Este estudo demonstra o uso da citometria de fluxo para detectar a produção de (ROS) de espécies reativas de oxigênio resultantes da ativação do FcγR. Esse método pode ser usado para avaliar as mudanças no antimicrobial e redox função dos fagócitos em resposta aos complexos imunes, opsonized microorganismos ou direto FcγR cross-linking de sinalização.
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Artigo de método
Fluxo Cytometric medição da produção de ROS em macrófagos em resposta a FcγR cross-linking
Neste artigo
Resumo
Resumo
O burst oxidativo ou respiratório é usado para descrever o rápido consumo de oxigênio e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) pelos fagócitos em resposta a vários estímulos imunes. ROS, gerados durante a ativação imune exerce potente atividade antimicrobiana, principalmente através da capacidade de ROS de danificar o DNA e proteínas, causando a morte de microorganismos. Ser capaz de medir a produção de ROS reproducibly e com facilidade é necessário a fim de avaliar a contribuição de vários caminhos e moléculas deste mecanismo de defesa do hospedeiro. Neste artigo, demonstramos a utilização de sondas fluorescentes e fluxo cytometry para detectar a produção de ROS. Apesar de amplamente utilizado, medição fluorescente de ROS é notoriamente problemática, especialmente com relação à medição de ROS induzida por estímulos específicos e não mitogênico. Apresentamos uma metodologia detalhada para detectar ROS gerada como resultado específico FcγR estimulação, começando com a geração de macrófagos, escorva, coloração, FcγR cross-linking e terminando com a análise de fluxo cytometric.
Introdução
Espécies reativas de oxigênio (ROS) são moléculas reativas ou radicais livres que são subprodutos da respiração aeróbia (revisto em 1). Estes incluem o anião superóxido, peróxido, peróxido de hidrogênio, radical hidroxila e íons de hidroxila, entre outros. Em condições fisiológicas normais, ROS são produzidos principalmente pelas mitocôndrias e oxidases de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) e são rapidamente desintoxicados por diversas enzimas e proteínas como a superóxido dismutase e glutationa. Uma produção exagerada de ROS ou um defeito na capacidade de remover ROS pode resultar em estresse oxidativo, no qual espécies reactiva....
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Protocolo
O protocolo para manuseio de animal foi aprovado pelo Comitê institucional Cuidado Animal e uso de (IACUC) da Universidade da Flórida Central.
1. geração de medula óssea derivada de macrófagos (BMDMs)
-
Preparação de meios de cultura
- Preparar a mídia de base D10F: A de Dulbecco modificado águia médio (DMEM), adicionar inactivados por calor 10% de soro fetal bovino (FBS), piruvato de sódio 1 mM, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES) e β-Mercaptoetanol de 0,05 mM.
Nota: Embora seja melhor usar fresco D10F mídia, mídia de base D10F pode ser preparada até para duas semanas antec....
- Preparar a mídia de base D10F: A de Dulbecco modificado águia médio (DMEM), adicionar inactivados por calor 10% de soro fetal bovino (FBS), piruvato de sódio 1 mM, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES) e β-Mercaptoetanol de 0,05 mM.
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Resultados
Usando o protocolo descrito dentro, apresentamos dados representativos, demonstrando a deteção de cytometric do fluxo de produção de ROS, resultante da estimulação da WT C57BL/6J BMDMs através da FcγR. Como esperado, observamos alterações mínimas na fluorescência FL1 ou FL2 acima dos níveis de fundo nas células unstimulated (Figura 3A, comparar "manchadas, unstimulated" vs "imaculado, unstimulated" ponto parcelas). Observamos um aumento na fluorescência FL1 e FL2, quando as células são estim.......
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Discussão
2-[NULL] de Diniz Melo e detecção baseada em DHE de ROS é uma técnica amplamente utilizada14,15. Facilidade de uso e a adaptabilidade destas sondas ROS para formatos de microplacas cinética, análise de fluorescência microscopia ou fluxo cytometric contribuiu para sua popularidade. No entanto, em nossos estudos de funções de macrófagos mediada por FcγR, lá não parecem ser um protocolo padrão para a realização deste ensaio para análise de fluxo cytometri.......
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Divulgações
Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostaria de agradecer a outros membros do laboratório Tigno-Aranjuez incluindo Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy e Roopin Singh por sua ajuda na manutenção de colônia de manutenção e rato de laboratório. Suporte para esta pesquisa foi fornecido por grant R00 HL122365 e fundos de start-up para J.T.T-A.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Pesquisa Inovadora Anti-BSA IgG1 | IBSA9E2C2 | ||
| Alexa Fluor 647 Rato IgG2b, κ Isotipo Ctrl Anticorpo | BioLegend | 400626 | |
| Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | |
| Anti-mouse F4/80 anticorpo conjugado a Alexa Fluor 647 | BD Biosciences | 565853 | |
| Anti-mouse F4/80 anticorpo conjugado a FITC | BioLegend | 123108 | |
| Anticorpo anti-camundongo/humano CD11b conjugado a Alexa Fluor 647 | BioLegend | 101218 | |
| beta-mercaptoetanol (BME) | Sigma | M3148-100ml | |
| Albumina de Soro Bovino (BSA) FractionV | Fisher | BP1600-100 | |
| C57BL/6J | Jackson labs | Stock No.000664 | |
| CM-H2DCFDA | Sondas Moleculares | C6827 | Pode ser um substituto para o reagente de detecção de estresse oxidativo no kit Enzo |
| Dihydroethidium (DHE) | Molecular Probes | D11347 | Pode ser um substituto para o reagente de detecção de superóxido no kit Enzo |
| DMEM 1x | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM sem fenol vermelho | Gibco | 31053-028 | |
| DMF Anidro | Acros Organics | 61094-1000 | |
| Soro Fetal Bovino (FBS) | VWR | 97068-085 | |
| FITC Rato IgG2a, κ Isotipo Ctrl Anticorpo | BioLegend | 400506 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| L glutamina | Gibco | 25030-081 | |
| Células LADMAC | ATCC | CRL-2420 | |
| MEM | Corning | 10-010-CV | |
| camundongo IFN-g | GoldBio | 1360-06-100 | |
| N-Acetil-L-cisteína | EMD Milipore | 106425 | Pode ser um substituto para o inibidor/sequestrante de ROS no kit Enzo |
| Citômetro de fluxo de novócitos com amostrador automático | Acea | 2060R | |
| Piocianina (indutor de ROS) | Cayman chemical | 10009594 | Pode ser um substituto para o indutor no kit Enzo |
| ROS-ID kit de detecção total de ROS/superóxido | ENZO ENZO | ENZ-51010 | |
| Piruvato de sódio (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Tripsina-EDTA (0,25%) | Gibco | 25200-056 |
Referências
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), R453-R462....
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Reimpressões e permissões
