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Artigo de método

Intramucosal inoculação de células de Carcinoma de células escamosas em ratos para perfil imune de Tumor e tratamento avaliação de resposta

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DOI:

10.3791/59195

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22 de abril de 2019

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1Department of Radiation Oncology, University of Colorado Denver - Anschutz Medical Campus, 2Department of Anesthesiology, University of Colorado Denver - Anschutz Medical Campus, 3Division of Radiology, University of Colorado Denver - Anschutz Medical Campus

Neste artigo

Resumo

Aqui nós apresentamos um método reprodutível para desenvolver um modelo murino ortotópico de cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas. Tumores demonstram clinicamente relevantes características histopatológicas da doença, incluindo necrose, pobre diferenciação, metástases nodais e infiltração imune. Tumor-rolamento ratos desenvolvem sintomas clinicamente relevantes, incluindo disfagia, deslocamento da mandíbula e perda de peso.

Resumo

Cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (HNSCC) é uma doença debilitante e mortal com uma elevada prevalência de recidiva e falha do tratamento. Para desenvolver melhor estratégias terapêuticas, compreensão tumor microenvironmental fatores que contribuem para a resistência de tratamento é importante. Um impedimento importante para compreender os mecanismos da doença e melhorar a terapia tem sido a falta de linhas de celulares murino que se assemelham a natureza agressiva e metastática da HNSCCs humanas. Além disso, a maioria dos modelos murino empregar implantes subcutâneos de tumores que não possuem características fisiológicas importantes da região da cabeça e pescoço, incluindo alta densidade vascular e extensa vascularização linfática residente flora da mucosa. O objetivo deste estudo é desenvolver e caracterizar um modelo ortotópico de HNSCC. Nós empregamos duas linhas de células geneticamente distintas de murino e tumores estabelecidas na mucosa bucal de ratos. Otimizamos a métodos de digestão tumor colagenase-baseado para a recuperação ideal de células únicas de tumores estabelecidas. Os dados aqui apresentados mostram que ratos desenvolvem tumores altamente vascularizados que metastatizam para linfonodos regionais. Análise de citometria de massa Multiparamétrico monocelulares mostra a presença de diversas populações imunes com células mieloides, que representa a maioria de todas as células do sistema imunológico. O modelo proposto neste estudo tem aplicações em biologia do câncer, imunologia de tumor e desenvolvimento pré-clínico da novela terapêutica. A semelhança do modelo ortotópico para características clínicas da doença humana irá fornecer uma ferramenta para tradução melhorada e melhorou os resultados dos pacientes.

Introdução

HNSCC é a quinto mais comum malignidade globalmente, com mais de 600.000 pacientes diagnosticados anualmente1. Apesar do tratamento agressivo, envolvendo quimioterapia e radioterapia (RT), a taxa global de sobrevivência (OS) para pacientes com HNSCC sem infecção pelo papilomavírus humano (HPV) continua a ser inferior a 50% após 5 anos2. Isto é atribuído em grande parte para um microambiente do tumor altamente complexo como tumores podem se originar de vários sítios anatômicos distintos dentro da região de cabeça e pescoço, incluindo a mucosa bucal, língua, assoalho da boca, cavidade nasal, cavidade oral, faringe, orofaringe e hipofaringe. Além disso, a região da cabeça e pescoço é altamente vascularizada e contém quase a metade de todos os nós de linfa no corpo3. A maioria dos estudos investigando a biologia de tumor de cabeça e pescoço contam com modelos de tumor na região do flanco. Tais modelos podem oferecer insights sobre mecanismos intrínsecos tumor, mas a falta do microambiente nativo de cabeça e pescoço pode ter impacto significativamente o potencial translacional de tais achados. Um método que tem sido usado para induzir tumores orais é através da exposição ao carcinógeno 9,10-dimetil-1,2-benzanthracene (DMBA)4. No entanto, este método está associado com um processo demorado, induz tumores em ratos e hamsters, mas não em ratos, e os tumores resultantes não possuem muitas das características histológicas de diferenciada SCCs5,6. A introdução do carcinogen4-nitroquinoleína 1-óxido (4-NQO), um derivado hidrossolúvel quinolona, resultou em tumores orais do rato quando aplicado por via oral, mas também sofria de longos tempos de exposição (16 semanas) e um número limitado tomar taxa dentro e entre lotes de ratos7,8,9. A fim de desenvolver modelos clinicamente relevantes, vários grupos utilizaram modelos geneticamente modificados, que envolve a manipulação dos oncogenes motorista ou genes supressores de tumor, incluindo TP53, TGFB, KRAS, HRAS e SMAD410. Estes modelos podem oferecer insights sobre tumores com genes de motorista conhecido mas não recapitular a complexa heterogeneidade da HNSCCs humanas.

Neste trabalho, vamos demonstrar a viabilidade de realizar uma intramucosal inoculação de células de carcinoma de células escamosas em camundongos. Células inoculadas se desenvolvem em tumores agressivos dentro de 1 semana da injeção. Semelhante a HNSCCs humanas, os tumores metastatizam para os linfonodos regionais. Podemos caracterizar características clínicas e histológicas da doença e fornecer insights sobre o microambiente imune do tumor. Propomos que este modelo ortotópico de HNSCC tem aplicações em biologia do câncer, imunologia de tumor e estudos pré-clínicos. Mecanismos de evasão imune, progressão do tumor, metástases e resistência de tratamento representam áreas de significância clínica que podem ser abordados usando o modelo proposto.

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Protocolo

Todos os procedimentos de animais foram efectuados de acordo com um institucional animal cuidados e uso Comité (IACUC) protocolo aprovado da Universidade de Colorado Denver (protocolo # 00250).

1. cultura de células de tumor

Nota: Linhas de células B4B8 e LY2 foram usadas para gerar tumores HNSCC ortotópico: B4B8 células de tumor foram derivadas de queratinócitos da mucosa cancerígena-transformadas (a partir de camundongos BALB/C)11. As células do tumor LY2 foram derivadas do linfonodo metástase de um queratinócito BALB/C espontaneamente transformado linha (Pam 212)12,13. Ambas as linhas de célula foram gentilmente cedidas pelo Dr. Nadarajah Vigneswaran (UTHealth, Houston, TX, USA).

  1. Uso Dulbecco modificado, F/12 médio (DMEM da águia) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e reagente antimicrobiana de 1% para a manutenção de linha celular. Manter estas linhas de célula em uma incubadora estéril em 37 ° C e 5% de CO2. Células devem ser usadas para inoculação antes superior a 15 passagens.
  2. Placa de 2 x 106 a 4 x 106 células em frascos de cultura de células de2 175 cm.
    Nota: Garantir que as células são menos de 90% confluente para evitar induzir uma resposta ao estresse.
  3. Quando as células são 70% confluente (~ 48 h), retire o balão da incubadora e lavar as células 3 x com frio fosfato salino (PBS).
  4. Separe as células do recipiente utilizando tripsina 0,25%, suficiente para cobrir a superfície da placa.
    1. Para fazer isso, dispense 4 mL de tripsina num balão de2 175 cm contendo 70% confluentes. Incube as celulas com tripsina por 3 – 4 min na incubadora de cultura celular em 37 ° C e 5% de CO2.
    2. Visualize as células sob um microscópio para garantir o desprendimento de células.
    3. Adicione 12 mL de DMEM F/12 mídia contendo FBS para neutralizar a atividade da tripsina.
  5. Aspirar a suspensão de eritrócitos e colocá-lo em um tubo cónico de 50 mL.
  6. Agitar o tubo contendo as células invertendo-3 x-4 x.
  7. Opcionalmente, uma alíquota de 10 µ l da suspensão de células se misturam com 10 µ l de Trypan azul em um tubo de microcentrifugadora e contar as células usando um hemocytometer. Determinar a viabilidade celular subtraindo-se o número de células Trypan azul-positivo do número total de células e divida pelo número total de células.
  8. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 300 x g por 5 min a 4 ° C.
  9. Ressuspender as células em DMEM livre de soro e antibiótico em um volume adequado para que 1 x 106 células estão presentes em 50 µ l de mídia.
    Nota: Baseia a agressividade de linha de células in vivo (determinada empiricamente), 1 x 106 células por injecção por rato foi considerada adequada para células B4B8 e LY2.
  10. Coloque o frasco contendo a suspensão de células no gelo.
  11. Coloque a matriz previamente descongelado membrana basal no gelo.
    Nota: A matriz da membrana basal foi descongelada durante a noite a 4 ° C.

2. célula de injeção em ratos

  1. Prepare uma mistura de 1:1 da matriz de membrana de células: cave (50 µ l cada).
  2. Adicionar as células primeiro; Então, gradualmente Pipete a matriz da membrana basal. Evite a introdução de bolhas de ar. Certifique-se de que a mistura é feita imediatamente antes da injeção de animais. Adicionar células à matriz da membrana basal por um longo período de tempo pode resultar em célula, fixando-se na mistura de matriz, o que dificulta a mistura a tremer com rigor. Isso fará com que uma considerável variabilidade no tamanho do tumor entre ratos.
  3. Misture suavemente. Certifique-se de todas as etapas que envolvem a matriz são executadas no gelo. Membrana basal matriz irá polimerizar à temperatura ambiente.
  4. Prepare as seringas para inoculação.
  5. Carrega seringas de insulina 0,5 mL (23 G) com 100 µ l da solução de matriz de membrana celular/porão.
  6. Mantenha as seringas no gelo para evitar a polimerização de matriz de membrana basal.
  7. ANESTHETIZE ratos, colocando-os em uma câmara com isoflurano e oxigênio (2,5%).
  8. Assegure que os ratos são anestesiados profundamente antes de executar a injeção (garantindo uma falta de resposta a uma pitada de dedo do pé).
  9. Insira a agulha na região bucal da direita ou esquerda. Isto é realizado através dos espaços disponíveis em ambos os lados da boca.
  10. Certifique-se de que a língua do rato não é da forma.
    Nota: É fácil de arrancar a língua, o que resultará em tumores de língua. Mova a língua para o lado oposto, se necessário.
  11. Manter a seringa paralela à região bucal enquanto dentro da cavidade oral.
  12. Quando estiver pronto para injetar, retirar a seringa e introduza lentamente a seringa em um ângulo de 10°.
  13. Injetar 100 µ l de suspensão de matriz de membrana celular/porão durante um período de 5 s.
  14. Segurar a seringa no lugar por um adicional de 5 s para garantir todo o material é injetado.
    Nota: Para os ratos nontumor-rolamento de controle, injete uma mistura de mídia livre de soro e matriz (como descrito acima) sem as células do tumor.
  15. Retire a seringa com cuidado.
  16. Continue o procedimento acima com os ratos restantes.
  17. Permitir a 1 semana até tumores começam a aparecer grosseiramente (50 – 200 mm3 para células B4B8 e LY2).

3. Mouse monitoramento

  1. Realize a primeira medição usando pinças em 1 semana após a injeção de células de tumor. Para calcular o volume do tumor utilizando pinças externas, determinar o maior diâmetro longitudinal (comprimento) e o maior diâmetro transversal (largura) e usar a fórmula elipsoidal modificados14,15.
    figure-protocol-1
  2. Continue a realizar medições paquímetro regular para o volume do tumor (x-2 1x por semana em intervalos regulares).
  3. Medir peso animal para avaliar os efeitos do crescimento do tumor na alimentação.

4. colheita de tumores

  1. Quando é alcançado o ponto de extremidade experimental, eutanásia dos animais usando medidas adequadas (por exemplo, CO2 asfixia, decapitação ou deslocamento cervical).
    Nota: Neste estudo, o ponto de extremidade foi alcançado se os ratos tornou-se moribundo (com perda de peso > 15% de seu peso inicial, a falta de higiene, caquexia) e/ou se o tamanho do tumor chegou a 1.000 mm3.
  2. Começa dissecando o animal através da criação de uma incisão longa através da linha mediana da região do pescoço.
    1. Use fórceps contundente para agarrar a pele e afiadas tesouras para cortar a pele.
  3. Insira uma tesoura suavemente sob a pele que cobre o tumor e criar bolsões de ar empurrando a tesoura do outro lado e na pele.
  4. Uma vez que a pele é suficientemente separada do tumor, identificar os drenagem dos gânglios linfáticos (DLNs) e impostos especiais de consumo-los para evitar que o tecido do tumor confundido pela presença de gânglios linfáticos.
    Nota: Tumores grandes podem atingir e/ou cobrir o DLN. Dependendo do tipo de ensaio a ser realizado, o isolamento dos linfonodos intactos é essencial para evitar derrames de células do sistema imunológico para o tumor, o que resultará em distorcer os resultados do ensaio.
  5. Atravessa as fronteiras do tumor até que todo o volume se desprenda.

5. tumor de processamento para aplicações a jusante

  1. Para o exame histológico a jusante, coloque tumores em formol a 10% em temperatura ambiente. Para evitar overfixation, substitua o formol com etanol a 70%. Para análise de citometria de fluxo, processa os tumores conforme descrito abaixo.
    Nota: O tecido pode ser mantido em formol para 72 h antes de overfixation pode se tornar problemático para certos tipos de coloração.
  2. Corte o tumor em 1-2 mm-tamanho pedaços usando um estéril de lâmina de barbear ou tesoura afiada.
  3. Coloque as peças do corte do tumor em um tubo cónico de 50 mL com colagenase III (4.250 unidades por exemplo), DNase I (0,1 mg por exemplo) e inibidor de tripsina (1 mg por exemplo).
  4. Incube a 37 ° C por 30 min com agitação a cada 10 min.
    Nota: As amostras podem ser colocadas em um saco resealable, esterilizado com 90% de etanol e colocado em uma incubadora de cultura de células.
  5. Depois de 30 min, adicione 20 mL de Hank está equilibrada solução salina (HBSS) e a centrifugação a 300 x g por 5 min.
    Nota: HBSS é composto de cloreto de potássio, cloreto de sódio, bicarbonato de sódio, fosfato de sódio dibásico, fosfato de sódio monobásico e glicose.
  6. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 2-3 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC). Pipete rigorosamente.
    Nota: Tampão de Lise RBC é composto de cloreto de amônio, bicarbonato de sódio e dissódico.
  7. Incube durante 2 min à temperatura ambiente.
    Nota: Incubação mais longa pode ser tóxica para outras populações de células.
  8. Adicione 20 mL de HBSS para neutralizar o efeito de Lise.
  9. Centrifugar a 300 x g por 5 min e descartar o sobrenadante.
  10. Resuspenda o pellet em 10 mL de HBSS.
  11. Transferir a solução através de uma retenção de nylon 70 µm e centrifugar x g por 5 min. descartar o sobrenadante.
  12. Repita as etapas de 5.8 – 5.10 e passar a suspensão de células através de uma retenção de nylon de 40 µm para garantir a que remoção de quaisquer resíduos adicionais da suspensão.

6. célula coloração e aquisição de dados

  1. Ressuspender as células em 1 mL de HBSS.
  2. Contar as células usando um hemocytometer ou um contador de célula automatizada, conforme descrito na etapa 1.7
  3. Determine o número total de células e a concentração adequada para a coloração.
    Nota:     a concentração de célula ideal para coloração de citometria de fluxo é de 1 milhão de células. Por exemplo, se a mancha é executada em uma placa de 96 poços e existem 10 milhões de células, resuspenda a amostra em 1 mL e placa 100 µ l para 1 milhão de células por poço.
  4. Adicione o bloco Fc (CD16/CD32) na concentração de 1: 100 a fim de impedir a ligação de nonantigen específicas das imunoglobulinas aos receptores FcγIII e FcγII. Incube durante 5 min à temperatura ambiente.
    1. Centrifugue e resuspenda o pellet de células em 100 µ l de pilha de citometria de fluxo tampão de coloração (composto contendo 5% FBS, EDTA de 2% e 1% de solução salina HEPES).
  5. Execute a superfície celular, coloração de acordo com instruções fornecido pelo fornecedor (adicionando cada anticorpo na diluição adequada). Incube durante 60 min à temperatura ambiente.
    1. Centrifugue e ressuspender as células em 100 µ l de HBSS. Repita 2x para se livrar de anticorpo em excesso.
  6. Execute amostras em um citômetro de fluxo apropriado.
    1. Se analisar marcadores intracelulares (por exemplo, foxp3), realize permeabilização celular e coloração de acordo com as instruções do fornecedor.

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Resultados

A avaliação in vitro da proliferação celular de LY2 e B4B8 mostrou que ambas as linhas de célula têm tempos de duplicação similares (21h e 23h, respectivamente). In vivo, ambas as linhas de célula formaram uma massa única, visível e palpável dentro de 1 semana de inoculação (figura 1A). Em camundongos com tumores LY2, o maxilar foi deslocado por 3 semanas devido a carga do tumor (figura 1A). Ratos de controle que não recebeu célu...

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Discussão

Uma análise rigorosa e caracterização do microambiente do tumor representam uma importante estratégia para os mecanismos de compreensão do desenvolvimento do tumor, progressão e metástases e para o desenvolvimento de terapias eficazes. Câncer de cabeça e pescoço é uma doença complexa que pode originar-se de vários locais anatômicos dentro da região de cabeça e pescoço. Um impedimento importante para compreender os mecanismos da doença e melhorar a terapia tem sido a falta de linhas de células de rato murino que se asseme...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Colagenase IIIWorthington Biochemical Corp.
DNase IWorthington Biochemical Corp.
Bloco Fc (CD16/32)BD Biosciences553141  Clone 2.4G2 
Tampão de Coloração por Citometria de FluxoeBioscience00-4222-26
HBSSThermoFisher Scientific14175079sem cálcio, sem magnésio, sem feno vermelho
Helois citômetro de massaFluidigmNA
Matriz de membranaMatrigel Corning CB-40234B
Scanner de ressonância magnéticaBrukerNA7.4 Tesla
RBC tampão de liseBioLegend420301
inibidor de tripsinaWorthington Biochemical Corp.
LS004183LS006328LS002830

Referências

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