Avaliação morfológica e funcional de sinapses de fita em regiões de frequência específica da cóclea do rato

Summary

Este manuscrito descreve um protocolo experimental para avaliar as características morfológicas e o estado funcional das sinapses da fita em camundongos normais. O modelo atual é igualmente apropriado para modelos synaptopathy-restringidos ruído-induzidos e idade-relacionados da coclear. Os resultados correlativos de estudos precedentes do rato são discutidos igualmente.

Abstract

As células ciliadas internas cocleares (IHCs) transmitem sinais acústicos aos neurônios de gânglio espirais (SGNs) através de sinapses de fita. Vários estudos experimentais indicaram que as sinapses das células ciliadas podem ser os alvos iniciais na perda auditiva neurossensorial (SNHL). Tais estudos têm proposto o conceito de "sinaptopatia" coclear, que se refere a alterações no número, estrutura ou função da sinapse da fita que resultam em transmissão sináptica anormal entre IHCs e SGNs. Embora a sinaptopatia coclear seja irreversível, não afeta o limiar auditivo. Em modelos experimentais induzidos por ruído, os danos restritos às sinapses de IHC em regiões de frequência selecionam-se são empregados para identificar os fatores ambientais que causam especificamente o synaptopathy, assim como as conseqüências fisiológicas de perturbar esta orelha interna Circuito. Aqui, apresentamos um protocolo para análise da morfologia sináptica coclear e função em uma região de frequência específica em camundongos adultos. Neste protocolo, a localização coclear de regiões de frequência específica é realizada utilizando-se mapas de frequência de lugar em conjunto com dados de cochleograma, seguindo os quais as características morfológicas das sinapses da fita são avaliadas via sináptica immunostaining. O estado funcional das sinapses da fita é então determinado com base nas amplitudes da onda de resposta auditiva do tronco encefálico (ABR) I. O presente relato demonstra que essa abordagem pode ser utilizada para aprofundar nossa compreensão da patogênese e dos mecanismos de disfunção sináptica na cóclea, o que pode auxiliar no desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas.

Introduction

As freqüências na escala de aproximadamente 20 \ u201220, 000 hertz podem ser percebidas como estímulos auditivos por seres humanos. A audição humana é normalmente mais sensível perto de 1.000 Hz, onde o nível médio de pressão sonora é de 20 μPa em adultos jovens (ou seja, 0 decibéis de nível de pressão sonora [dB SPL]). Em algumas condições patológicas, a perda auditiva é restrita a frequências específicas. Por exemplo, nos estágios iniciais da perda auditiva induzida por ruído (pair), um "entalhe" (i.e., elevação do limiar auditivo) pode ser observado no audiograma a 4 kHz¹. Ao longo da partição coclear de mamíferos, suas gradações de rigidez e massa produzem um mapa de frequência exponencial, com detecção de som de alta frequência na base da cóclea e detecção de baixa frequência no ápice². De fato, há um mapa de localização-frequência coclear ao longo da membrana basilar, levando ao que é conhecido como organização tonotópica^2,3. Cada lugar dado na membrana basilar tem a sensibilidade a mais elevada a somente uma freqüência sadia particular, que seja denominada geralmente a freqüência característica^3,4, embora as respostas a outras freqüências possam igualmente ser observadas.

Até o momento, vários modelos de mouse têm sido empregados para investigar a função normal, processos patológicos e eficácia terapêutica no sistema auditivo. O conhecimento preciso dos parâmetros fisiológicos na cóclea do camundongo é um pré-requisito para esses estudos de perda auditiva. A cóclea do camundongo é dividida anatomicamente em curvas apical, média e basal, que correspondem a diferentes regiões de frequência. Ao rotular os aferentes do nervo auditivo no núcleo coclear para analisar seus locais de inervação periférica correspondentes na cóclea, Müller et al. conseguiram estabelecer o mapa de localização-frequência coclear no rato normal in vivo⁵. No intervalo de 7,2 – 10, 5kHz, o que corresponde a posições entre 90% e a dez% do comprimento total da membrana basilar, o mapa de localização-frequência da cóclea do rato pode ser descrito por uma função de regressão linear simples, sugerindo uma relação entre o distância normalizada da base coclear e o logaritmo da frequência característica⁵. Em camundongos de laboratório, o mapa de frequência local pode ser usado para explorar a relação entre limiares auditivos dentro de faixas de frequência específicas e cocleogramas mostrando o número de células ciliadas ausentes em regiões relativas ao longo da membrana basilar⁶. É importante ressaltar que o mapa de frequência local fornece um sistema de posicionamento para a investigação de danos estruturais mínimos, como danos às sinapses de fita de células ciliadas em locais específicos de frequência coclear em camundongos com trauma auditivo periférico^{7 ,8}.

Na cóclea de mamíferos, as sinapses da fita são compostas de uma fita pré-sináptica, uma projeção elétron-densa que amarras um halo de vesículas sinápticas prontas para liberação contendo glutamato dentro do IHC, e uma densidade pós-sináptica no terminal nervoso do Sgn com receptores de glutamato⁹. Durante a transdução do som coclear, a deflexão do feixe de células ciliadas resulta em despolarização do IHC, o que leva à liberação de glutamato de IHCs para os terminais aferentes pós-sinápticos, ativando assim a via auditiva. A ativação deste caminho conduz à transformação de sinais mecânicos som-induzidos em um código da taxa no SGN¹⁰. Na verdade, a sinapse de fita IHC é altamente especializada para transmissão de som incansável em taxas de centenas de hertz com alta precisão temporal, e é de importância crítica para mecanismos pré-sinápticos de codificação de som. Os estudos precedentes revelaram que as sinapses da fita variam extremamente no tamanho e no número em regiões diferentes da freqüência no rato adulto cóclea^11,12, refletindo provavelmente a adaptação estrutural à codificação sadia particular para necessidades de sobrevivência. Recentemente, estudos experimentais em animais demonstraram que a sinaptopatia coclear contribui para múltiplas formas de deficiências auditivas, incluindo perda auditiva induzida por ruído, perda auditiva relacionada à idade e perda auditiva hereditária^{13, 14}. assim, métodos para identificação de alterações correlatas no número, estrutura e função sináptica em regiões de frequência específica têm sido cada vez mais empregados em estudos de desenvolvimento auditivo e doença da orelha interna, utilizando modelos gerados via manipulação experimental de variáveis genéticas ou ambientais^15,16,17.

No presente relato, apresentamos um protocolo para analisar o número, a estrutura e a função sináptica em uma região de frequência específica da membrana basilar em camundongos adultos. A localização da frequência coclear é realizada utilizando-se um determinado mapa de frequência local em combinação com um cócleograma. As características morfológicas normais das sinapses da fita coclear são avaliadas via imunomarcação pré-sináptica e pós-synaptica. O estado funcional das sinapses da fita coclear é determinado com base nas amplitudes do estímulo da onda I de abr. Com pequenas alterações, este protocolo pode ser usado para examinar as condições fisiológicas ou patológicas em outros modelos animais, incluindo ratos, cobaias e gerbils.

Protocol

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o guia NRC/ILAR para o cuidado e uso de animais de laboratório (8ª edição). O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de medicina de capital, Pequim, China.

1. seleção animal

1. Para todos os experimentos, use camundongos adultos C57BL/6J machos (8 semanas de idade) como modelo animal.
   Nota: Camundongos C57BL/6J portadores de uma variante de Splice da exposição Cdh23 aceleraram a senescência no sistema auditivo, refletido como uma perda de 40% das sinapses da fita na curva basal da cóclea e uma perda de 10% no turno médio por 6 meses de idade, seguida por uma rápida aumento desta perda em toda a cóclea com^18,19anos. Assim, aconselhamos cautela ao usar camundongos C57BL/6J com mais de 6 meses para pesquisa auditiva. Outras cepas de camundongos podem ser usadas dependendo dos objetivos experimentais específicos.
2. Inspecione os ratos usando um otoscópio diagnóstico profissional do bolso para governar para fora patologias exteriores ou da orelha média antes das avaliações da audição. Os sinais potenciais podem incluir fluido ou pus no conduto auditivo externo, vermelhidão e inchaço no tecido local e perfuração da membrana timpânica.
   Nota: Embora isso raramente seja encontrado, uma vez identificado, camundongos com doenças da orelha externa ou média devem ser excluídos.

2. avaliação auditiva

1. Anestesie os camundongos usando uma injeção intraperitoneal de uma mistura de cloridrato de cetamina (100 mg/kg) e cloridrato de xilazina (10 mg/kg). Julgar a profundidade da anestesia através de estímulos dolorosos (por exemplo, reflexo do dedo do pé-pitada).
   Nota: Quando o reflexo do dedo do pé-pitada é completamente ausente, o animal alcançou uma profundidade adequada da anestesia para o teste auditivo. Se for necessário mais tempo para gravações bilaterais de ABR, administrar uma dosagem mais baixa (um quinto da dosagem original) de anestésicos para restaurar o plano anestésico original. Tome cuidado para evitar a overdose de anestésico, pois isso pode levar à morte em camundongos.
2. Mantenha a temperatura do corpo do animal anestesiado a 37,5 ° c usando uma almofada de aquecimento termorregulante. Coloc o animal anestesiado em uma sala eletricamente e acusticamente protegida para evitar a interferência durante todo o teste da audição.
   Nota: Manter a temperatura fisiológica durante todo o procedimento até que o animal esteja totalmente acordado, a fim de prevenir a morte causada pela hipotermia pós-anestésica.
3. Coloque os eletrodos da agulha subdérmica (20 mm, 28 G) no vértice do crânio (eletrodo de gravação), na região da parotídea ipsilateral abaixo da Pinna da orelha medida (eletrodo de referência), e na região parotídea contralateral (eletrodo de aterramento), com profundidade de 3 mm a pele da cabeça do rato, respectivamente²⁰.
4. Use um alto-falante de campo fechado para realizar a estimulação acústica através de um tubo de plástico de 2 cm com uma ponta em forma de cone. Encaixe a ponta no canal auditivo externo²¹.
   Nota: Assegure-se de que a impedância elétrica nos elétrodos da gravação e da referência seja menos de 3 kOhm (geralmente 1 kOhm). Se a impedância for alta, mude o local de inserção do eletrodo, limpe o eletrodo com álcool ou substitua o eletrodo para evitar alterações na amplitude da onda do PEATE.
5. Para a gravação ABR, gere pips de Tom (3 ms de duração, 1 ms de subida/queda vezes, a uma taxa de 21,1/s, freqüência: 4 – 48 kHz) e apresentá-los em SPLs diminuindo de 90 a 10 dB em 5 \ u201210 dB SPL passos²⁰. Durante esta etapa, as respostas são amplificadas (10.000 vezes), filtradas (0,1 – 3 kHz) e médias (1.024 amostras/nível de estímulo).
   Nota: As ABRs são coletadas para cada nível de estímulo em etapas de 10 dB, com etapas adicionais de 5 dB próximas ao limiar.
6. Em cada frequência, determine o limiar do PEATE, que se refere ao SPL mínimo, resultando em uma gravação de ABR confiável com uma ou mais ondas distinguíveis que podem ser claramente identificadas pela inspeção visual (Figura 1).
   Nota: Geralmente é necessário repetir o processo para baixo SPLs em torno do limiar para garantir a consistência das formas de onda. O limiar de resposta é o menor nível de estímulo no qual a forma de onda pode ser observada, quando uma diminuição de 5 dB levaria ao desaparecimento da forma de onda.

3. processamento de tecido coclear

1. Após a gravação do PEATE, eutanizar os camundongos anestesiados via luxação cervical, decapitá-los, expor a bolha do lado ventral, e abrir com tesoura afiada para obter acesso à cóclea.
2. Usando uma pinça fina, retire os ossos temporais, separe a artéria do estribo, retire o estribo da janela oval e rompa a membrana da janela redonda. Faça um pequeno furo no ápice da cóclea girando suavemente a ponta de uma agulha (13 mm, 27 G).
3. Fixar os ossos isolados com paraformaldeído a 4% (WT/vol) em soro fisiológico tamponado com fosfato de 0,1 M (PBS, pH 7,4) durante a noite a 4 ° c. Utilizando uma pipeta de ponta fina, lave suavemente fixador através dos espaços perilinfática através da aplicação às janelas ovais ou redondas (como uma entrada) e a abertura no vértice (como uma tomada).
   Nota: Algumas proteínas exigem uma duração curta da fixação para evitar a destruição de seus resumos para Immunolabeling. Nesses casos, incubar ossos em paraformaldeído a 4% à temperatura ambiente (RT) por 2 h, dependendo das instruções do fabricante para a imunohistoquímica. A fixação também pode ser realizada através de perfusão cardíaca para remover o sangue coclear, evitando ruídos de fundo devido à coloração não específica em estágios posteriores, particularmente em modelos de camundongo de sinaptopatia coclear.
4. Enxágüe os ossos três vezes por 5 min com 0,1 M de PBS frio para remover paraformaldeído residual. Descalcificar os ossos com ácido etilenodiaminotraacético a 10% (EDTA) ou em RT por 4 h ou a 4 ° c por 24 h através de agitação suave em um agitador horizontal a 20 rpm. O EDTA pode ser refrescado a meio caminho.
   Nota: Os tempos de descalcificação estão sujeitos à concentração de EDTA e às preferências dos usuários. O tecido descalcificado deve manter um certo grau de dureza, o que facilita a manipulação de isolando o todo-montagens cocleares em etapas posteriores. Os ossos temporais podem ser descalcificados em EDTA a 10% com rotação, permitindo que os pesquisadores saiam do laboratório após testes de PEATE e experimentos de fixação. O tempo de descalcificação é flexível dentro do intervalo de 20 a 30 h a 4 ° c.
5. Transfira um osso temporal descalcificado de EDTA para 0,1 M de PBS. Use #3, #5 fórceps de Dumont e a agulha de 27 G para dissecar as regiões cocleares apicais, médias e basais por sua vez e então dissecar a cóclea fora do osso um microscópio estereofónico da dissecção (como descrito previamente²²). Faça uma série de pequenos cortes ao longo do ligamento espiral usando uma lâmina de barbear, e retire a membrana tectorial e a membrana de Reissner (Figura 2).
   Nota: Contanto que a cóclea dissecada esteja intacta, este processo pode ser modificado de acordo com o protocolo usual do operador individual.
6. Dissecar ainda mais o epitélio auditivo remanescente, incluindo o limbus espiral em curvas cocleares individuais (ápice, meio e base com região de gancho) para preparações de montagem inteira.
7. um objetivo do óleo 40x de um microscópio claro, meça o comprimento da membrana basilar com uma escala de 250 μm coloc na ocular, que pode ser ajustada ao longo do estereocílios dos ihcs.
8. Calcule o comprimento de cada turno coclear adicionando todos os comprimentos de segmento (250 μm por segmento) e, concomitantemente, obtenha o comprimento total da membrana basilar, somando os comprimentos de cada turno.
9. Converter o comprimento total da membrana basilar incluindo a região do gancho em uma porcentagem com base na distância do ápice coclear (0% refere-se ao ápice coclear, 100% à base coclear).
10. Converta esta distância na frequência característica coclear utilizando uma função logarítmica (d (%) = 1-156,5 + 82,5 × log (f), com uma inclinação de 1,25 mm/oitava de frequência, onde d é a distância normalizada do ápice coclear em percentagem, f é a frequência em kHz), conforme descrito anteriormente^5,6. Assim a escala de freqüência em uma área correspondente da membrana basilar em cada volta coclear pode ser adquirida.

4. coloração da imunofluorescência

1. Após a dissecção, coloque cada curva coclear em um tubo de centrífuga separado de 2,5 mL e incubar curvas cocleares em 10% de soro de cabra/PBS/0,1% Triton X-100 por 1 h em RT em um rotador.
2. Retire a solução de bloqueio/permeabilização acima de cada tubo usando uma ponta de pipeta de 200 μL um microscópio de dissecção e incubar os espécimes com anticorpos primários diluídos em 5% soro de cabra/PBS/0,1% Triton X-100 durante a noite a 4 ° c em um rotator.
   Nota: Para Immunolabeling de fitas sinápticas cocleares, use a proteína de ligação 2 IgG1 do rato do marcador pré-sinaptic do anti-carboxyl-terminal (CtBP2, etiquetando o domínio de B da proteína do andaime de ribeye, 1:400) e o receptor pós-sináptica do anti-glutamate do rato do marcador 2 IgG2a (GluR2, rotulando uma subunidade do receptor AMPA, 1:200)²³.
3. Enxague três vezes por 5 min com PBS a 0,1 M de frio para remover os anticorpos primários residuais e incubar os espécimes com anticorpos secundários diluídos em 5% de soro de cabra/PBS/0,1% Triton X-100 em RT para 2 \ u20123 h na escuridão em um rotador.
   Nota: Prepare misturas secundárias apropriadas do anticorpo usando a cabra anti-rato Alexa fluor 568 (IgG1, 1:500) e o anti-rato da cabra Alexa fluor 488 (IgG2a, 1:500), que são complementares aos anticorpos preliminares usados na etapa 4,2. Para melhorar a eficiência de rotulagem para fitas sinápticas, recomendamos a seleção de anticorpos secundários específicos. Alguns laboratórios estendem a incubação com anticorpos secundários para aumentar o Immunolabeling GluR2²⁴.
4. Enxague três vezes por 5 min com 0,1 M de PBS para remover anticorpos secundários residuais e transfira os espécimes de tubos de centrifugação de 2,5 mL para placas de 35 mm contendo 0,1 M de PBS.
5. Coloc uma gota do meio de montagem que contem 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) na corrediça e transfira os espécimes de PBS ao meio de montagem. Coloque uma borda de uma lamínula no slide e solte para deixar a lamínula cair suavemente.
   Nota: Para garantir que as células ciliadas estejam viradas para cima e que nenhuma dobra ou torção de espécimes cocleares ocorra durante o procedimento, monte espécimes cocleares um microscópio de dissecção estéreo.
6. Coloque os slides em uma caixa de slides a 4 ° c durante a noite para deixar slides secos e, em seguida, imagem um microscópio confocal laser.

5. avaliação morfológica das sinapses da fita coclear

1. Slides de imagem usando um microscópio confocal com três lasers — um diodo UV de 405 nm, um laser de argônio de 488 nm, e um laser de estado sólido (DPSS) de 561 nm diodo-bombeado para excitar DAPI (espectro de excitação 409 – 464 nm), Alexa fluor 488 (espectro de excitação 496 – 549 nm) e Alexa fluor 568 (Espectro de excitação 573 – 631 nm), respetivamente.
2. Adquira pilhas z confocais a uma distância de 8 μm de cada curva coclear usando uma lente de imersão de óleo de alta resolução de 63x.
   Nota: Uma vez definidos, todos os parâmetros para digitalizar fotomicrografias devem ser salvos e aplicados uniformemente a todos os slides.
3. Para contagens do punctum sináptica, ajuste as z-pilhas (tamanho da etapa de 0,3 μm) para estender o comprimento inteiro dos ihcs, assegurando desse modo que todo o puncta sináptica possa ser imaged.
4. Mesclar as imagens contendo puncta em uma pilha z para obter a projeção do eixo z e importar para o software de processamento de imagem.
5. Divida contagens totais sinápticas em cada z-Stack em regiões de frequência específicas pelo número de IHCs (igual às contagens manuais nucleares de DAPI) para calcular o número de puncta sináptica para cada IHC. Em cada região de frequência específica, a média de todas as puncta sináptica em três imagens de diferentes campos microscópicos contendo 9 – 11 IHCs.
   1. Delinear a região de interesses (ROIs) incluindo as regiões basolateral de cada IHC usando o botão de seleções à mão livre. Use a função Measure para quantificação automática de puncta, e a função de divisor de águas para distinguir entre pontos adjacentes próximos.
   2. Após cada contagem automatizada, realize inspeções visuais com correções manuais para garantir que a contagem de puncta seja confiável.
      Nota: Os experimentadores devem permanecer cegos para saber se o slide é do ápice, do meio ou da curva basal da cóclea.
6. Avalie visualmente a estrutura e a distribuição sináptica, para isolar manualmente ihcs individuais de seus vizinhos pela ferramenta do lápis ( M) para visualizar melhor a arquitetura citoesquelética e a localização sináptica.
7. Para inspecionar a justaposição de fitas pré-sinápticas (CtBP2) e pós-sináptica receptor patches (GluR2), extraia o espaço VOXEL ao redor da fita pela ferramenta Letreiro Retangular e isolar fita individual por cultura. Através de clicar em imagem ≫ tamanho da imagem, adquira uma matriz miniatura dessas projeções em miniatura, que podem ser usadas para identificar sinapses pareadas (apareceram como pares justapostos de Puncta CtBP2-positive e GluR2-positive) versus órfãs fitas (com falta de manchas pós-sinápticas do receptor de glutamato) (Figura 3).
   Nota: As sinapses cocleares normais aparecem como Immunolabeling combinado da fita pré-sináptica dentro da pilha de cabelo (CtBP2) e do remendo pós-sináptica do receptor do glutamato no terminal do nervo auditivo (anti-GluR2)²⁵. Alguns laboratórios usam projeções confocais em conjunto com modelagem 3D para quantificar o tamanho do patch sináptico ou volume^26,27. Antes da perda significativa de sinapses da fita, as fitas que exibem mudanças no tamanho ou sem remendos do receptor do glutamato emparelhado são prováveis indicativas da deficiência orgânica sináptica^27,28.

6. avaliação funcional de sinapses da fita coclear

1. Colete todas as ondas do PEATE para cada estímulo de frequência apresentado em um SPL de 90 dB para a análise das amplitudes da onda I do estímulo abr.
   Nota: Estudos neurofisiológicos e morfológicos demonstraram que as fibras de baixa taxa espontânea, de alto limiar, são especialmente vulneráveis ao envelhecimento e à exposição ao ruído^29,30. Embora a simples perda de sinapses da fita não possa afetar os limiares do PEATE, geralmente resulta em reduções significativas nas amplitudes da onda I do PEATE, pois esses aferentes, incluindo baixa taxa espontânea, fibras de alto limiar e alta taxa espontânea, as fibras de baixo limiar contribuem fortemente para as atividades somadas das fibras nervosas cocleares^28,29,31. Uma intensidade de estímulo de 90 dB SPL é selecionada aqui.
2. Determine a amplitude da onda I de pico a pico usando um programa de análise offline (Figura 4). Cada onda I no teste ABR consiste em uma deflexão positiva inicial (p) e a deflexão negativa (n) subsequente. A amplitude da onda I do PEATE é definida como a diferença de voltagem entre IP (o pico positivo da onda I) e in (o pico negativo da onda I)²⁹.
   Nota: Em condições patológicas, a sinaptopatia coclear pode ser determinada com base nas amplitudes do estímulo da onda I do PEATE, que refletem as respostas somadas do início dos sgns evocados pelo som. No entanto, a sensibilidade coclear que não está comprometida devido à disfunção da OHC é um pré-requisito para esse método.

Results

Os testes auditivos de ABR foram realizados para camundongos 10 C57BL/6J (8 semanas de idade) anestesia. Os ABRs foram eliciados usando estímulos de burst de Tom em 4, 8, 16, 32 e 48 kHz. O limiar auditivo de cada animal foi detectado visualmente por distinguir pelo menos uma forma de onda clara no PEATE. Todos os camundongos exibiram limiares de PEATE em resposta a rajadas de Tom, variando entre 25 e 70 dB NPS dependendo da frequência do estímulo. Nossos resultados indicaram que o limiar auditivo foi menor em 16 kHz (

Discussion

Desde que o synaptopathy coclear foi caracterizado primeiramente em ratos adultos com um deslocamento provisório do ponto inicial (TTS) induzido pelo ruído da faixa de oitava de 8 \ u201216 kHz em 100 dB SPL para 2 h³¹, os investigadores investigaram cada vez mais os efeitos do synaptopathy em vários mamíferos, incluindo macacos e seres humanos^32,33. Além da exposição ao ruído, várias outras condições têm sido associadas à sinaptopatia coc...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloridrato de cetamina	Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China	H35020148	100 mg/kg
Cloridrato de xilazina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	X-1251	10 mg/kg
TDT aparelho de fisiologia	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, EUA	Sistema de Fisiologia Auditiva III
Software SigGen/BioSig	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, EUA	Sistema de Fisiologia Auditiva III
Pad	Pet Fun	11072931136
Pinça Dumont 3#	Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canadá	0203-3-PO
Pinça Dumont 5#	Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canadá	0209-5-PO
Microscópio de dissecção estéreo	Nikon Corp., Tóquio, Japão	SMZ1270
Soro de cabra	ZSGB-BIO, Pequim, China	ZLI-9021
Receptor anti-glutamato 2, extracelular, clone 6C4	Millipore Corp., Billerica, MA, EUA	MAB397	mouse
Camundongo Purificado Anti-CtBP2	BD Biosciences, Billerica, MA, EUA	612044	camundongo
Alexa Fluor 568 cabra anti-rato IgG1anticorpo	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EUA	A21124	cabra
Alexa Fluor 488 cabra anti-rato IgG2a anticorpo	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EUA	A21131	cabra
Meio de montagem contendo DAPI	ZSGB-BIO, Pequim, China	ZLI-9557
Microscopia fluorescente confocal	Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha	TCS SP8 II
Image Pro Plus	software Media Cybernetics, Bethesda, MD, EUA	versão 6.0
Otoscópio de bolso de diagnóstico profissional	Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Xangai, China	HS-OT10
Eletrodo de agulha	Amizade Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an, China	1029	20 mm, 28 G
Campo fechado palestrante	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, EUA	CF1