Inibição do crescimento de Aspergillus flavus e produção de aflatoxina em milho transgénicos que expressar o inibidor de α-amilase de Lablab purpureus L.

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo para análise de crescimento de Aspergillus flavus e produção de aflatoxinas em grãos de milho expressar uma proteína antifúngica.  Estamos usando uma estirpe de GFP-expressando a. flavus monitorado a infecção e a propagação do fungo em sementes maduras em tempo real. O ensaio é rápido, confiável e reprodutível.

Resumo

Contaminação por aflatoxinas em culturas alimentares e alimentos para animais é um grande desafio em todo o mundo. As aflatoxinas, produzidas pelo fungo Aspergillus flavus (a. flavus) são potentes agentes cancerígenos que reduzem substancialmente o valor das culturas de milho e outras culturas de óleo rico como amendoim além de posar uma ameaça grave para a saúde humana e animal. Diferentes abordagens, incluindo tradicionais de reprodução, expressão transgênica da resistência associada a proteínas e RNA de interferência (RNAi)-com base induzida pelo anfitrião silenciamento de crítica a. flavus alvos de gene, estão sendo avaliados para aumentar resistência de aflatoxina em culturas sensíveis. Após estudos têm mostrado um importante papel de α-amilase em produção de patogênese e aflatoxina a. flavus , sugerindo que este gene/enzima é um alvo potencial para reduzir o crescimento da . flavus e produção de aflatoxina. A este respeito, o atual estudo foi realizado para avaliar uma expressão heteróloga (sob controle do promotor constitutivo CaMV 35S ) de uma proteína de como inibidor de α-amilase Lablab purpureus L. (AILP) no milho contra a. flavus. AILP é uma proteína de 36-kDa, que é um inibidor competitivo da enzima α-amilase da . flavus e pertence à família de proteína lectina – arcelin – α-amilase inibidor em comum feijão. Estudos in vitro, antes do trabalho atual tinham demonstrado o papel de AILP na inibição da atividade de α-amilase da . flavus e crescimento fúngico. Crescimento de fungos e produção de aflatoxina em grãos maduros foram monitorados em tempo real usando uma estirpe de GFP-expressando a. flavus . Este kernel triagem ensaio (KSA) é muito simples de configurar e fornece dados confiáveis e reprodutíveis na infecção e a extensão da propagação que pode ser quantificada para avaliação de germoplasma e linhas transgénicas. A fluorescência da estirpe GFP é estreitamente correlacionados com fungal crescimento e, por extensão, é bem correlacionado aos valores de aflatoxina.  O objetivo do trabalho atual foi implementar esse conhecimento anterior em uma colheita comercialmente importante como milho para aumentar a resistência de aflatoxina. Nossos resultados mostraram uma redução de 35% e 72% no crescimento da . flavus em sementes de milho transgênicos AILP-expressando que, por sua vez, traduzida em uma redução de 62% e 88% nos níveis de aflatoxina.

Introdução

Contaminação por micotoxinas pelos gêneros de fungos, Aspergillus, Fusarium, Penicilliume Alternaria é um grande problema de alimentos e alimentação de culturas cultivadas em todo o mundo^1,2,3. Entre estes fungos fitopatogênicos, Aspergillus tem o maior impacto adverso na saúde humana e animal e o valor de colheita. Aspergillus flavus (A. flavus) é um patógeno oportunista planta que infecta rico oleaginosas tais como o milho, caroço de algodão e de amendoim e produz os potentes carcinógenos, aflatoxinas, bem como ....

Protocolo

1. plasmídeo construções e transformação de milho

1. PCR amplificar Lablab AILP inserir usando as primeiras demão 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 'e 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3'. As condições PCR incluem uma etapa de desnaturação inicial a 98 ° C por 30 s (etapa 1), seguido por desnaturação a 98 ° C, durante 10 s (etapa 2), recozimento a 55 ° C por 30 s (etapa 3), alongamento a 72 ° C, durante 20 s (etapa 4), 31 ciclos da etapa 2 para o passo 4 , e um alongamento final passo a 72 ° C por 5 min. Clone do produto do PCR em um pCAMBIA modificado 1.300 vetor usando Xba Pste eu locais da limitação. O vetor de destino final da p....

Resultados

Transformação de milho e triagem molecular de plantas transgênicas

Os embriões imaturos de linhagens de milho Hi-II foram transformados usando estirpe de Agrobacterium tumefaciens EHA101 contendo o vetor de destino final planta expressando o gene AILP Lablab purpureus sob o controle dos CaMV 35S promotor. Cinco linhas de milho independente transformadas eram avançadas para a g.......

Discussão

As perdas de rendimento em culturas agrícolas devido a pragas e patógenos é um problema global de²⁰. Atualmente, a aplicação de fungicidas sintéticas e pesticidas é o predominante para controlar patógenos vegetais e pragas, mas toxicidade residual destes compostos bioquímicos na alimentação humana e animal pode representar uma ameaça grave para a saúde humana e animal²¹. Considerando a importância econômica do milho como comida e cultura alimentar, redução ou eliminação da .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agar	Caisson
Amazing Marine Goop	Eclectic Products
C1000 Touch CFX96 Sistema de Tempo Real	Bio-Rad
Corning  Pratos de Cultura de Tecidos Falcon, 60 mm	Fisher Scientific	08-772F
Eppendorf  5424 Microcentrífuga	Fisher Scientific
Erlenmeyer Balão com rolha, 50 mL	Ace Glass	6999-10
Etanol
FluoroQuant Afla	Romer Labs	COKFA1010
Papel de Filtro Qualitativo Canelado, 15 cm	Fisher Scientific	09-790-14E
Forno de Ar de Força	VWR
FQ-Reader	Romer Labs	EQFFM3010
Geno / Grinder 2010	OPS Diagnostics	SP 2010-115
Luvas Resistentes a Solventes Orgânicos de Polivinil Álcool Polivinílico Aprimorado	Ansell	012-15-554
Incubadora Innova 44 Agitador	iScript da Brunswick Scientific
	Bio-Rad	1708890
Bicos de Griffin de Forma Baixa
Cloreto
Metileno de Metanol
Nexttec Kit de isolamento de DNA de 1 etapa para plantas	Microscópio Nexttec	47N
Estereomicroscópio Nikon SMZ25 com iluminador episcópico C-HGFI e câmera Andor Zyla 4.2 sCMOS	Nikon
Nunc Square BioAssay Plates	da planta de 240835		ThermoFisher Scientific
	F130WH		ThermoFisher Scientific
, 15 ml	OPS Diagnostics	PCRV 15-100-23
Batata Tampa de Pressão de Caldo
, 22 mm	DKW Life Sciences	242612
Fosfato de Sódio dibásico heptahidratado	Sigma-Aldrich
Fosfato de Sódio monobásico	Sigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA Kit	Sigma-Aldrich	STRN50
, 3/8''	OPS Diagnostics	GBSS 375-1000-02
Placa de Agitação
Synergy 4 Fluorômetro	Bio-Rad
Triton X-100	Suco V8 Sigma-Aldrich	T-9284
Folhas	Campbell's
Whatman, Grau 3	Fisher Scientific	09-820P
Agitador de Pulso	Burrell Scientific

Círculos de Kit de Síntese de cDNA de Nitrogênio Líquido, 100 mL DKW Life Sciences 14000-100 de Nikon Eclipse E600 com câmera Nikon DS-Qi1 Nikon Kit de PCR direto de chumbo Frascos de policarbonato da de Dextrose Esferas de Moagem de Aço Inoxidável Biotek T100 Termociclador Planas de Grau Qualitativo