Isolando a maligna e as células B não-maligna do lck:eGFP Zebrafish

Resumo

Zebrafish transgênicos lck:eGFP express GFP altamente em linfócitos T e têm sido usados para estudar o desenvolvimento de células T e a leucemia linfoblástica aguda. Esta linha pode ser usado para células de estudo B, que expressam lck em níveis inferiores. Este protocolo descreve a purificação das malignas e não-malignas de células B de lck:eGFP zebrafish.

Resumo

Peixe-zebra (Danio rerio) é um poderoso modelo para estudar o desenvolvimento de linfócitos. Como mamíferos, d. rerio possuem um sistema imune adaptativo que inclui linfócitos B e T. Estudos de zebrafish linfopoiese são difíceis porque os anticorpos reconhecendo d. rerio marcadores de superfície celular geralmente não estão disponíveis, complicando o isolamento e caracterização de populações de linfócitos diferentes, incluindo B-linhagem células. Linhas transgénicas com linhagem específicas fluoróforo expressão são frequentemente utilizadas para contornar esse desafio. A linha de transgênicos lck:eGFP tem sido usada para estudar o desenvolvimento de células T d. rerio e também tem sido utilizada para o modelo de desenvolvimento de células T e a leucemia linfoblástica aguda (T-ALL). Embora lck:eGFP peixe têm sido amplamente utilizados para analisar a linhagem T-, eles não foram usados para estudar as células B. Recentemente, descobrimos que muitos zebrafish B células também expressam lck, embora em níveis inferiores. Consequentemente, lck:eGFP B células da mesma forma expressam níveis baixos de GFP. Baseado nesta constatação, desenvolvemos um protocolo para purificar as células B-linhagem de lck:eGFP zebrafish, que relatamos aqui. Nosso método descreve como utilizar um classificador fluorescente-ativado da pilha (FACS) para purificar as células B de peixe lck:eGFP ou linhas relacionadas, tais como double-transgénicos, rag2:hMYC; lck:eGFP peixe. Nestas linhas, células B, as células B particularmente imaturas, GFP expresso em níveis baixos, mas detectáveis, permitindo que eles sejam distintos de células T, que expressam a GFP altamente. As células B podem ser isoladas da medula, timo, baço, sangue ou outros tecidos. Este protocolo fornece um novo método para purificar as células B d. rerio , permitindo estudos focados em temas como o desenvolvimento de células B e linfócitos B malignidades.

Introdução

Zebrafish oferecer atributos poderosos, como manipulability genética, alta fecundidade, translucidez óptico e desenvolvimento rápido que facilitam o desenvolvimento de vertebrados estudando usando abordagens genéticas. Estas vantagens, juntamente com os recursos compartilhados de teleósteos e mamíferos hematopoiese, fazem d. rerio ideal para análises in vivo da função linfopoiese e linfócitos, de sua aparência mais antiga em larvas em toda a idade adulta. Desenvolvimento de sangue no zebrafish assenta bem conservados processos genéticos que são compartilhados com mamíferos, e estes se prolongam para o sistema imune adaptativo. Além disso, os mecanismos molecu....

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo zebrafish foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) no centro de Ciências da saúde Universidade de Oklahoma.

1. isolando B não-malignas e linfócitos T do transgênico lck:eGFP peixe

1. Anestesia o peixe usando metanosulfonato de 0,02% (MS-222) no sistema de água de peixes.
2. Examine o peixe de 2-6 meses de idade para thymi fluorescente, que estão localizados no aspecto dorsomedial da cavidade branquial de zebrafish e outros teleósteos¹⁴. Use um microscópio de epifluorescência (470/40 de comprimento d....

Resultados

Nós usamos a citometria de fluxo para analisar e FACS para isolar a GFP^Eis e GFP^Oi células do timo, medula renal e baço de lck:eGFP zebrafish transgênicos. Análise de peixe 3 meses revelou que o Timo contida principalmente os linfócitos GFP⁺ . Células GFP⁺ em grande parte estavam confinadas ao portão linfoide anteriormente descrito pelo Traver et al.¹⁷. Duas populações distintas de GFP⁺ , GFP^Eis

Discussão

Desenvolvemos e fornecer um protocolo para isolar as células B de lck:eGFP zebrafish transgênicos, adicionando isso para outros modelos de d. rerio com B-linhagem rótulos^3,4. Surpreendentemente, a identificação de GFP^Eis B células nesta linha passou despercebida desde sua descrição em 2004. Geralmente, lck é considerado de células T específicas⁶, mas os estudos recentes encontraram expressão inesperada.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
35 µ m mesh	Sefar Filter technology	7050-1220-000-13
5 mL Tubo de poliestireno de fundo redondo com tampa de filtro de célula	Falcon Corning Marca	352235
Tubo cônico de 50 mL	VWR international	525-0448
AZ APO 100 Microscópio fluorescente	Nikon
Cytoflex	Beckman Coulter
DS-Qi1MC camara	Nikon
Etil 3-aminobenzoato de metanassulfonato; MS-222	Sigma	E-10521
FACSJazz	BD Biosciences
Soro fetal bovino	Thermo Fisher	10437028
FlowJo v10.2	FlowJo, LLC
lck:eGFP			Ver Langeneu et al., 2004
Software NIS Elements	Nikon	Versão 4.13
Penicilina-Estreptomicina	Sigma	P4333
Homogeneizadores de microtubos de pilão	Ciências de Microscopia Eletrônica	64788-20
Pippetes
rag2:hMYC-ER			Veja Gutierrez et al., 2011
RPMI Media 1640 1x	Life Technologies	11835-030

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