Sideróforo elevado-throughput Screening de amostras ambientais: tecidos, Bulk solos e solos de rizosfera de plantas

Resumo

Apresentamos um protocolo para a seleção rápida de amostras ambientais para Sideróforo potencial, contribuindo para a biodisponibilidade de micronutrientes e volume de negócios em sistemas terrestres.

Resumo

Sideróforos (metal de peso molecular baixo quelantes compostos) são importantes em vários fenômeno ecológico variando de ferro (Fe) biogeoquímicos Ciclismo nos solos, a concorrência do patógeno, promoção de crescimento de planta e Cruz-Reino de sinalização. Além disso, sideróforos são também de interesse comercial em bioleaching e bioweathering de metais, minerais e minérios. Um meio rápido, custo-eficaz e robusto de avaliar quantitativamente a produção Sideróforo em amostras complexas é a chave para identificar aspectos importantes das ramificações ecológicas de atividade Sideróforo, incluindo, romance Sideróforo produzindo micróbios. O método aqui apresentado foi desenvolvido para avaliar a atividade Sideróforo no tato microbiome comunidades, em amostras ambientais, tais como tecidos de solo ou planta. As amostras foram homogeneizadas e diluídas em meio M9 modificado (sem fé), e culturas de enriquecimento foram incubadas por 3 dias. Produção de Sideróforo foi avaliada em amostras em 24, 48 e 72 horas (h) usando uma romance microplacas de 96 poços CAS (cromo azurol sulfonato)-ensaio de ágar de Fe, uma adaptação do método colorimétrico tradicionalmente tedioso e demorado de avaliação Sideróforo atividade, realizada em individuais isolados microbianos cultivados. Aplicamos o nosso método de 4 diferentes genótipos/linhas de trigo (Triticum aestivum L.), incluindo Lewjain, Madsen e PI561725 e PI561727 comumente cultivada no interior do noroeste do Pacífico. Produção Sideróforo claramente foi impactada pelo genótipo de trigo e em tipos específicos de tecidos vegetais observados. Temos utilizado com sucesso nosso método para a tela rapidamente para a influência do genótipo da planta na produção de Sideróforo, uma função fundamental nos ecossistemas terrestres e aquáticos. Nós produzimos muitas repetições de técnicas, gerando diferenças estatísticas muito confiáveis em solos e em tecidos vegetais. Importante, os resultados mostram que o método proposto pode ser usado para examinar rapidamente a produção Sideróforo em amostras complexas com um alto grau de confiabilidade, de uma forma que permite que as comunidades a ser preservado para posterior trabalho de identificar genes funcionais e táxons.

Introdução

Sideróforos são biomoléculas importantes envolvidos principalmente na quelação de ferro para a biodisponibilidade, mas com uma grande variedade de efeitos adicionais nos ecossistemas terrestres e aquáticos, variando de quórum microbiana sensoriamento, sinalizando a planta microbianas-hosts, promoção de crescimento de planta, cooperação e competição dentro de comunidades microbianas complexas^1,2. Sideróforos podem ser classificados de acordo com seus sites ativos e características estruturais, criando quatro tipos básicos: carboxilato, hydroxamate, catecholate e misturado tipos^3,4. Muitos microorganismos são capazes de excretar mais de um tipo de Sideróforo⁵ e nas comunidades do complexas, uma grande maioria dos organismos biossintetize os receptores de membrana para permitir a absorção de uma variedade ainda maior de sideróforos^{1, 6}. Trabalho recente indica que sideróforos são particularmente importantes a nível comunitário e mesmo no Reino inter comunicação e transferências biogeoquímicos^{7,8,9,10 ,11}.

Cromo azurol sulfonato (CAS) tem sido utilizado por mais de 30 anos como um agente quelante para ligar o ferro (Fe) de tal forma que a adição de ligantes (i.e., sideróforos) pode resultar em dissociação do complexo Fe-CAS, criando uma mudança de cor facilmente identificáveis no meio ¹². quando o CAS está vinculado com o Fe, o corante aparece como uma cor azul royal, e como o complexo de CAS-Fe dissocia-se, o médio muda de cor de acordo com o tipo de ligante usado para eliminar a Fe¹³. O inicial, baseada em líquido médio estabelecido por Romualdo Silva e Neilands em 1987, foi modificado de várias maneiras para acomodar a alteração microbiana alvos¹⁴, hábitos de crescimento e limitações¹⁵, bem como uma variedade de metais além do Fe, incluindo alumínio, manganês, cobalto, níquel cádmio, lítio, zinco¹⁶, cobre¹⁷e nem arsênico¹⁸.

Muitos patógenos humanos, também como planta microorganismos promotores de crescimento (PGPM) foram identificados como organismos produtores de Sideróforo^3,19,20e importante rizosfera e endofíticos PGPM frequentemente testar positivo para Sideróforo-produção⁴. O tradicional método de líquido baseado em Fe foi adaptado para microtitulação testes de isolados no cultivo para produção de Sideróforo²¹. No entanto, essas técnicas não reconhecem a importância da comunidade microbiana como um todo (o microbiome), em cooperação e Regulamento potencial de produção de Sideróforo no solo e planta sistemas²². Por esse motivo, nós desenvolvemos uma avaliação de nível comunitário alto rendimento de produção Sideróforo de um determinado ambiente, com base no ensaio CAS tradicional, mas com replicação, facilidade de medição, confiabilidade e repetibilidade em uma microplaca do ensaio.

Neste estudo, um ensaio CAS-Fe custo-benefício, alta produtividade para a detecção de produção Sideróforo é apresentado para avaliar o enriquecimento da produção Sideróforo de amostras complexas (ou seja, solo e planta homogenates de tecido). Solo da rizosfera granel, frouxamente ligados e firmemente ligados (em termos de como o solo era vinculado à raiz) foram obtidos juntamente com o grão, atirar e tecidos de raiz de quatro genótipos distintos trigo (Triticum aestivum L.): Lewjain, Madsen, PI561725, e PI561727. Foi hipotetisado que diferenças fundamentais em genótipos de trigo podem resultar em diferenças no recrutamento e selecção de Sideróforo produzindo comunidades. De particular interesse é a diferença entre as comunidades microbianas associadas com a linha isogénicas de PI561725, que é de alumínio tolerante porque possui ALMT1 (alumínio-ativado 1 transportador malato), comparada com o alumínio sensível PI561727 isogénicas linha, que possui uma forma de alumínio não responsiva do gene, almt1^23,24,25,26. O principal objetivo do estudo foi desenvolver um método simples, rápido de avaliar quantitativamente a produção Sideróforo em culturas de enriquecimento Sideróforo de tipos de amostras complexas, preservando as culturas para trabalhos futuros.

Protocolo

Nota: Localização do campo local: Universidade do estado de Washington, a fazenda de patologia de plantas (46 ° 46' 38,0" N 117 ° 04' 57,4" W). As sementes foram semeadas usando um plantador de mecânico em 19 de outubro de 2017. Cada genótipo de trigo foi plantado em headrows, aproximadamente 1 medidor distante para evitar a sobreposição do sistema radicular. Amostras de solo e planta foram coletadas em 9 de agosto de 2018, quando as plantas estavam prontas para a colheita. Amostras foram coletadas de três repetições de quatro genótipos de trigo: PI561727, PI561725, Madsen, Lewjain.

1. preparação do meio modificado de M9

1. Uso at₂PO₄∙7H₂O (12,8 g/200 mL), KH₂PO₄ (0,3 g/200 mL), NaCl (0,5 g/200 mL) e NH₄Cl (1G/20ml) reagentes para preparar a solução de sal de M9.
2. Use 18 g de MgSO₄∙7H₂O em 100 mL de água desionizada dupla (ddH₂O) para preparar 0,75 M MgSO₄∙7H₂O.
3. Fazer 1 M de CaCl₂∙2H₂O adicionando 14,7 g de CaCl₂∙2H₂O com 100 mL de DDQ₂O.
4. Prepare a solução-tampão, dissolvendo 6,048 g de tubulações em 156 mL de DDQ₂O agitando. Ajuste o pH para 6,8 com 5 M de NaOH.
5. Prepare-se 20% de glicose (dextrose monohidrato) dissolvendo-se 20g de glicose em 100 mL de DDQ₂O.
6. Prepare soluções e individualmente autoclave todos mas a glicose. Filtro de esterilizar a solução de glicose para adição à mídia M9 após autoclavagem (0,22 µm).
7. Preparar o meio modificado de M9 misturando 156 mL de solução-tampão de tubulações, 40 mL de solução de sais M9, 20 μL de solução de₂O CaCl₂·2H e 266 μL de MgSO₄·7H₂O 4 mL de soluções de glicose 20% juntos na biossegurança armário, usando uma técnica estéril.
8. Para preservação do M9 modificada, sele o recipiente, cobrir com papel alumínio para proteger de UV e colocar a 4 ° C.

2. preparação de CAS-Fe-ágar-ágar

1. Ácido lavar todos os copos em 100mm HCl/100 mM HNO₃ por um período mínimo de 2 h antes da utilização no ensaio CAS.
2. Prepare uma assadeira de alumínio preenchida com areia de grau de laboratório e cubra com papel alumínio. Autoclave a 121 ° C por 30 min e reserve.
3. Prepare HDTMA (brometo de hexadeciltrimetilamónio), acrescentando 0,0365 g de 20ml ddH₂O e colocar a solução a 37 ° C, para promover a solubilização.
4. Preparar 10 mM HCl e gerar 1 mM FeCl₃·6H₂O uso do HCl de 10 milímetros como solvente. Adicione 0,0302 g de CAS para 25 mL de DDQ₂O agitando suavemente com uma barra de agitação magnética estéril. Em seguida, adicione 5 mL de 1 mM FeCl₃·6H₂O (em HCl de 10 milímetros) para os 25 mL de solução de CAS, continuando a agitar suavemente (a solução transforma cor preto avermelhado escuro).
5. Adicione lentamente a 20 mL de solução HDTMA, agitando suavemente, para a solução de Fe-CAS (isso resulta em uma solução azul escura).
6. Prepare a solução-tampão, dissolvendo 15,12 g de tubulações em 375 mL de DDQ₂O, com agitação suave. Ajuste o pH para 6,8 com 5 M de NaOH. Adicione água para o volume para 450 mL. Adicione 5 g de agarose para a solução. Autoclave os tubos buffer de solução e a solução CAS-Fe a 121 ° C por 30 min.
7. Cuidadosamente, adicione a totalidade da solução CAS-Fe para a totalidade da reserva no armário a biossegurança tubos após cada um deles é esterilizado.
8. Coloque a solução mista em um banho de água a 50 ° C.
   Nota: Recentemente prepara todos os reagentes no meio de ágar-CAS-Fe antes de cada ensaio, como o armazenamento a longo prazo em 50 ° C resulta na precipitação dos resultados complexos e resfriamento CAS-Fe em meio solidificado.
9. Coloque um barco de reagente estéril na areia estéril no armário a biossegurança e calor de 50 ° C. Transferi o CAS-Fe-Agar para o barco e, em seguida, rapidamente alíquota 100 µ l de cada poço em uma microplaca de 96 poços claro, fundo plano, estéril.

3. preparação-padrão Pyoverdine/EDTA

1. Preparação do Pyoverdine
   1. Preparar 800 μM pyoverdine padrão (mistura de ácido succínico, 2-hidroxi-glutaramide e succinaminde formas de pyoverdine – consulte Tabela de materiais), em meio de M9 modificado previamente preparado.
   2. Dilua esta solução para 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 e 6,25 soluções μM.
2. Preparação padrão de EDTA
   1. Adicionar 0,594 g de ácido etilenodiaminotetracético de dissódico (EDTA: C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈.2h₂O), a 500 mL de meio de M9 modificado previamente preparado para preparar 3200 μM EDTA padrão.
   2. Diluir esta solução para 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 e 6,25 soluções μM.
3. Geração da curva padrão
   1. Adicione 100 μL de cada concentração de pyoverdine e EDTA para separar poços de uma microplaca de 96 poços contendo 100 μL de CAS-Fe do ágar. Fazer duplicadas replicações técnicas de cada concentração. Também, adicionar poços em branco com apenas M9 (sem EDTA ou pyoverdine).
   2. Usando um leitor de microplacas, medir a absorvância (a 420 nm e 665 nm) após incubação de 1, 6 e 24 h a 22 ° C e medidas de absorvância uso para gerar curvas padrão.
      Nota: Para medições de 420 nm, subtrai a absorvância de espaços em branco da absorvância do pyoverdine ou poços contendo EDTA. Para 665 nm, subtrair a absorvância do pyoverdine ou EDTA contendo poços de absorvância de espaços em branco. Em seguida, log₁₀(pyoverdine µM ou EDTA) é regredido contra as medidas de absorvância. Para facilitar a interpretação dos resultados de exemplo, use a absorvância como o eixo x e log₁₀(pyoverdine µM ou EDTA) como o eixo y.

4. coleta de amostras ambientais: tecidos de solo e planta

1. Lavar o equipamento de amostragem (pás e tesouras) com 0,22 µm filtrada ddH₂O seguido por 70% de etanol e limpe com papel toalha antes da amostragem e entre as amostras para manter uma técnica estéril e reduzir a contaminação.
2. Impostos especiais de consumo os tecidos vegetais (grãos e brotos) de plantas no campo e colocá-los em um saco de armazenamento de plástico etiquetados, deixando bastante restolho de atirar para a facilidade no desenraizamento das amostras de solo e raiz desejadas.
3. Escavar uma raiz pequena bola aproximadamente 15 cm de profundidade e 23 cm de largura e coloque-o em um saco de plástico separado, etiquetado para preparação da amostra no ambiente de laboratório. Este passo é semelhante aos métodos de McPherson et al²⁷.
4. Coloque todas as amostras (grãos, brotos, em massa de solo e bolas de raiz em sacos separados) diretamente no gelo e manter a 4 ° C até que as amostras são processadas para o ensaio de produção Sideróforo.
5. Separar amostras de solo de raiz associado em granel, solo frouxamente ligados rizosfera e solo rizosfera firmemente ligados.
   1. Tire os sacos, as bolas de raiz. Agite delicadamente fora solo da esfera de raiz. Sacudido solo, juntamente com o solo, esquerda na bolsa compreende o solo "em massa".
   2. Use um martelo de borracha para remover ainda mais solo da esfera de raiz. Este é o solo da rizosfera frouxamente ligados.
   3. Gere o solo rizosfera firmemente ligados tomando raízes com a amostra firmemente ligados e colocá-los num tubo de centrífuga. Adicionar 30 mL de DDQ₂O e vórtice por 2-3 minutos. Remova as raízes para obter a diluição de chorume de solo rizosfera firmemente ligados.

5. preparação de culturas de enriquecimento Sideróforo e ensaio de produção Sideróforo CAS-Fe

Nota: Todos os produtos vidreiros devem ser ácido lavado antes de começar os ensaios.

1. Preparação da amostra de solo (para cada um dos tipos de amostra de solo de três)
   1. Homogeneizar a cada amostra de solo dentro do saco de amostra, misturando e passando o solo o máximo possível sem abrir o saco.
      Nota: Isto ajuda a reduzir a variabilidade espacial de solos naturais e alinha-se com os procedimentos de amostragem do solo normal. Outros métodos podem ser utilizados para homogeneizar amostras ambientais, conforme o caso e dependendo do projeto experimental.
   2. Depois de cada amostra foi completamente misturados, alíquota e suspender a 2,0 g de cada solo em 20 mL de meio de M9 modificado, então dilua 10^-3 para um volume total de 20 mL em um tubo de centrífuga de 50ml estéril com um plug de espuma estéril para permitir a aeração.
   3. Para amostras de rizosfera firmemente ligados, adicionar 2 mL de chorume de solo da rizosfera a 20 mL de meio de M9 modificado e, em seguida, diluir 10^-3 para um volume total de 20 mL em um tubo de centrífuga de 50ml estéril com um plug de espuma estéril para permitir a aeração.
2. Preparação da amostra (raiz, atirar e grãos) de tecido
   1. Superfície de esterilizar a amostra com etanol a 70%. Macerar a 2,0 g de tecido fresco em 20 mL de meio de M9 modificado usando um liquidificador em alta por 30 segundos. Transferir a amostra para um tubo de centrífuga de 50ml estéril e, em seguida, diluir 10^-3 para um volume total de 20 mL em um tubo de centrífuga de 50ml estéril com um plug de espuma estéril para permitir a aeração.
3. Enriquecimento da produção Sideróforo através da limitação de Fe
   1. Incubar os tubos de centrífuga de 50 mL à temperatura ambiente e agite a 160 rpm.

6. ensaios de ágar CAS-Fe para a deteção de produção Sideróforo em amostras ambientais

1. Em 24, 48 e 72 h após o início da cultura de enriquecimento, remova subamostras de 1 mL de tubos de enriquecimento usando uma técnica estéril e centrifugação a 10.000 x g por 1 min em tubos de centrífuga de 2 mL para peletizar as células.
2. Recolha o sobrenadante separado. Utilizando uma técnica estéril, adicione 100 μL do sobrenadante a solução 100 μL de CAS-Fe-ágar-ágar em duplicado ou triplicado na microplaca. Também Adicione 100 µ l de estéril M9 médio (como espaços em branco). Em seguida, incubar a placa a 28 ° C.
3. Suspenda o restante do sobrenadante e sedimento para cada amostra (não adicionado à placa de microtitulação) no tubo de centrífuga própria, estéril de 2 mL. Adicionar 400 μL de glicerol estéril em cada tubo de amostra-sobrenadante e ressuspender o precipitado para criar ações de glicerol. Congele o estoque a-80 ° C para posteriores análises.
   Nota: Este passo pode ser modificado para gerar ações de glicerol, de acordo com qualquer protocolo preferido em casa.
4. Medir a absorvância a 6, 24, 48 e 72 h, no comprimento de onda de 420 nm.
5. Use curvas padrão geradas a partir de pyoverdine ou EDTA para interpretar medidas de absorvância amostra em termos de pyoverdine equivalentes.
   Nota: Pyoverdine estava determinado a ser um padrão superior em comparação com EDTA (vide infra), então o EDTA não foi usado para interpretar os resultados no estudo atual.

Resultados

Um pyoverdine mistura biossintetizados por Pseudomonas fluorescens foi usado como um padrão para interpretar e quantificar a absorvância (a 420 nm) de amostras em termos de equivalentes de pyoverdine em µM. a Figura 1 mostra a relação entre absorbância (420 nm) e começando a concentração do pyoverdine (molaridade do Log₁₀ em µM). EDTA não forneceram um padrão adequado porque amostras expostas as medidas de absorbância maiores do eram ating...

Discussão

O resultado principal deste trabalho é a produção de uma nova metodologia que pode ser usada para enriquecer rapidamente para Sideróforo produzindo micróbios ao medir quantitativamente Sideróforo/actividade de produção da amostra ambiental. A metodologia é rápida, simples e econômica, e os resultados mostram como ele pode ser usado para detectar atividade Sideróforo de tipos de amostras complexas e romance (ex.., solo e planta de tecido). O protocolo também resulta na produção de estoques de glicerol das cultura...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Assadeira
Folha
Cloreto de amônio, granular	Fiesher Scientific	152315A
	Thermo Scientific
CAS (Chrome Azurol S)	Chem-Impex Int'l Inc)	000331-27168
Dextrose monohidratada (glicose), pó cristalino	Fiesher Scientific	1521754
EDTA, sal dissódico, di-hidratado, cristal	J.T.Baker	JI2476
Glicerol, padeiro anidro	analisado	C22634
HDTMA (cetiltrimetilamônio Reagente de brometo	World	FZ0941
Cloridrato ácido	ACROS Orgânico	B0756767
Infinito M200 PRO leitor de placas	TECAN
Cloreto de ferro (III) hexahidratado, 99%	ACROS Organic	A0342179
Laboratório Hotte Hood	Incubadora de Laboratório Thermo Scientific
	VWR Scientific
Sulfato de magnésio	Fiesher Scientific	27855
Ácido nírico, (69-70) %	J.T.Baker	72287
PIPES tampão, 98,5%	ACROS Orgânico	A0338723
fosfato de potássio, dibaisc, pó	J.T.Baker	J48594
Pyoverdine	SIGMA-ALDRICH	078M4094V
Areia
SI-600R Shaker	Lab Companion
Cloreto de sódio, granulado	Fiesher Scientific	136539
hidróxido de sódio, pellets	J.T.Baker	G48K53
Fosfato de sódio, dibásico heptahidratado, 99%	ACROS Organic	A0371705