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Artigo de método

Distribuição da água de xylem em plantas lenhosas visualizadas com um microscópio de elétron da Cryo-exploração

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DOI:

10.3791/59154

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20 de junho de 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Ecology, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 2Kansai Research Center, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 3Department of Wood Properties and Processing, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 4Faculty of Agriculture, Kyushu University, 5Department of Bacteriology, University of Wisconsin, 6Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University

Neste artigo

Resumo

Observar a distribuição de água dentro do xilema fornece informações significativas sobre a dinâmica do fluxo de água em plantas lenhosas. Neste estudo, demonstramos a abordagem prática para observar a distribuição de água de xilema in situ usando um criostat e Cryo-SEM, que elimina mudanças artifactuais no estado da água durante a preparação da amostra.

Resumo

Um microscópio eletrônico de varredura instalado crio-unidade (Cryo-SEM) permite a observação do espécime em temperaturas subzero e tem sido usado para explorar a distribuição de água em tecidos vegetais em combinação com técnicas de fixação de congelamento usando nitrogênio líquido (LN 2). para espécies lenhosas, no entanto, os preparativos para a observação da superfície de corte transversal do xilema envolvem algumas dificuldades devido à orientação das fibras de madeira. Além disso, uma maior tensão na coluna de água em condutas de xilema pode ocasionalmente causar mudanças artifactuais na distribuição de água, especialmente durante a fixação e coleta da amostra. Neste estudo, demonstramos um procedimento eficiente para observar a distribuição de água dentro do xilema de plantas lenhosas in situ por meio de um criostat e Cryo-SEM. No início, durante a coleta da amostra, medir o potencial hídrico do xilema deve determinar se a alta tensão está presente nas condutas de xilema. Quando o potencial de água do xilema é baixo (< ca. − 0,5 MPa), é necessário um procedimento de relaxamento de tensão para facilitar a melhor preservação do estado da água em condutas de xilema durante a fixação do congelamento da amostra. Em seguida, um colarinho estanque é anexado ao redor do tronco de árvore e preenchido com LN2 para fixação de congelamento do estado de água do xilema. Após a colheita, deve-se tomar cuidado para garantir que a amostra seja preservada congelada ao completar os procedimentos de preparo da amostra para observação. Um criostat é empregado para expor claramente a superfície transversal-cortada do xylem. Nas observações de Cryo-SEM, o ajuste de tempo para congelar-gravura é exigido para remover a poeira de geada e para acentuar a borda das paredes de pilha na superfície de visão. Nossos resultados demonstram a aplicabilidade de técnicas de Cryo-SEM para a observação da distribuição de água dentro do xilema em níveis celulares e subcelulares. A combinação de Cryo-SEM com técnicas de observação in situ não destrutivas melhorará profundamente a exploração da dinâmica de fluxo de água da planta lenhosa.

Introdução

A disponibilidade de recursos hídricos (i.e., precipitação, teor de água no solo) determina rigorosamente a mortalidade e a distribuição geográfica das espécies vegetais, uma vez que necessitam absorver água do solo e transportá-la para as folhas para produção fotossintética. As plantas devem manter seu sistema de transporte de água flutuação de abastecimento de água. Em particular, as plantas lenhosas geram altas tensões em suas condutas ao longo dos córregos de transpiração, pois, em alguns casos, eles precisam segurar sua coroa mais de ~ 100 m acima do solo. Para manter as colunas de água tal pressão negativa elevada, os condutas do xilem consistem em um continuum de pilhas tubulares com as paredes de pilha rígidas e hydrofóbicas-lignified1. A vulnerabilidade à disfunção de xilema de condutas de xilema em cada espécie é um bom determinante da sobrevivência da espécie flutuação da água2. Além disso, estudar o estado hídrico das condutas de xilema é importante para a avaliação do estado de saúde de árvores individuais submetidas a tensões abióticas ou bióticas. Medir o fluxo de SAP ou o potencial da água pode fornecer estimativas do status de água de uma planta lenhosa devido à função hidráulica integrada de conduits do xylem. Além disso, a visualização da distribuição de água em células de xilema pode esclarecer a condição de componentes individuais do sistema hidráulico xilema.

Existem várias técnicas para visualizar o estado hídrico das condutas de xilema3. Os métodos clássicos e úteis para observar as vias de água no tecido lenhoso envolvem manchar a coluna de água, imersando as extremidades dos ramos cortados em um corante ou injetando um corante em pé árvore hastes4. A fotografia de raio x suave também permite a visualização da distribuição de água de discos de madeira cortados devido à intensidade diferencial de absorção de raios-x da umidade em xilema5,6. Estes métodos, entretanto, fornecem somente trilhas do movimento da água ou demonstram distribuições macroscópicas da água. Recentemente, técnicas de observação não destrutivas, como a tomografia computadorizada de raios X micro Focus (μct)7,8,9,10e a ressonância magnética (RM)11, 12, foram melhorados significativamente para permitir a observação da água em condutas do xylem dentro das mudas intactas. Estes métodos não destrutivos têm grandes vantagens em que podemos observar o estado de água do xilema sem efeitos de corte artificial, e podemos rastrear a dinâmica do fluxo de água por imagem seqüencial ou introduzindo um agente de contraste10. Entretanto, nós precisamos de usar um MRI personalizado para a imagem latente da planta ou uma facilidade especializada para o μCT Synchrotron-baseado a fim obter as imagens que podem identificar o índice de água do nível celular. Além disso, embora o sistema μct baseado em síncrotron possibilite a obtenção de imagens finas com alta resolução espacial, comparável à microscopia de luz7,8,9, as células vivas podem ser feridas pelo radiação de raios-X de alta energia13,14. Empregando um microscópio de elétron da exploração em que as Cryo-unidades são instaladas (Cryo-SEM) é um método muito útil para localizar precisamente a água no xilema a nível celular, embora isto exija destrutivamente colher a amostra para a observação. Para fixar a água em condutas de xilema, uma porção das hastes (ou seja, galhos, galhos ou hastes) é congelada in situ por nitrogênio líquido (LN2). As observações da superfície de espécimes cortados, congelados por Cryo-sem fornecem imagens altamente amplificadas da estrutura do xilema de que nós podemos identificar a água em condutas do xylem como o gelo. Uma limitação significativa deste método é que a observação seqüencial da mobilidade da água dentro da mesma amostra é impossível. Entretanto, a aplicação de μCT ou de MRI para a observação seqüencial das árvores que vivem em um campo é extremamente desafiante porque estes instrumentos não são portáteis. Em contraste, Cryo-SEM tem um potencial para usar esta técnica em grandes árvores em experimentos de campo para visualizar claramente o conteúdo de água em não só o nível celular, mas também em um nível de estrutura mais fina, por exemplo, água em poços intervasculares15, água em espaços intercelulares16, ou bolhas na coluna de água17.

Muitos estudos observando a água de xylem por Cryo-sem foram relatados 5,12,18,19,20,21,23. Utsumi et al. (1996) estabeleceram inicialmente o protocolo de observação do xilema in situ por congelamento-fixação de um tronco vivo através do preenchimento do LN2 em um recipiente fixado na haste21. A temperatura da amostra foi mantida abaixo de-20 ° c durante a coleta da amostra e durante a preparação de Cryo-SEM, a fim de evitar derreter o gelo dentro de condutas de xilema. Este método tem sido usado para observar a água em xilema, a fim de esclarecer a distribuição de água o regime de água em mudança11,12,24,25,26, 27,28, a variação sazonal da distribuição de água21,29,30, o efeito dos ciclos de congelação-descongelamento17,31, 32, a distribuição da água na madeira molhada5, mudanças na distribuição da água durante a transição do alburno ao cerne20, curso de tempo sazonal da atividade cambial e diferenciação dos navios33, e cavitação induzida por determinadas tensões bióticas23,34. A condutividade hidráulica e a vulnerabilidade de condutas à cavitação também foram verificadas usando Cryo-sem35,36. Cryo-SEM equipado com a espectrometria de raio X dispersiva da energia (EDX ou EDS) foi usado para estudar a distribuição do elemento sobre a superfície de um espécime que contem a água37.

Congelar-fixação de um tronco vivo que contenha condutas a tensão hidráulica elevada provoca às vezes cavitações artificiais que são observados pelo Cryo-sem como cristais de gelo fraturados no lúmen das condutas38,39. Em particular, as espécies Latifoliada com condutas mais longos e mais largos são vulneráveis aos artefatos tensão-induzidos, tais como a cavitação causada pelo corte da amostra, mesmo se conduzido a água3,40. Os artefatos de cavitação tornam-se evidentes após a amostragem de uma árvore transpiring (ou seja, amostragem durante o dia) ou condições severas de seca e podem induzir em erro a uma superestimação da ocorrência de cavitação3,38, 39. Portanto, a tensão que trabalha nas condutas tem de ser liberada a fim de evitar a cavitação vesícula3,12,39.

A técnica da congelar-fratura usando uma faca instalada em uma câmara do espécime é empregada frequentemente para expor a superfície do espécime para a observação de Cryo-SEM. Entretanto, os planos liofilizados de tecidos de plantas lenhosas, especialmente seções transversais do xilema secundário, são muito ásperos para observar claramente as características anatômicas e a água no tecido6. A aplicação de um criostat para aparar um espécime permite a preparação rápida e de alta qualidade de superfícies da amostra20,23. O objetivo geral deste método é fornecer a evidência com a definição da microscopia de elétron da distribuição da água em vários tipos de pilhas do xylem in situ sem a ocorrência de Artifacts da amostragem. Nós introduzimos nosso procedimento actualizado, que foi melhorado firmemente desde que nós o adotamos primeiramente, a respeito da amostragem, do aparamento e da limpeza da superfície do espécime para obter micrografias de elétron de alta qualidade de amostras Cryo-fixas do xilema.

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Protocolo

Nota: um gráfico esquemático deste protocolo é mostrado na Figura 1.

1. amostragem: abrandamento da tensão dentro da coluna da água de conduits de xylem

Nota: o tratamento de relaxamento de tensão a seguir é recomendado antes da aplicação LN2 para evitar os artefatos de congelamento e tensão induzida na distribuição de água do xilema.

  1. Coloque uma ramificação e folhas para amostragem com um saco plástico preto para equilibrar o potencial de água entre xilema e deixa mais de duas horas antes da amostragem.
  2. Determine o potencial da água de pelo menos duas folhas da amostra usando uma câmara de pressão ou um Psychrometer. Quando o potencial da água é mais elevado do que ca. − 0,5 MPa (isto é, nenhuma ou muito-baixa tensão existe), uma amostra pode ser colhida após o congelamento (refira a seção 2: fixação do gelo). Quando o potencial da água é mais baixo do que − 0,5 MPa, um tratamento para o abrandamento é necessário como descrito abaixo.
  3. Fixar uma gola estanque ao redor da haste, a fim de ser preenchido com água. Um copo de plástico sem fundo pode servir como um colarinho estanque. Deve-se tomar cuidado para selar firmemente os espaços entre a haste e o colar usando uma fita adesiva para impedir o escapamento dos meios líquidos que são usados subseqüentemente. Para a colheita de hastes flexíveis, tais como galhos finos ou galhos, afundar uma porção de corte em um balde cheio de água, dobrando o tronco. Corte a superfície da água usando tesouras de poda ou uma serra. Transfira a amostra para outro recipiente de água o mais rápido possível para minimizar a exposição da extremidade do corte ao ar.
  4. Mantenha a extremidade cortada da amostra debaixo de água. Para as espécies Latifoliada, assegure-se de que o comprimento do ponto onde uma Cryo-amostra para o sem seja obtido à borda cortada da haste colhida seja mais longo do que o comprimento máximo da embarcação das amostras a fim impedir artefatos tensão-induzidos dentro da amostra do Cryo.
  5. Cubra a amostra contendo folhas com um saco plástico preto para reduzir a transpiração. Mantenha a extremidade do corte da amostra na água e mantenha esta circunstância por aproximadamente 30 minutos a fim relaxar a tensão do xylem. Evite um tempo de relaxamento mais longo (> 1 h) devido ao possível reabastecimento artificial de condutas CAVITADAS12.
  6. Meça o potencial da água outra vez para confirmar o abrandamento da tensão do xilema (quase 0 MPa).
    Nota: antes da amostragem, o comprimento máximo do vaso das espécies-alvo deve ser pesquisado ou determinado com amostras semelhantes por método de injeção de ar. Ao amostrarem uma grande árvore, ou uma grande ramificação, é difícil realizar os procedimentos de relaxamento de tensão descritos acima. Conseqüentemente, as amostras das árvores grandes devem ser coletadas durante o período do madrugada quando o potencial da água do Xylem é mais elevado.

2. fixação de congelamento com LN2

  1. Corte e abra um lado de um colar estanque com tesouras ou uma faca de serviço público. Fixe firmemente o colar em torno da haste com uma fita adesiva ao prender a abertura horizontalmente.
  2. Use luvas isolantes/Mitten, mas certifique-se de segurar a garrafa de LN2 com segurança, e executar ln2 no colarinho para preenchê-lo com ln2. Mantenha-o enchido firmemente adicionando o LN2 para congelar completamente a água no xilema. O tempo necessário para o congelamento depende do tamanho da amostra; 1 min após a ebulição do LN2 derramado parou é suficiente para um pequeno galho ou uma muda, enquanto mais de 20 min é necessário para uma haste de uma árvore maior20. Adicione LN2 continuamente durante o congelamento à medida que evadora rapidamente devido a grandes diferenças de temperatura entre as temperaturas ln2 e ambiente.
  3. Retire a gola da parte congelada da haste da amostra para remover o LN2 após o tempo de congelamento suficiente. Certifique-se de usar luvas isolantes para evitar o contato com o potencial LN2 derramamentos causados pela desanexação do colarinho.
  4. Colher a amostra com uma multa serrote imediatamente.
  5. Cubra a amostra congelada com um pedaço de folha de alumínio ou colocá-lo em um tubo de amostra, em que os números de identificação de amostra são escritos. Coloc ràpida a amostra colhida em um recipiente enchido com o LN2 ou o bloco em uma caixa isolada enchida com o gelo seco.
  6. Armazene as amostras em um freezer profundo até a observação. A temperatura de armazenamento preferida é − 80 ° c a fim impedir o sublimation do gelo e seu recristalização durante o armazenamento.

3. preparação do espécime

Nota: para a observação, uma amostra deve ser cortada e sua superfície para a observação deve ser aplainada na temperatura de subzero a fim manter a distribuição de água em seu xylem in situ. Um micrótomo biológico com um sistema do criostato (criostato) é ideal para aparar e expor a superfície de um espécime neste tipo de observação por Cryo-sem.

  1. Ajuste a temperatura da câmara do espécime do criostato ao ° c − 30, que é geralmente frio bastante manter a seiva do xylem da maioria de plantas em um estado congelado.
  2. Aparar uma amostra em uma pequena peça (< ca. 2 cm de altura e < ca. 1 cm de largura ou diâmetro) que podem ser ajustadas para o suporte de amostra de um Cryo-SEM. Use uma faca afiada ou uma serra de dentes finos para aparar, a fim de evitar a quebra do gelo na amostra. No caso de uma amostra maior que não pode ser cortada com uma faca, pre-cut rapidamente com uma serra arrefecida em uma caixa do congelador.
  3. Prenda a peça aparada a um mandril, um suporte para um criostat montando em um meio de incorporação de congelamento de tecido (por exemplo, composto de OCT) para o corte de crio. Em seguida, prenda o mandril a um suporte de amostra de um micrótomo do criostat.
  4. Aparar a superfície, raspando repetidamente com secções de 5 – 7 μm de espessura. Aparar cortando mais de 1.000 a 2.000 μm, na profundidade total da superfície inicial na coleção da amostra, é útil para eliminar a parcela danificada da amostra causada pelo Pre-corte com uma faca ou uma serra como descrito na etapa 3,2.
  5. Depois de aparar aproximadamente uma superfície da amostra, ajuste uma porção não utilizada da lâmina do micrótomo acima da superfície do espécime. Não permita que a lâmina toque na amostra que excederá a configuração de espessura.
  6. Antes do primeiro corte pela porção da lâmina não utilizada, amplie ligeiramente a distância entre a superfície da amostra e a lâmina.
  7. Corte a superfície da amostra apenas uma ou duas vezes. Além disso, deslize a lâmina novamente ajustando uma porção de lâmina não utilizada na superfície da amostra.
  8. Repita as etapas 3,6 e 3,7 três ou quatro vezes. Isso é importante para se obter uma superfície clara sem "marcas de faca" (Figura 4).
  9. Após o corte final, ajuste a posição da lâmina longe da amostra para impedir que a poeira fure na amostra.
  10. Retire o mandril do suporte do espécime e retire a amostra do mandril removendo o meio de incorporação congelado com uma faca afiada. Assegure-se de que a amostra seja colocada na câmara do criostat para evitar que a sua superfície aplainada seja de pó de geada.
  11. Prenda o espécime a um suporte do espécime de Cryo-sem com um meio de incorporação de congelação do tecido na câmara do criostato.

4. transferência para a câmara de amostra Cryo-SEM

Nota: a amostra preparada para a superfície deve ser protegida de um aumento da temperatura ou acumulação de geada durante a transferência da câmara de criostat para a fase de observação na câmara de amostra de Cryo-SEM.

  1. Mantenha a temperatura do estágio frio na câmara do espécime de Cryo-SEM em inferior a-120 ° c com LN2 de acordo com o manual do usuário do equipamento.
  2. Coloque o suporte da amostra com a amostra preparada em um recipiente isolante preenchido com LN2 na câmara de criostat.
  3. Segure o suporte da amostra com uma haste de troca de amostra abaixo do LN2. Evite expor o suporte do espécime ao ar sempre que possível.
  4. Ajuste rapidamente o suporte da amostra para a câmara de pré-evacuação da câmara de amostra Cryo-SEM assim que iniciar a evacuação da câmara de pré-evacuação. Em seguida, coloque o suporte do espécime no estágio frio após o ar ser totalmente evacuado. Embora um pouco de acúmulo de geada seja inevitável, o procedimento de "congelamento" (etapa 6) pode removê-lo.

5. configuração em SEM

Nota: a configuração típica para a observação é descrita abaixo. Algumas modificações são exigidas dependendo da condição do vácuo ou do feixe de elétron.

  1. Defina os parâmetros de SEM para observação da seguinte maneira:
    Tensão de aceleração: 3 – 5 kV
    Temperatura do estágio da amostra: < − 120 ° c
    Detector: emissão secundária

6. congelamento-gravura

Nota: congelar-gravura é o procedimento para acentuar a borda das paredes de pilha da amostra pela sublimação ligeira do cristal de gelo. Congelar-gravura também envolve a remoção de poeiras de geada de superfície.

  1. Gire sobre a tensão da aceleração da pistola elétrica durante congelar-gravura. É melhor conduzir congelar-gravura ao observar o espécime.
  2. Elevar a temperatura do estágio de amostra para − 100 ° c.
  3. Aguarde alguns minutos até que a poeira de geada seja removida e o nível de superfície do gelo nas células de xilema tenha diminuído ligeiramente em comparação com as paredes celulares.
  4. Abaixe a temperatura do estágio do espécime a − 120 ° c.
    Nota: se não houver nenhum controlador de temperatura instalado para o estágio da amostra, segure a amostra usando a haste de troca e retire-a da fase de amostra por alguns minutos. Observe o espécime várias vezes durante este processo de congelamento-condicionamento para verificar o status de sublimação do espécime.

7. revestimento do metal (opcional)

Nota: as melhorias recentes ao instrumento de SEM e ao processamento de imagem podem fornecer imagens da alta qualidade de espécimes de isolamento elétricos sem revestimento do metal. No entanto, espécimes não condutores, como materiais biológicos, são, por vezes, sujeitos a cobrança; maior brilho em posições específicas da amostra devido ao acúmulo de elétrons ("carregamento"). Expor a amostra para feixes de elétrons por um longo período de tempo ou para uma alta ampliação, aumenta os efeitos de carregamento. O revestimento da superfície da amostra com materiais metálicos condutores elétricos previne a ocorrência de carga. Use o sistema do revestimento do vácuo que é instalado dentro da unidade de Cryo-SEM a fim impedir que a temperatura da amostra aumente durante o revestimento.

  1. Assegure-se de que o material de revestimento esteja instalado em um cabeçote de evaporador designado do sistema de revestimento.
  2. Mantenha a temperatura do estágio frio no sistema de revestimento abaixo de − 170 ° c.
  3. Coloque o suporte da amostra na fase fria do sistema de revestimento após o congelamento-condicionamento suficiente.
  4. Abra uma divisória entre o estágio frio e a cabeça do evaporador.
  5. Ajuste o valor atual e o valor da tensão da cabeça do evaporador em CA. 30 miliampères e CA. 5 V, respectivamente.
  6. Evate o material de revestimento para ca. 30 s para revestir a superfície da amostra.
  7. Defina ambos os valores de corrente e tensão da cabeça do evaporador em zero e feche a partição.
  8. Coloque o suporte da amostra na fase fria da câmara de amostra para observação.

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Resultados

Imagens representativas de superfícies de corte transversal de xilema de árvores coníferas e Latifoliada, observadas por Cryo-sem, são mostradas na Figura 2. Na baixa ampliação, a área preta nas imagens indica as cavidades de que a água desaparece inteiramente ou em parte, e a área cinzenta indica as paredes de pilha do xylem, o citoplasma, e a água (Figura 2a). Na ampliação elevada, é evidente que a água não é p...

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Discussão

Os métodos de observação de Cryo-SEM introduzidos neste trabalho são práticos para a visualização clara da distribuição de água em uma escala celular. Através deste método, explorando as mudanças na distribuição de água dentro do xilema pode potencialmente ajudar a esclarecer o mecanismo de tolerância de espécies de árvores ao estresse abiótico (escassez de água ou congelamento) ou estresse biótico (doença da árvore).

O passo mais crucial neste método é preservar a distribuição de água caracte...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por JSPS KAKENHI (no. 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H02258)

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
material de revestimentoJOEL Ltd., JapãoFio de ouro, 0,50 & vezes; 1000 mm, 99,99%, Peças nº 125000499 
microscópio eletrônico de varredura criogênicaJOEL Ltd., JapãoJSM-6510 instalado com criostato MP-Z09085T / MP-51020ALS
Thermo ScientificCryoStar NX70
Lâminas de micrótomo descartáveis Thermo Scientific HP35 ULTRA,
Thermo ScientificShandon Cryomatrix,
Lâmina de micrótomo meio de incorporação de congelamento de tecido 3153735 Resina de incorporação 6769006

Referências

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