Aqui, nós apresentamos um protocolo para criar um modelo murino imuno-competente do ICR (Instituto do cancer da pesquisa) da infecção do sistema nervoso central para indicar o desenvolvimento da neuropatia. A monitoração de desordens encefalalitic virais agudas por contagens idênticas da doença podia ser executada mostrando a neuropatia vírus-induzida dengue in vivo.
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Artigo de método
Um modelo murino da doença da encefalite viral aguda induzida pelo vírus da dengue
Neste artigo
Resumo
Resumo
O vírus da dengue (DENV), um vírus transmitida por artrópodes transmitido por mosquitos, pode causar a doença grave conhecida como febre hemorrágica da dengue, que é caracterizada por complicações letais devido ao vazamento de plasma, ascite, derrame pleural, desconforto respiratório, hemorragia grave e comprometimento de órgãos. Alguns casos de infecção por DENV apresentam manifestações neurológicas; Entretanto, os estudos não exploraram mais a neuropatogénese DENV-induzida. Neste estudo, nós apresentamos um protocolo para usar um camundongo imunocompetente de ICR (Instituto de pesquisa do cancer) para investigar a indução da infecção do sistema nervoso central (CNS) com o DENV, seguido pela progressão da encefalite viral aguda-como Doença.
Introdução
O DENV, um vírus transmitido por artrópodes da família Flaviviridae , contém um GENOMA de RNA de sentido positivo que codifica três proteínas estruturais virais (capsídeo, pré-membrana e envelope) e sete proteínas não estruturais virais (ns1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B , e NS5). Os quatro sorotipos de DENV (DENV1-4), que infectam aproximadamente 390 milhões povos anualmente, causam uma carga global mesmo que os governos tenham dirigido esforços substanciais para o vetor do mosquito e o controle da doença1. Atualmente, vacinas protetoras e medicamentos antivirais terapêuticos estão em desenvolvimento e exigem mais validação a longo prazo2. Na prática clínica, embora um paciente com dengue com infecção do SNC seja raro, precisa ser mais explorado para compreender a diversidade do desenvolvimento da doença da dengue3. São necessárias mais investigações e validação; notavelmente, a Organização Mundial de saúde (OMS) incluiu o comprometimento do comprometimento do SNC, como comprometimento cognitivo, convulsões, encefalopatia e encefalite, na classificação da dengue grave3,4. Construir modelos animais da infecção de DENV é indispensável para explorar a neuropatogénese da infecção de DENV.
Para a geração de infecção do SNC por DENV, vários estudos têm executado diferentes vias de infecção por DENV, incluindo (1) inoculação intracerebral de camundongos C57BL/6 que receberam 4 x 103 unidades formadoras de placas (Pfu) de DENV35, 6, (2) inoculação intraperitoneal de camundongos Balb/c que receberam 7 x 104 Pfu de in vitro neuroadaptados DENV47, (3) inoculação intracerebral de camundongos suíços que receberam 1 x 105 Pfu de in vivo neuroadaptado DENV18, e (4) coinoculação intracerebral e intraperitoneal de camundongos amamentando ICR que receberam 1 x 106 Pfu de DENV29. De acordo com os achados desses estudos5,6,7,8,9, a infecção por DENV em camundongos resulta em replicação viral no cérebro, levando a infecções virais agudas encefalite-como síndromes, mudanças comportáveis acompanhadas da paralisia do membro e da instabilidade postural, do neurotoxicidade e da inflamação do CNS, do escapamento geral e localizado do plasma através da barreira do sangue-cérebro (BBB), e da letalidade. Todos os resultados destes estudos5,6,7,8,9 mostraram a capacidade de DENV para infectar o CNS e a indução de encefalite viral aguda-como doença após a infecção.
Com base em nossos achados atuais9,10,11,12,13,14,15, criamos um modelo murino de infecção por DENV como um in vivo plataforma para examinar a eficácia terapêutica de agentes/fatores alvejados de encontro à replicação viral, assim como a neurotoxicidade. Aqui, nós relatamos o protocolo utilizado para criar um rato exogâmica imuno-competente de ICR para estudar a infecção do CNS e para monitorar o desenvolvimento dos neuropatias com severties diferentes causados por DENV. Os resultados mostram a progressão significativa da encefalite-como a doença em ratos DENV-contaminados em uma maneira tempo-dependente.
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Protocolo
Protocolos experimentais de estudo animal foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado animal e usuário do centro médico de defesa nacional (número IACUC: 16-261), de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Ministério da ciência e tecnologia, Taiwan.
1. procedimento de infecção
- Prepare os estoques DENV2 (Strain PL046) não adaptados9 (originalmente obtidos dos centros de controle de doenças em Taiwan, variando de 2,5 x 107 a 1 x 109 pfu/ml).
- Diluir o estoque de vírus para 1 x 106 Pfu com Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 médio para um volume total de 40 μl.
- Encha uma seringa de 0,3 mL equipada com uma agulha de 30 G com 10 μL (2,5 x 105 Pfu) de vírus diluído e encha outra seringa de 0,3 ml equipada com uma agulha de 30 g com 30 μl (7,5 x 105 Pfu) de vírus diluído.
-
Segure o 7 dia-velho ICR Leitão mouse e realizar os seguintes passos.
- Para a injeção intracerebral, segure o mouse em uma posição propensa pressionando a aurícula entre o dedo indicador e o polegar, e injetar intracerebralmente 10 μL de vírus diluído na área lambda, o ponto na interseção da sutura sagital e lambdóide a 16.
- Após a injeção intracerebral, segure o mouse em uma posição supina usando o dedo indicador e o polegar e injete intraperitonealmente 30 μL de vírus diluído suavemente no murino abdomenl.
Nota: para evitar o canibalismo, 75% álcool é usado para criar uma perda temporária da sensação olfativa da mãe. Adicionalmente, cobrindo as ninhadas com fezes de sua mãe e urina é sugerido.
- Coloque os ratos de sucção de volta em suas gaiolas e aguarde 5 minutos para verificar a sua segurança pós-estimulação com a avidez de camundongos, incluindo a caminhada e sucção do leite materno.
Nota: Na maioria das vezes, camundongos demonstram atividade normal pós-estimulação e não parece haver quaisquer efeitos nocivos após o desafio técnico. Durante este experimento, os animais foram mantidos pelo Comitê institucional de cuidado animal e usuário do centro médico de defesa nacional, Taiwan. - Avaliar o progresso diário dos camundongos em termos de peso corporal (usando um balanço de micrograma), doença viral aguda como encefalite (por escore de doença conforme descrito na seção 2) e taxa de sobrevida9,10,11 ,12,13,14,15.
2. pontuação da doença
- Monitore a classe de doenças virais agudas da encefalite-como. Atribua uma pontuação de 0 a camundongos saudáveis; 1 a camundongos com sintomas de doença menor, incluindo perda de peso, mobilidade reduzida e orientação do corpo corcunda; 2 a camundongos que exibem apreensão límbica; 3 a camundongos exibem fraqueza límbica, incluindo movimentação com dificuldade e fraqueza do membro anterior ou membro posterior; 4 para paralisia; 5 para a morte.
Nota: Uma vez que a pontuação atinge 3, os sintomas da doença são considerados evoluir rapidamente. - Traçar a pontuação da doença, de acordo com a etapa 2,1, para cada dia como uma figura baseada em curva usando a média ± DP dos escores de teste diários em cada grupo.
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Resultados
As complicações neurológicas dengue-associadas severas foram relatadas nos pacientes para a patogénese4da dengue. Embora estes casos sejam raros na clínica, criar um modelo murino imuno-competente da infecção de DENV pode ser usado não somente para estudar o imunopatogênese mas igualmente para explorar a infecção do CNS, o neuroinflammation, a neurotoxicidade, e o viral agudo encefalite-como a doença. Neste estudo, de acordo com nosso modelo atual...
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Discussão
A infecção por DENV tem sido detectada no SNC de pacientes com dengue grave3,17, sugerindo a possibilidade de manifestação de encefalite viral aguda ocorrida durante a patogênese da dengue. Aqui, nós relatamos um modelo in vivo murino da infecção de DENV para estudar a participação da deficiência orgânica do CNS na dengue severa, particular com um foco em doenças virais agudas DENV-induzidas da encefalite-como. Em comparação com os modelos precedentes, particular...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado por subvenções do Ministério da ciência e tecnologia (MOST107-2321-B-038-001) e o financiamento intramural 106TMU-CIT-01-2, Taipei, Taiwan.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) | Gibco | 11875-085 | Vírus Diluente |
| 0.3 mL Seringa de Insulina | BD Ultra-FineII | 328838 | Injeção intracerebral e intraperitoneal |
| Microbalança | Camundongo de peso | AL104 | METTLER TOLEDO |
| DENV2 não adaptado (cepa PL046) | Os Centros de Controle de Doenças de | Taiwan-Infectar | camundongo |
| Instituto de Pesquisa do Câncer (ICR) camundongo lactante | BioLASCO Taiwan Co., | Ltd-Nosso | modelo murino |
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Reimpressões e permissões
