Artigo de método

Determinação da taxa de fertilização do ovo de Bemisia tabaci usando uma técnica citogenética

DOI:

10.3791/59213

⸱

1 de abril de 2019

 , 
1Graduate Interdisciplinary Program in Entomology and Insect Science, University of Arizona, 2Department of Entomology, University of Arizona

Neste artigo

Resumo

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Apresentamos uma técnica citogenética simples usando ′ 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para determinar a taxa de fertilização e principal razão sexual do haplodiploid invasiva Praga Bemisia tabaci.

Resumo

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Umas poucas espécies de sugadores de seiva whiteflies são algumas das mais danosas pragas terrestres em todo o mundo devido o que eles causem danos à lavoura e vírus de planta que eles vector. Apesar de numerosos estudos da biologia destas espécies em diferentes ambientes, um parâmetro chave história de vida, relações de sexo de prole, tem recebido pouca atenção, no entanto, é importante para prever a dinâmica populacional. A proporção sexual primária (proporção sexual em oviposição) de Bemisia tabaci nunca foi relatada, mas podem ser encontrada, determinando a taxa de fertilização do ovo deste insecto haplodiploid. A técnica envolve a dechorionation de ovos com água sanitária, uma série de etapas de fixação e a aplicação da geral DNA fluorescente mancha, DAPI (4, 6-diamidino-2-phenylindole, um corante fluorescente de DNA-ligando), para ligar a pró-núcleos masculinos e femininos. Aqui, apresentamos a técnica e um exemplo de sua aplicação, para testar se uma bactéria endossimbiótica, Rickettsia SP. nr. bellii, influenciado a proporção sexual primária de b. tabaci. Esse método pode auxiliar nos estudos de população da whiteflies, ou para determinar se a alocação de sexo existe com certos estímulos ambientais.

Introdução

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O estudo da alocação de sexo, ou o investimento relativo em prole masculina e feminina, é uma pedra angular da ecologia comportamental1,2,3. Além de seu poder para testar modelos adaptáveis de comportamento, saber que a estratégia de alocação de sexo de um organismo pode melhorar modelos de sua dinâmica populacional. Em muitas espécies, alocação de sexo é controlada por mães. Para determinar a alocação de sexo, é importante determinar a proporção sexual primária ou a proporção de fêmeas no momento da deposição do ovo. Embora a proporção sexual na emergência de adultos pode fornecer pistas para alocação de sexo, diferencial do desenvolvimento mortalidade entre machos e fêmeas juvenis pode comumente inclinar a proporção sexual adulta substancialmente. Em algumas espécies de Hymenoptera, a ordem de insetos que contém formigas, abelhas e vespas, determinou-se a proporção sexual primária com ensaios citogenéticos, manchando os embriões para exibir genético DNA. Porque hymenopterans são haplodiploid, um ovo masculino incipiente é haploide e contém apenas o pronucleus feminino (n), enquanto os óvulos femininos incipientes são diploides e contêm pró-núcleos masculinos e femininos (2n). Embora Aleyrodidae, sap-alimentação da família dos Hemiptera (Hemiptera) conhecido como whiteflies, são também haplodiploid, não houve um ensaio estabelecido para encontrar a proporção sexual primária nesses insetos. Este é talvez surpreendente dada a intensidade do estudo das poucas pragas sérias cosmopolitas nesta família e a importância das relações de sexo em interações competitivas de whiteflies4,5,6,7 ,8,9,10 e na dinâmica da população em geral. Em haplodiploid insetos também, relações de sexo são ilimitadas por sistemas de determinação do sexo, permitindo a possibilidade de fertilização seletiva e lábil razões sexuais que variam de acordo com o meio ambiente2. Aqui apresentamos uma técnica para determinar a proporção sexual primária do complexo espécie de whiteflies, conhecidos coletivamente como a mosca branca sweetpotato, b. tabaci. Este nome de uma espécie engloba mais de 28 espécies no mundo11e inclui alguns dos mais danosas pragas invasoras global12,13. A aplicação desta técnica para determinar os padrões de alocação de sexo no b. tabaci e outro Aleyrodidae permitirá uma investigação mais rigorosa das variáveis, incluindo temperatura, planta hospedeira, bactérias endossimbióticas ou planta/mosca branca patógenos, que possam influenciar razões sexuais primárias de mosca branca e dinâmica da população de mosca branca.

Nós somos inconscientes de qualquer técnicas de ovo de coloração comparáveis de b. tabaci. O protocolo é conveniente em comparação com métodos de coloração utilizados para outros ovos de inseto14 como omite uma etapa de fixação durante a noite e, portanto, pode ser concluída dentro de 3 h. Como um exemplo de um aplicativo, uma bactéria endossimbiótica, Rickettsia SP. nr. bellii, está associado com viés feminino em nossas linhas de laboratório de b. tabaci Médio Oriente-Ásia menor 1 (MEAM1)15,16. Em uma linha de laboratório da b. tabaci MEAM1 ("MAC1," recolhidos no centro agrícola de Maricopa), testamos se Rickettsia-infectados (R.+) fêmeas fertilizam mais ovos do que os não infectados fêmeas (R.–).

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Protocolo

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Nota: Certifique-se de que todo o trabalho é realizado à temperatura ambiente em uma área bem ventilada ou sob uma coifa. Todos os 'gotas' neste protocolo são definidas como 5 – 20 µ l, dependendo da preferência do operador.

1. configuração inicial

  1. Permita whiteflies femininos ovipositar em folhas limpas. Gaiolas de clip ou folhas cortadas para caber no ágar em um prato de Petri são exemplos de arenas de oviposição. Faça um buraco coberto na gaiola de clip ou capa de Petri para inserir e remover os adultos. Alternativamente, rapidamente colocou um vaso de adultos coletados no gelo e, em seguida, depositá-los na folha. Limite o tempo entre a oviposição e fixação de ovo para não mais de 60 min, para assegurar a observação da transição de esperma para o pronucleus paterna em ovos.
    Nota: Ovos não retirados da folha podem ser criados até a idade adulta para gravar rácios de sexo adultos.
  2. Antes ou durante a oviposição de mosca branca, prepare uma lâmina de microscópio, limpando-a com água e sabão, secá-lo bem e então esticando um pedaço de filme de parafina em uma extremidade, certificando-se de que não quebrar a superfície da película de parafina (Figura 1).
    Nota: O filme de parafina é hidrofóbico e semi opaco, permitindo que líquidos para formar gotas e ovos para ser mais facilmente visto.

2. Dechorionation

  1. Com um vidro Pasteur pipeta, adicione gotas de solução de água sanitária (0,83% de hipoclorito de sódio) para o filme de parafina.
    Nota: É mais fácil de acompanhar ovos se apenas 2-3 ovos são em cada gota. Como alternativa, para gerenciar um número de ovo grande, recolha os ovos em gotas de 1x tampão fosfato salino (PBS).
    Atenção: Bleach é corrosivo; usar luvas quando manusear alvejante e não inale.
  2. Remova os whiteflies adultos da folha.
  3. Coloque a folha sob um microscópio para ver os ovos claramente e recolher os ovos isoladamente e, cuidadosamente, com uma sonda fina. Para fazer uma sonda, inserir um pin de nadel minuten a 45° ou um ângulo de trabalho confortável com uma ponta de pipeta derretida (Figura 2).
  4. Transferi os ovos para lixívia ou 1X PBS. Se usar 1X PBS, retire o 1X PBS com um vidro Pasteur Pipetar uma vez todos os ovos são coletados e, em seguida, adicionem água sanitária para os ovos.
    Nota: Quando a coleta de ovos, lentamente, levante o ovo de sua base até o pedicelo é removido da folha. O pedicelo é pegajoso, e o ovo comumente vai ficar com a ponta da sonda até que é mergulhado em água sanitária.
    Nota: Recomenda-se usar pipetas Pasteur de vidro separado para todos os reagentes, e as pipetas podem ser modificadas com calor para fazer as pontas mais estreitas e reduzir o risco de aspiração acidentalmente os ovos da mosca branca. Para evitar contaminação e resíduos, limpe as pipetas com água desionizada após cada utilização.
  5. Espere por 10 min. Se houver interesse na embriogênese em ovos mais de 1h, deixe os ovos em água sanitária para até 15 min.
    Nota: Para os ovos que são velhos até 1h, 10 min é suficiente.

3. fixação

Nota: Estas etapas são tiradas de um protocolo himenóptera17.

  1. Remover a água sanitária (que contém os fragmentos de córion) com um pipeta Pasteur de vidro e descartá-lo. Adicione gotas de ácido acético com um vidro Pasteur pipeta e esperem 3 min.
    Atenção: Prosseguir com este passo sob uma coifa. Ácido acético glacial é corrosivo; desgaste luvas quando manipular o ácido acético glacial e não inale, especialmente em combinação com a lixívia residual.
  2. Remover o ácido acético glacial com um pipeta Pasteur de vidro e adicione gotas de solução de Clarke (3:1 de etanol absoluto: ácido acético glacial) com um vidro Pasteur pipeta. Espere até que a maioria da solução tenha evaporado (ou 10 min máx).
  3. Adicione gotas de etanol a 70% para os ovos com uma pipeta Pasteur de vidro e espere até que a maioria do etanol tenha evaporado (ou max 10 min).

4. coloração

  1. Remover qualquer etanol residual com um pipeta Pasteur de vidro e adicione gotas de 1X PBS aos ovos com um copo de pipeta Pasteur para obter o pH próximo de 7,0. Conjunto da corrediça do microscópio em uma câmara de umidade para evitar a dessecação, por exemplo, em uma caixa de ponta de pipeta vazio com uma toalha de papel molhada dentro (Figura 3). Espere pelo menos 30 min.
    Nota: Este é o melhor ponto se houver necessidade de uma pausa, enquanto a câmara de umidade pode evitar a dessecação.
  2. Remover a PBS 1x com uma pipeta Pasteur, de vidro e adicione gotas de 0,1 μg/mL DAPI, uma mancha fluorescente de DNA, com um vidro Pasteur pipeta. Definir o microscópio em uma câmara escura de umidade e espere pelo menos 15 min.
    Atenção: DAPI é um irritante, então lidar com isso com luvas.

5. lavar roupa

  1. Remova o DAPI com um pipeta Pasteur de vidro.
  2. Adicione gotas de 1 x TBST (5 x solução feita a partir de 30 g de Tris, 43,8 g de NaCl, 5 mL de polissorbato 20 e 1,0 g de NaN3 [pH 7.5] e trouxe para 1 L com água de grau PCR) para os ovos com um copo de Pasteur pipeta. Espere 5 minutos antes de retirar o 1 x TBST com um pipeta Pasteur de vidro. Repita essa etapa 2 vezes.

6. montagem

  1. Após a lavagem final, pipete cuidadosamente todos os ovos do filme de parafina em uma parte limpa da lâmina de microscópio. Remover o excesso 1 x TBST; em seguida, adicionar 20 µ l de mídia de montagem (glicerol 80% e 20% 1 x TBST com 2% de n-propil-galato) e colocar um slide de capa limpa em cima dos ovos.
  2. Para armazenamento a longo prazo, selar o slide de capa com esmaltes claros e, em seguida, armazenar o slide no escuro a 2 ° C ou visualizá-la imediatamente sob um microscópio fluorescente.

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Resultados

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Para testar se Rickettsia afeta a taxa de fertilização das fêmeas de MEAM1 de b. tabaci , nós criados Rickettsia-infectado (R.+) ou não infectados (R.–) b. tabaci em plantas de feijão-caupi (Vigna unguiculata) em separar as gaiolas em 27 ° C, umidade relativa de 70% e um fotoperíodo escuro h luz/8 de 16 h. R+ e R– 4º ínstar whiteflies foram cuidadosamente retirados das folhas e isolados em tubos de ti...

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Discussão

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Este protocolo é o primeiro a capturar a taxa de fertilização ou primária proporção sexual de b. tabaci. O desafio do presente protocolo é que ele requer pesquisadores aprender a lidar com os ovos da mosca branca rapidamente, garantindo que não mais de 1h se passou desde que os ovos foram oviposited até que eles são fixos. Durante experimentos preliminares, os ovos que foram corrigidos em 3h ou mais postoviposition eram muito velhos para observar a fecundação, como syngamy tinha ocorrido e divisões mitóticas est...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Esta pesquisa foi financiada por uma concessão de NSF (DEB-1020460) para M.S.H. e um subsídio de USDA AFRI (2010-03752) para M.S.H. Os autores graças a Brennan Zehr para coloração de ovos de mosca branca com muita habilidade e Zen. Os autores agradecer a Mike Riehle permitindo o uso de seu microscópio fluorescente para a imagem latente. Os autores agradecer Suzanne Kelly e Marco Gebiola as imagens de ovo. Os autores Obrigado Suzanne Kelly e Jimmy Conway para ajudar nos momentos cruciais durante os experimentos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1x PBSQualquer
1x TBSTQualquersolução 5x feita de 30 g de Tris, 43,8 g de NaCl, 5 mL de Tween-20 e 1,0 g de NaN3 pH 7,5, e levada a 1 L com água de grau PCR
AlvejanteCloroxQualquer alvejante doméstico funcionará desde que possa ser diluído a 0,83% Hipoclorito de sódio
Esmalte transparenteQualquer
DAPI dilactatoSanta Cruz Biotechnologysc300415
EtanolQualquerdiluir a 70% EtOH
Microscópio fluorescenteNikonNikon Eclipse 50i foi usado neste experimento, mas qualquer microscópio fluorescente com filtro de excitação de 340/380 nm e ampliação de pelo menos 4-10x pode ser usado
Ácido acético glacialMallinckrodtUN2789
GlicerolQualquer
microscópioselvagemUm microscópio Wild M5A foi usado para este experimento, mas qualquer microscópio onde o operador possa ver claramente os ovos da mosca-branca pode ser usado
Tampas de lâminas de microscópioQuaisquermétodos são para tampas de lâminas de 18 mm x 18 mm. Mais mídia de montagem precisará ser adicionada para tampas deslizantes maiores.
Lâminas de microscópioQualquer
pino nadel MinutenBioQuip1208SAOs pinos nadel Minuten são opcionais para modelagem como sondas com pontas de pipeta
NaClQualquer
NaN3Qualquer
n-propil-galatoSigma/Santa Cruz BiotechnologyP3130/sc-250794
ParafilmPipetas Bemis
PasteurFisher Scientific13-678-20AFisherbrand Pipetas Pasteur de vidro borossilicato descartáveis 5.75 in. Um bico de Bunsen também pode ser necessário se o operador quiser alongar e estreitar pipetas
de grau PCRQualquer
Ponteiras de pipetaQuaisquerpontas de pipeta são opcionais para modelagem como sondas com pinos nadel minúsculos
Bulbo conta-gotas pequenoQualquerDeve caber na pipeta Pasteur
TrisQualquer
Tween-20Qualquer
Água

Referências

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  1. Charnov, E. L. Sex ratio in spatially structured populations. The Theory of Sex Allocation. May, R. M. , Princeton University Press. Princeton, NJ. 67-92 (1982).
  2. Godfray, H. C. J. Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).
  3. Bourke, A. F. G., Franks, N. R. Social Evolution in Ants. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1995).
  4. Pascal, S., Callejas, C. Intra- and interspecific competition between biotypes B and Q of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) from Spain. Bulletin of Entomological Research. 94 (4), 369-375 (2004).
  5. Liu, S. -S., et al. Asymmetric mating interactions drive widespread invasion and displacement in a whitefly. Science. 318 (5857), 1769-1772 (2007).
  6. Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Mate discrimination in invasive whitefly species. Journal of Insect Behavior. 23 (5), 364-380 (2010).
  7. Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Plasticity in mating behaviour drives asymmetric reproductive interference in whiteflies. Animal Behaviour. 79 (3), 579-587 (2010).
  8. Tsueda, H., Tsuchida, K. Reproductive differences between Q and B whiteflies, Bemisia tabaci, on three host plants and negative interactions in mixed cohorts. Entomologia Experimentalis et Applicata. 141, 197-207 (2011).
  9. Wang, P., Crowder, D. W., Liu, S. -S. Roles of mating behavioural interactions and life history traits in the competition between alien and indigenous whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 102 (4), 395-405 (2012).
  10. Sun, D. -B., Li, J., Liu, Y. -Q., Crowder, D. W., Liu, S. -S. Effects of reproductive interference on the competitive displacement between two invasive whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 104 (3), 334-346 (2014).
  11. Liu, S. -S., Colvin, J., De Barro, P. J. Species concepts as applied to the whitefly Bemisia tabaci systematics: how many species are there? Journal of Integrative Agriculture. 11 (2), 176-186 (2012).
  12. Invasive Species Specialist Group. Global Invasive Species Database. , Available from: http://iucngisd.org/gisd/100_worst.php (2018).
  13. Gilbertson, R. L., Batuman, O., Webster, C. G., Adkins, S. Role of the insect supervectors Bemisia tabaci and Frankliniella occidentalis in the emergence and global spread of plant viruses. Annual Review of Virology. 2 (1), 67-93 (2015).
  14. Giorgini, M., et al. Rickettsia symbionts cause parthenogenetic reproduction in the parasitoid wasp Pingala soemius (Hymenoptera: Eulophidae). Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2589-2599 (2010).
  15. Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
  16. Cass, B. N., et al. Dynamics of the endosymbiont Rickettsia in an insect pest. Microbial Ecology. 70 (1), 287-297 (2015).
  17. Vavre, F., de Jong, J. H., Stouthamer, R. Cytogenetic mechanism and genetic consequences of thelytoky in the wasp Trichogramma cacoeciae. Heredity. 93 (6), 592-596 (2004).
  18. Cass, B. N., et al. Conditional fitness benefits of the Rickettsia bacterial symbiont in an insect pest. Oecologia. 180 (1), 169-179 (2016).
  19. Hunter, M. S., Asiimwe, P., Himler, A. G., Kelly, S. E. Host nuclear genotype influences phenotype of a conditional mutualist symbiont. Journal of Evolutionary Biology. 30, 141-149 (2017).
  20. Gottlieb, Y., et al. Inherited intracellular ecosystem: symbiotic bacteria share bacteriocytes in whiteflies. FASEB Journal. 22 (7), 2591-2599 (2008).
  21. Luan, J., Sun, X., Fei, Z., Douglas, A. E. Maternal inheritance of a single somatic animal cell displayed by the bacteriocyte in the whitefly Bemisia tabaci. Current Biology. 28 (3), 459-465 (2018).
  22. Guo, J. -Y., Cong, L., Wan, F. -H. Multiple generation effects of high temperature on the development and fecundity of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype B. Insect Science. 20 (4), 541-549 (2013).
  23. Cui, X., Wan, F., Xie, M., Liu, T. Effects of heat shock on survival and reproduction of two whitefly species, Trialeurodes vaporariorum and Bemisia tabaci biotype B. Journal of Insect Science. 8 (24), (2008).
  24. Boykin, L. M. Bemisia tabaci nomenclature: Lessons learned. Pest Management Science. 70 (10), 1454-1459 (2014).
  25. Qin, L., Pan, L. -L., Liu, S. -S. Further insight into reproductive incompatibility between putative cryptic species of the Bemisia tabaci whitefly complex. Insect Science. 23 (2), 215-224 (2016).

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