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Artigo de método

Um novo modelo Enteroid epitelial humana de enterocolite necrosante

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DOI:

10.3791/59194

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10 de abril de 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Northwestern University, 2Division of Pediatric Surgery, Ann & Robert H. Lurie Children's Hospital of Chicago

Neste artigo

Resumo

Enteroids estão emergindo como um novo modelo no estudo de doenças humanas. O protocolo descreve como simular um modelo enteroid de humano enterocolite necrosante usando lipopolissacarídeo (LPS) tratamento do enteroids gerados a partir de tecido neonatal. Enteroids coletados demonstram alterações inflamatórias parecido com aqueles vistos em enterocolite necrosante humana.

Resumo

Enterocolite necrosante (NEC) é uma doença devastadora de recém-nascidos. É caracterizada por várias alterações fisiopatológicas no epitélio intestinal humana, levando ao aumento da permeabilidade intestinal, prejudicada a restituição e aumentou a morte celular. Embora existam vários modelos animais de NEC, resposta a lesões e intervenções terapêuticas pode ser altamente variável entre as espécies. Além disso, é eticamente desafiante para estudar a fisiopatologia da doença ou novos agentes terapêuticos diretamente em seres humanos, especialmente crianças. Portanto, é altamente desejável para desenvolver um novo modelo de NEC usando tecido humano. Enteroids são organoids 3-dimensional derivado de células epiteliais intestinais. Eles são ideais para o estudo das interacções fisiológicas complexas, sinalização celular e defesa do hospedeiro-patógeno. Este manuscrito, descrevemos um protocolo que enteroids de culturas humanas depois isolar células-tronco intestinais de pacientes submetidos à ressecção intestinal. As células da cripta são cultivadas em meios que contêm fatores de crescimento que estimulam a diferenciação a várias nativo de tipos de célula do epitélio intestinal humano. Estas células são cultivadas em uma mistura sintética, colágenas de proteínas que servem como um andaime, imitando a extracelular da membrana basal. Como resultado, enteroids desenvolver polaridade apical-basolateral. Co-administração de lipopolissacarídeo (LPS) em mídia provoca uma resposta inflamatória no enteroids, levando a histológica, genética e alterações de expressão de proteínas semelhantes aos observados em humano NEC. Um modelo experimental de NEC usando tecido humano pode fornecer uma plataforma mais precisa para drogas e tratamento de teste antes de testes em humanos, como nós nos esforçamos para identificar uma cura para esta doença.

Introdução

Enteroids humanas são um ex vivo sistema de cultura 3-dimensional gerado a partir de células-tronco isoladas de criptas intestinais de amostras de tecido intestinal humana. Este modelo inovador foi pioneira por Hans Clevers et al. em 2007, após a descoberta de células-tronco Lgr5 + em criptas do intestino delgado em ratos1. Seu trabalho lançou as bases para o estabelecimento de um ex vivo cultura epitelial intestinal de vários tipos de células que podem ser passadas sem alterações significativas de genética ou fisiológica2. Desde essa descoberta, enteroids têm sido usados como um novo modelo para o estudo da fisiologia digestiva normal e da fisiopatologia de doenças intestinais como a doença inflamatória intestinal, interações patógeno-hospedeiro e medicina regenerativa2.

O uso de enteroids como um ex vivo de modelo para o estudo da fisiopatologia intestinal tem várias vantagens sobre técnicas alternativas. Há várias décadas, modelos animais e linhas celulares de câncer-derivado intestinal imortalizado tem sido costumava estudar fisiologia intestinal3,4,5. Culturas de célula única não representam a diversidade de tipos de células presentes no epitélio intestinal normal, assim, falta uma célula para outra-conversas cruzadas e segmento-especificidade na expressão da proteína, sinalização e doença induzida por patógeno6. Células-tronco em enteroids diferenciar em principais tipos de células epiteliais como enterócitos, células de Paneth, células de goblet, células enteroendócrina e mais3. Eles apresentam polaridade, realizar as funções de transporte epitelial e permitam a especificidade de segmento intestinal6. Desde que enteroids pode recapitular os vários tipos de células do epitélio intestinal humano, eles são capazes de superar essa limitação reconhecida de sistemas baseados em células de câncer. Ao longo do tempo, derivados de linhagens celulares são subcloned e evoluem para apresentam maior diversidade na proteína expressão e localização3. Pelo contrário, enteroids podem ser passadas sem alterações significativas de genética ou fisiológica2. Embora existam vários modelos animais para o NEC, resposta a lesões e intervenções terapêuticas pode ser altamente variável entre as espécies. Como resultado dessas limitações, derivada de modelos animais de terapêutica falham 90% do tempo quando testado em ensaios em humanos devido a diferenças na toxicidade ou eficácia3. Enteroids servir como modelos pré-clínicos promissoras que podem superar estas deficiências, levando a um melhor entendimento da fisiopatologia intestinal complexa e, portanto, mais bem sucedidas e rentáveis inovações terapêuticas. Há também evidências recentes que a idade do tecido que um enteroid é gerada a partir permanece biologicamente importantes7. Isto é um detalhe especialmente importante para nosso modelo desde enteroids são gerados a partir de tecido neonatal, mantendo assim a relevância fisiológica para portadores de NEC.

O utilitário de enteroids como modelos de doenças humanas continua a expandir-se, na esperança de encontrar curas para condições severas e penetrante. Enterocolite necrosante (NEC) é uma doença intestinal devastadora dos neonatos, caracterizada por necrose intestinal e frequentemente leva à perfuração da parede do intestino, septicemia e morte8. Devido à complexa e multifatorial fisiopatologia da NEC, o mecanismo exato da doença ainda não foi totalmente elucidado; no entanto, aumento da permeabilidade intestinal tem sido claramente implicado no processo doença8. Dado que o estudo da NEC e potenciais agentes terapêuticos é eticamente desafiador em seres humanos, especialmente crianças, que é altamente desejável utilizar um modelo de enteroid biologicamente relevantes da NEC usando tecido humano neonatal. Até agora, enteroids tem um papel limitado no estudo da NEC. Este protocolo descreve o uso de enteroids, derivado de amostras de tecido intestinal humana, como um romance ex vivo de modelo para o estudo da enterocolite necrosante.

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Protocolo

Foi obtida a aprovação do Conselho de revisão institucional (IRB #2013-15152) para coleta de amostras de tecido de pacientes submetidos à ressecção intestinal, Ann e do Robert H. Lurie crianças Hospital de Chicago, Chicago, IL. Todos os protocolos foram realizados em conformidade com as orientações institucionais e nacionais e normas para o bem-estar humano. Consentimento informado dos pais foi requerido e obtido antes da coleta de amostra em todos os casos.

1. preparação do reagente

  1. Prepare a solução stock de meios de cultura para a coleção inteira de tecido: 1L de Dulbecco modificado águia médio (DMEM), 110 mL de soro Fetal bovino (FBS), 11 mL de penicilina-estreptomicina (concentração final 1%) e 1,1 mL de insulina filtro esterilizado (concentração final 0,1%.) Solução estoque de loja a 4 ° C.
  2. Preparar o Buffer Chelating #1: 30 mL de meio de cultura (como descrito no ponto 1.1), 600 µ l de 0,5 M o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (concentração final 10 mM), 300 µ l de gentamicina (concentração final 1%) e 60 µ l de anfotericina B (0,2% de concentração final). Solução estoque de loja a 4 ° C.
  3. Preparar o Buffer Chelating #2: 30 mL de meio de cultura (como descrito no ponto 1.1), 300 µ l de 0,5 M EDTA (concentração final 5mM), 300 μL de gentamicina (concentração final 1%) e 60 µ l de anfotericina B (0,2% de concentração final). Solução estoque de loja a 4 ° C.
  4. Preparar a mídia de Minigut humana: 41,4 mL de DMEM/F-12, 5 mL de FBS (final 10%), 500 µ l de penicilina-estreptomicina (concentração final 1%), 500 µ l de L-glutamina (concentração final 1%), 500 µ l de gentamicina (concentração final 1%), 100 µ l de anfotericina B (final concentração 0,2%), 500 µ l de 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfônico (HEPES) (concentração final 10 mM), 500 µ l de 100 x N-2 complementar e 1 mL de 50 x B-27 suplemento menos vitamina A para um volume total de 50 mL. Solução estoque de loja a-20 ° C.
  5. Preparar humana completa de mídia de Minigut: 10 mL de humano Minigut Media (preparado no 1.4), 10 µ l de Wnt3a de 100 µ g/mL (concentração final de 100 ng/mL), 10 µ l de 100 µ g/mL Noggin (concentração final de 100 ng/mL), 10 µ l de R-Spondin de 1 mg/mL (concentração final de 1 µ g/mL) , 10 µ l de 500 µ g/mL, fator de crescimento epidérmico (EGF) (concentração final de 50 ng/mL), 10 µ l de 1 M N-acetilcisteína (concentração final 1 mM), 10 µ l de 10mm Y-27632 (concentração final de 10 µM), 10 µ l de 500 µM A-83 (concentração final 500 nM), 10 µ l de SB202190 (final de 10 mM concentração 10 µM), 100 µ l de 1 M de nicotinamida (concentração final 10 mM) e 1 µ l de 100 µM [leu] 15-gastrina 1 (concentração final de 10 nM). Total de volume de 10 mL. Solução estoque de loja a 4 ° C.
    Nota: Soluções devem ser usadas dentro de 48 h.

2. a cripta isolamento e chapeamento de todo tecido

  1. No momento da coleção na suíte operativa, coloca a amostra de tecido intestinal pequeno humano no de frio Dulbecco fosfato Buffered Saline (DPBS). Lave o espécime em DPBS frio até limpo de fezes e sangue. Espécime de loja a 4 ° C em meio RPMI 1640 até que esteja pronto para isolamento de cripta.
    Nota: Tecido não pode ser armazenado mais de 24 h.
    1. Certifique-se que o espécime está livre de fezes e sangue. Usando tesouras de dissecação delicadas, retire qualquer excesso gordo ou cirúrgicos clipes/grampos etc. Pese a amostra.
      Nota: Apontar para um pedaço de aproximadamente 0,75-2.5 g.
  2. Cortar a amostra em pedaços de 0,5 cm e coloque em 30 mL de quelantes Buffer #1 (como preparado na etapa 1.2).
    1. Agitar em velocidade baixa por 15 min a 4 ° C.
    2. Tecido de filtrar através de filtro de célula 100 µm e descartar fluir.
  3. Adicione o tecido a 30 mL de quelantes Buffer #2 (como preparado na etapa 1.3).
    1. Agitar em velocidade baixa por 15 min a 4 ° C.
    2. Filtro de tecido através de um filtro de célula de 100 µm e descartar fluir.
  4. 500 mL de matriz de membrana basal no gelo para uso na etapa 2.8 de descongelar.
  5. Adicione o tecido a 10 mL de DMEM frio em um tubo cónico de 50 mL e agitar vigorosamente à mão por 10 s.
    1. Filtrar através de um filtro de célula de 100 µm e coletar o fluxo através de (rótulo #1). Mantenha o tubo #1 no gelo.
    2. Adicione o tecido para outro 10 mL de DMEM frio em um tubo cônico separado de 50 mL e agitar vigorosamente à mão por 10 s.
    3. Filtrar através de um filtro de célula de 100 µm e coletar o fluxo através de (#2).
    4. Repita duas vezes adicionais até que existam quatro tubos cónicos com fluxo através de (tubos etiquetados #1-4).
  6. Filtro do tubo #1 solução através de um 100 µm célula Coagem e transferência fluir em tubo cônico de 15 mL (rótulo #1). Repita para #2-4.
    1. Centrifugar tubos de 15 mL #1-4 200 x g por 15 min a 4 ° C.
  7. O capuz de fluxo laminar, remover o sobrenadante de tubos #1-4 e descarte. Evite perturbar a nuvem de tecido imediatamente acima a pelota, mesmo que isso signifique deixar alguns sobrenadante para trás.
    1. Pipetando lentamente, misture a pelota com a sobrenadante em tubos #1-4 de sobra.
    2. Transfira a mistura de tubos #1-4 em um tubo cônico de único mL 2.
    3. Centrifugar o tubo cônico a 200 x g por 20 min a 4 ° C.
  8. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 µ l de matriz de membrana basal.
    Nota:     manter a matriz da membrana basal no gelo em todos os momentos e trabalhar rapidamente para as próximas etapas. Este produto se polimeriza rapidamente à temperatura ambiente.
    1. Aplique 50 µ l de suspensão de matriz de membrana de amostra/porão no centro de um poço em uma placa de 24. Isto deve aparecer em forma de cúpula.
      Nota: Uso de pontas de pipetas refrigerados auxilia na transferência mais suave da suspensão, minimizando a polimerização.
    2. Repita 9 vezes para encher 10 poços totais.
  9. Coloque a placa de 24 em 37 ° C, 5% CO2 incubadora durante 30 min permitir a polimerização.
  10. Adicione 500 µ l de humano Minigut mídia completa (como preparado na etapa 1.5) para cada poço. Substitua a cada 2 dias.
  11. Recolha enteroids após 5-10 dias, quando a brotação é visualizada. Consulte as etapas 4 e 5 para obter instruções de coleta.

3. indução de NEC Experimental

  1. Adicione 10 µ l de 5 mg/mL de lipopolissacarídeo (LPS) a 500 µ l de humano Minigut mídia completa (como preparado na etapa 1.5) em cada poço no dia 0. Substitua a cada 2 dias até coleção.

4. preparação para a incorporação de parafina

  1. Remova cuidadosamente a mídia.
    1. Adicionar 1 mL de PBS e pipetar suavemente para cima e para baixo dissolver a matriz da membrana basal com cuidado para não lisar os enteroids.
    2. Centrifugue a mistura de PBS/enteroid a < x 300 g por 5 min de pelotas e remover PBS.
  2. Adicione 4% paraformaldeído para fixar a temperatura ambiente durante 1 h.
  3. Centrifugar a < x 300 g por 5 min de Pelotas, e em seguida remover PBS.
    1. Lave delicadamente com 1 mL de PBS e centrifugar a < x 300 g por 5 min de Pelotas, e em seguida remover PBS.
    2. Repita a etapa 4.3.1.
  4. Derreta um volume suficiente do tecido processamento gel (cerca de 300 µ l) colocando a quantidade desejada em um tubo cônico e aquecimento-lo em uma incubadora de banho seco a 65 ° C para 3-10 min até o líquido.
    1. Adicione o tecido gel para a pelota de processamento e misture delicadamente.
    2. Em uma lamela, coloque um pequeno anel de clonagem.
    3. Pipete o tecido mistura de gel e enteroid de processamento em um anel de clonagem montado sobre uma lamela.
  5. Permitir que o tecido processamento a mistura de gel e enteroid para solidificar a 4 ° C, durante 1 h.
    1. Submergi o anel clonagem com mistura solidificada em 70% etanol em preparação para a incorporação de parafina.

5. Enteroid coleção para extração de proteínas e RNA

  1. Remova cuidadosamente o humano Minigut completa de mídia de cada poço.
  2. Adicione 1 mL de PBS e pipetar suavemente para cima e para baixo dissolver a matriz da membrana basal. Tenha cuidado para não se dissociam a enteroids.
    1. Coloque a mistura de PBS/enteroid em um tubo cônico estéril de 2 mL.
    2. Centrifugar a < x 300 g por 5 min granular.
    3. Remova cuidadosamente a PBS, tomando cuidado para não remover a enteroids.
  3. Repita a série passo 5.2 mais duas vezes.
  4. Congele em-80 ° C até que esteja pronto para proteínas e/ou extração de RNA.
  5. Realize o isolamento de expressão e proteína de gene da enteroids utilizando técnicas de mancha ocidental e bem-estabelecida qRT-PCR.

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Resultados

Imediatamente após o chapeamento, criptas intestinais recém isoladas aparecem como hastes alongadas. Horas depois, o enteroid terá uma aparência redonda (Figura 1um). Nos próximos dias, o enteroids vai começar formando esferas como visto na Figura 1b. Brotamento deve ocorrer entre 5-10 dias (Figura 1c) e enteroid coleção deve ocorrer na época.

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Discussão

Este romance ex vivo enteroid intestinal humano modelo serve como um método útil para o estudo da disfunção da barreira intestinal em (NEC) de enterocolite necrosante. Os métodos de processamento de enteroid aqui apresentados foram adaptados do trabalho anterior de DRS Misty Good, Michael Helmrath e do Jason Wertheim11,de10,12.

Detalhes em torno de toda a coleção de tecido e sincronismo de isolamento ...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo Instituto de saúde Instituto Nacional de Diabetes, digestivo e renal doença Grant (K08DK106450) e o Jay Grosfeld prêmio da associação americana de cirurgia pediátrica para C.J.H.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
4% de paraformaldeídoThermoFisherAAJ19943K2
A-83R& D Tocris2939/10
Anfotericina BThermoFisher15290026
suplemento B-27 menos Vitamina AThermoFisher17504-044
Matriz de Membrana Embasada (Matrigel)CorningCB-40230C
DMEM / F-12ThermoFisherMT-16-405-CV
Dulbecco ' s Modified Eagle Medium (DMEM)ThermoFisher11-965-118
Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (DPBS)ThermoFisher14190-144
Fator de crescimento epidérmico (EGF)SigmaE9644-.2MG
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)SigmaEDS-500G
Soro Fetal Bovino (FBS)Gemini Bio-Pro100-125
GentamicinaSigmaG5013-1G
GlutaMAX ( L-glutamina)ThermoFisher35050-061
InsulinaSigmaI9278-5mL
[leu] 15-gastrina 1SigmaG9145-.1MG
Lipopolissacarídeo (LPS)SigmaL2630-25MG
N-2 suplementoThermoFisher17502-048
N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano sulfônico ácido (HEPES)ThermoFisher15630-080
N-acetilcisteínaSigmaA9165-5G
NicotinamidaSigmaN0636-100G
NogginR& D Systems INC6057-NG/CF
Penicilina-EstreptomicinaThermoFisher15140-148
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)SigmaP5368-5X10PAK
RPMI 1640 MédioInvitrogen11875093
R-EspondinaPEPROTECH INC120-38
SB202190SigmaS7067-5MG
Gel de processamento de tecidos (Histogel)ThermoFisher22-110-678
Wnt3aR& D Systems INC5036-WN-010
Y-27632SigmaY0503-1MG

Referências

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Reimpressões e permissões

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Enteroides HumanosModelo de Enterocolite NecrosanteC lulas Tronco IntestinaisIsolamento de CriptasTratamento com LPSMatriz de Membrana BasalMeio para Minintestino HumanoReceptor Semelhante ao Toll 4An lise por qRT PCRWestern Blotting
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