pelo anticorpo fluorescente. Grânulos de látex alternativa aldeído-sulfato também estão disponíveis comercialmente. Estes grânulos apresentam superfície hidrofóbica para a adsorção de MV e EV.
  2. Em um tubo de fundo redondo, adicione a quantidade de volume correspondente a 1 x 108 partículas mais 1 µ l da piscina do grânulo, correspondente a 1,2 x 105 grânulos no total (para cada teste).
  3. Prepare um tubo contendo 1 µ l de grânulos sem EV que servirá como controle negativo, por este meio se refere como "Beads".
  4. Ajuste o volume a 100 µ l com 1X PBS. Colocar o tubo em um thermo-misturador e agitar a 400 rpm durante a noite a 4 – 10 ° C.
  5. No dia seguinte, mova as amostras para uma placa de 96 poços de fundo redondo (ou tubos FC).
  6. Adicione o anticorpo (10 µ g/mL de CD9_FITC, 10 µ g/mL de CD63_PE e 5 µ g/mL de CD81_PE).
  7. Incubar a 1h 4 e 10 ° c.
  8. Adicione 100 µ l de 1X PBS a cada poço.
  9. Proceda à aquisição.

5. aquisição

  1. Abra o software de aquisição e start-up do instrumento (citômetro > programa de inicialização de sistema). Abra uma nova experiência.
  2. Criar um modelo experimental, em seguida, selecione a placa e, em seguida, Adicionar a placa. Selecione a posição das amostras na placa e pressione Definir como amostra bem.
  3. Digite o nome de amostra (ou seja, o CPC #1_CD9FITC) nas Regras de nomenclatura. Abra a guia de canal e ligue o FITC e canais de PE.
  4. Carrega a placa no instrumento.
  5. Pressione Dot Plot e criar uma nova parcela de ponto (P1). Conjunto para a frente área de dispersão (FSC-A) versus dispersão-área lateral (SSC-A).
  6. Selecione inicializar para iniciar o laser e o fluidics. Pressione adquirir para iniciar a aquisição.
  7. Ajuste a escala para mostrar a população no meio do P1. Em P1 desenhar o portão "BEADS" em torno de toda a população (excluindo os detritos) (Figura 2A). Pressione parar.
  8. Pressione Dot Plot e criar uma nova parcela de ponto (P2). Conjunto para a frente Scatter-altura (FSC-H) versus FSC-A. Portão a nova trama do ponto na "BEADS". Em P2 desenhar um novo portão próximo a maior população e o nome "Camisolas" (Figura 2A).
    Nota: Esta estratégia é projetada para evitar, tanto quanto possível a inclusão de agregados de grânulos em etapas tanto a aquisição e a análise.
  9. Pressione Dot Plot e criar dois lotes do ponto diferente; um FITC contra SSC-A e um PE contra SSC-A. Portão a nova trama do ponto na "Camisolas".
  10. Selecione o número de eventos para gravar (por exemplo, 20.000). Selecione o registro e começar o experimento.

6. análise de dados

  1. Carrega os arquivos de aquisição para o software de análise.
    Nota: As etapas a seguir tem que ser aplicado para cada amostra, incluindo contas apenas e cada amostra desconhecida.
  2. Abrir um novo protocolo e criar lotes do ponto seguindo a mesma estratégia descrita na etapa 5.
  3. Defina todos os eixos de dispersão em escala linear e todos os eixos de fluorescência para escala de log.
  4. Mostre a média geométrica de fluorescência (X-Gmean-IFM) em canais FITC e PE.
  5. Calcular a relação X-Gdizer das amostras / X-Gdizer dos grânulos corados com anticorpo sem exossomo.
  6. Compare a mudança de dobra das IFM de diferentes preparações de EV.

7. extracelular vesículas número titulação

Nota: 7 a 10 de seções pode ser realizada para definir o número de partículas, a concentração de anticorpos e a especificidade, mas pode ser ignorada se o tipo de célula, da qual derivam-se EV, e anticorpos permanecem os mesmos.

  1. Dilua as partículas, obtidas de passo 2.3, em 1X PBS para obter uma série de suspensões que variam de 5 x 105 a 2,5 x 108 partículas.
  2. Para cada suspensão adicione em um tubo de fundo redondo 1 µ l de piscina de grânulo de captura.
  3. Siga o protocolo do passo 4.3.

8. titulação de anticorpos

Nota: Titulação de anticorpos geralmente é realizada pela adição de um único anticorpo para cada tubo.

  1. Manter o número de EV (partícula total ou conteúdo de proteína) constante em todas as amostras.
    Nota: O número apropriado é determinado empiricamente como descrito acima na seção 7.
  2. Siga o protocolo de etapas 4.1 a 4.5.
  3. Teste uma gama de concentrações de anticorpos acima e abaixo a quantidade recomendada pelo fornecedor. Por exemplo, para um anticorpo com uma concentração sugerido de 10 µ g/mL por teste, teste 1, 2, 5, 10, 20 e 50 µ g/mL. Inclua uma amostra com "somente contas", adicionando a maior concentração de anticorpos.
  4. Incubar durante 1 h a 4 – 10 ° C.
  5. Adicione 100 µ l de 1X PBS para cada amostra.
  6. Adquira as amostras.

9. tempo de incubação

  1. Verificar o tempo de incubação realizar aquisições em pontos de tempo diferente (por exemplo, 1h, 2h e 5h).
  2. Siga o protocolo a partir da seção 4.
  3. Incube as amostras 4 – 10 ° c por 1h.
  4. Adquira as amostras.
  5. Incube as amostras 4 – 10 ° c por 3 h.
  6. Adquira as amostras.

10. protocolo validação

  1. Vinculação de EV
    1. Em um tubo de fundo redondo, adicione a quantidade de volume correspondente a 1 x 108 partículas ou a quantidade correspondente de proteínas totais.
    2. Ajuste o volume a 100 µ l com 1X PBS.
    3. Romper a membrana de EV por sonication (alternativamente um passo de choque do calor pode ser aplicado) de acordo com as instruções do fabricante. Definir a frequência e intensidade. O período de sonication pode ser estabelecido empiricamente definindo um experimento de tempo-curso (ou seja, 0 s, 30 s, 1 min, 5 min, etc.).
    4. Adicione 1 µ l da piscina do grânulo.
    5. Siga o protocolo a partir de passo 4.4.
  2. Especificidade do anticorpo
    1. Prepare um tubo para cada fluorocromo-Conjugado IgG e adicionar o complexo de grânulos-EV, conforme descrito na etapa 4.6.
      Nota: O isotipo conjugados a fluorocromo deve corresponder com o IgG do anticorpo usado.

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Resultados

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Número total de partículas para a coloração única

Desde um único talão pode vincular mais de uma partícula, testamos diferentes condições para definir a menor quantidade de total EV (único anticorpo por tubo) para alcançar a fase adiantada exponencial da curva de IFM. Uma concentração fixa de anticorpo foi usada enquanto o número total de partículas variou de 5 x 105 a 2,5 x 108. Como mostr...

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Discussão

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Técnica convencional de FC continua a ser o mais simples método analítico para caracterizar marcadores expressados na superfície do EV. A este respeito, selecionar o protocolo mais apropriado é fundamental para obter informações úteis sobre frações de partículas individuais de interesse, evitando limitações devido a sensibilidade do instrumento. Nós descrevemos um método usando partículas magnéticas juntamente com anticorpos que reconhecem a Exo e pequeno EV antígenos de superfície que são apropriados para a aplicação de...

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Divulgações

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Nada a declarar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L.B. foi apoiado por bolsas de investigação de Helmut Horten Stiftung e Velux Stiftung, Zurique (Suíça). G.V. foi apoiado por bolsas de investigação da Swiss National Science Foundation, Fundação Cecilia-Augusta, Lugano e o SHK Stiftung für Herz-und Kreislaufkrankheiten (Suíça)

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
IMDMGibco12440061
Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100  kDa MilliporeUFC910024
CytoFlex, plataforma de citômetro de fluxoBeckman CoulterCytoFlex
DMEM, glicose alta, HEPES, sem vermelho de fenolGibco21063045
Dulbecco's PBS (PBS)LonzaBE17-512F
ExoCap CD63JSR Life SciencesEx-C63-SP
ExoCap CD81 Capture KitJSR Life SciencesEx-C81-SP
ExoCap CD9 Kit de CapturaJSR Life SciencesEx-C9-SP
FBS Empobrecido por ExossomoThermofisherA2720801
Suplemento de Mídia FBS Empobrecido com ExossomoSBIEXO-FBS-250A-1
FBS-Soro Bovino FetalGibco10270106
FITC anticorpo CD9 humanoBiolegend312104                    RRID: AB_2075894
Software de análise de citômetro de fluxoBeckman CoulterKaluza
NanoSight LM10MalvernNanoSight LM10
Software NanoSightMalvernNTA 2.3
Optima Max-XPBeckman Coulter393315
PE anticorpo CD63 humanoBiolegend353004                    RRID:AB_10897809
PE anti-CD81 humano (TAPA-1) AnticorpoBiolegend349505                    RRID: AB_10642024
Penicilina-EstreptomicinaGibco15140122
Thermomixer CEppendorf5382 000 015
TLA-110Beckman CoulterTLA-110 rotores
Kit de captura sem Ca e Mg

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacology & Therapeutics. , (2017).
  2. Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. Molecular Biology Reports. 3, 15(2011).
  3. Yadav, D. K., et al. Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era. Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).
  4. Balbi, C., et al. First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential. Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).
  5. Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, (2018).
  6. Lai, R. C., et al. Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury. Stem Cell Research. 4, (2009).
  7. Doeppner, T. R., et al. Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).
  8. Kordelas, L., et al. MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease. Leukemia. 28, 970-973 (2014).
  9. Barile, L., et al. Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).
  10. Longatti, A., et al. High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).
  11. Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  12. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
  13. Arakelyan, A., et al. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  14. Chimenti, I., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts. Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).
  15. van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).
  16. Pospichalova, V., et al. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530(2015).
  17. van der Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).
  18. Witwer, K. W., et al. Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823(2017).
  19. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cellular Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
  20. Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7, 11271(2017).
  21. Sodar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports. 6, 24316(2016).
  22. Sluijter, J. P. G., et al. Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).

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