Controle de Cluster inicial célula 3D em um dispositivo de cubo híbrido Gel para formações padrão repetitivo

Summary

Apresentamos um procedimento para controlar a forma de cluster inicial célula em uma matriz extracelular 3D para obter uma formação de padrão repetitivo. Um dispositivo cúbico contendo dois diferentes hidrogel é empregado para conseguir imagens multi-direcional para formação de padrão de tecido.

Abstract

A importância das culturas in vitro de 3D é consideravelmente enfatizada em cultura de células/tecidos. No entanto, a falta de reprodutibilidade experimental é uma das suas restrições. Produzir alguns resultados reproduzíveis de formação padrão deteriora-se a análise dos mecanismos subjacentes a auto-organização. Reduzir a variação em condições de cultura inicial, tais como a densidade celular e distribuição na matriz extracelular (ECM), é crucial para melhorar a repetibilidade de uma cultura 3D. Neste artigo, vamos demonstrar um procedimento simples mas eficiente para controlar a forma de cluster inicial célula em uma matriz extracelular 3D para obter formações padrão altamente repetitivo. Um micromold com uma forma desejada foi fabricado usando fotolitos ou um processo de usinagem, e formou-se um bolso 3D em ECM contido em um cubo de gel de híbrido (HGC). Células altamente concentradas então foram injetadas no bolso, para que a forma de aglomerado celular combinado com a forma do molde fabricado. O trabalhador assalariado HGC permitido multi-direcional digitalização por sua rotação, o que permitiu a geração de imagens de alta resolução e captura a todo da estrutura do tecido mesmo que utilizou-se uma lente de ampliação baixa. Normais células epiteliais brônquicas humanas foram usadas para demonstrar a metodologia.

Introduction

A importância de uma cultura 3D, que melhor imita ambientes biológicos do que uma cultura 2D, é consideravelmente enfatizada em cultura de células/tecidos^1,2,3. A interação entre as células e matriz extracelular (ECM) fornece pistas importantes sobre a morfogênese^4,5. Muitas formações de tecido podem surgir apenas em ambientes 3D, como o dobramento processo^6,7, invaginação⁸e formação tubular^9,10. No entanto, inúmeras dificuldades impedem pesquisadores mudando a experiências 3D de experimentos 2D em um prato. Uma das principais dificuldades em experiências 3D é a questão da imagem 3D amostras. Em comparação com experimentos planares, aquisição de imagens 3D apropriadas é ainda um desafio em muitos casos. Em particular, a obtenção de uma imagem 3D é uma tarefa difícil quando o tamanho da amostra atinge o intervalo milímetros devido a grande profundidade focal das lentes de ampliação baixa. Por exemplo, a profundidade focal atinge mais de 50 µm quando uma lente de ampliação de 10x é usado enquanto o tamanho da célula única é normalmente inferior a 10 µm. Para melhorar a qualidade de imagem, sistemas de microscopia de alta tecnologia estão sendo desenvolvidos (por exemplo, dois fotões microscopia¹¹ e sistema de microscopia de luz-folha¹²), mas sua disponibilidade é limitada devido ao seu preço caro. Como alternativa, temos desenvolvido anteriormente um híbrido gel de cubo (HGC) dispositivo¹³. O dispositivo é composto por dois tipos de hidrogel: agarose como um gel de apoio e um ECM como colágeno ou Matrigel como um gel de cultura. O HGC nos permite coletar a amostra durante o cultivo e girar o cubo para alcançar a imagem multi-direcional, que aborda o problema de profundidade focal¹⁴.

Outra dificuldade em experiências 3D é sua baixa repetibilidade devido a pobre controlabilidade dos ambientes 3D. Ao contrário de uma cultura planar sobre um prato de plástico, facilmente ocorrer variações nas condições de cultura inicial em um espaço 3D, rodeado por um material macio. Uma variação significativa nos resultados experimentais deteriora-se a seguinte análise e mascara os mecanismos subjacentes. Muitas tecnologias de engenharia têm sido desenvolvidas para alinhar espacialmente células únicas, tais como bioprinting^15,16, fibra tecelagem¹⁷e andaimes¹⁸, mas eles exigem complexo pré-processamento ou especificamente equipamento projetado. Em contraste, nós desenvolvemos uma metodologia para atingir o alinhamento da célula 3D em uma HGC¹⁹.

Neste protocolo, ilustramos um procedimento simples com equipamentos comumente usados para controlar a forma de aglomerado de pilha inicial 3D em uma HGC. Demonstrou-se em primeiro lugar, o processo de fabricação do HGC. Então, micromolds fabricadas por fotolitografia ou um processo de usinagem foram colocados no HGC para produzir um bolso com uma forma arbitrária em um ECM. Posteriormente, células altamente densas após centrifugação foram injetadas no bolso para controlar a forma de aglomerado de pilha inicial no HGC. O cluster de célula precisamente controlada poderia ser fotografado partir de várias direções por causa do HGC. Normal humano brônquica (NHBE) células epiteliais foram usadas para demonstrar o controle da forma de aglomerado de pilha inicial e a imagem latente dos ramos de múltiplas direções para melhorar a qualidade de imagem.

Protocol

1. fabricação de dispositivo de cubo híbrido gel

1. Prepare um quadro cúbicos de policarbonato (PC) usando um processo de usinagem ou uma impressora 3D. O tamanho da moldura PC varia de acordo com o tamanho da amostra. Neste estudo, usamos uma moldura de 5 mm de cada lado para que os ramos tinham espaço suficiente para alongar durante o cultivo.
2. Coloque o quadro de PC sobre uma lâmina de vidro previamente resfriado ou outra superfície lisa em uma caixa de gelo (< 0 ° C) (figura 1A).
3. Adicione 12 µ l de pré-aquecido agarose 1,5% (p/v) da face superior do quadro cúbico para a superfície de fundo com uma pipeta. Acaricie a pipeta para que a agarose espalha-se para criar uma superfície plana (figura 1B).
4. Minutos depois, a agarose vai ser curado. Buscar o quadro de PC deslizando-a para a borda do vidro slide usando uma pinça. Observe que verticalmente, pegando o quadro da lâmina de vidro pode resultar em desanexação do agarose do quadro cúbico devido a força magnética entre o agarose e a lâmina de vidro (Figura 1).
5. Gire o quadro cúbico para fazer o rosto aberto para baixo e coloque sobre a lâmina de vidro novamente (Figura 1).
6. Repita as etapas de 1,3-1,5 até três superfícies estão cheias de agarose (Figura 1E).
7. Para formar uma parede de agarose nos quarto e quinto rostos, largue o agarose de uma face aberta (Figura 1F). Uma vez uma parede de agarose é formada na face do quinta, a preparação do HGC é concluída.

2. fabricação de micromolds por fotolitografia ou um processo de usinagem

1. Fabricação por fotolitografia
   1. Limpar um wafer de silício (Si), através de limpeza ultra-sônica com acetona, álcool isopropílico (IPA), então (DI) água destilada por 5 min cada. Depois de nitrogênio soprando a bolacha de Si com nitrogênio, desidrata-se em um forno a 140 ° C por 20 min (Figura 2A(i)).
   2. Rotação-casaco uma camada sacrificial como LOR e Az resiste na bolacha de Si (2.000 rpm, 30 s) usando um aplicador-rotação sob luz amarela. Imediatamente após o giro-revestimento, aqueça a hóstia num prato aquecido a 90 ° C por 3 min (Figura 2A(ii)). A espessura desejada da camada sacrificial é mais do que 1 µm, para que o elevador fora de processo pode ser realizado facilmente, mas uma espessura exata não é necessária.
   3. Coloque a bolacha em um prato quente a 70 ° C e então laminado uma folha grossa fotorresiste negativo com a espessura desejada na camada sacrificial, usando um rolo de mão (Figura 2A(iii))
   4. Cinco minutos após a laminação, coloque a bolacha em um alinhador de máscara para exposição aos raios UV. Definir uma Fotomáscara com o padrão desejado em resistir a folha e expor com luz UV para uma duração de tempo apropriado. O tempo de exposição é determinado pela espessura do fotorresiste e a intensidade da luz UV. Posteriormente, coloque a bolacha sobre uma chapa quente para um Asse pós-exposição a 60 ° C por 5 min, seguido por cozimento a 90 ° C por 10 min. (Figura 2A(iv))
   5. Desenvolver um negativo fotorresiste imergindo a hóstia em propileno glicol acetato de éter monometílico (PGMEA) até que a área não exposta é completamente dissolvida (aproximadamente 20 min) (Figura 2A(v)).
   6. Dissolva a camada sacrificial usando IPA para limpeza ultra-sônica para decolar a microestrutura. Uma vez que a microestrutura é descascada fora de wafer, enxague com água por limpeza ultra-sônica por 10 min (Figura 2A(vi)).
   7. Mergulhe o molde em 30 µ l do polímero MPC durante 30 min à temperatura ambiente (cerca de 20 ° C) para secar completamente. Figura 2B mostra o molde do prisma fabricados.
2. Fabricação de um molde do cilindro
   1. Fabrica um molde do cilindro de aço com tamanho desejado por um processo de usinagem. Como alternativa, use comercialmente disponível de aço inoxidável. (Neste estudo, um cilindro de 600 µm φ é usado.)
   2. Mergulhe o aço do cilindro em 30 µ l do polímero MPC durante 30 min à temperatura ambiente (cerca de 20 ° C) para secar completamente.
   3. Preparar o líquido polydimethylsiloxane (PDMS) através da mistura de resina de base e o catalisador (ver Tabela de materiais) na proporção de 10:1, seguida de desgaseificação com um vácuo de desgaseificação sistema por 20 min. Em seguida, despeje o PDMS em uma 12-bem-placa.
   4. Conjunto o cilindro de aço fixo e perpendicular à superfície de referência para uma z-fase linear para que pode ser introduzida perpendicularmente na superfície PDMS não polimerizada em uma 12--placa colocada na mesma superfície datum movendo o estágio-z. Incube o PDMS com o aço do cilindro em um forno por 20 min a 90 ° C para a cura. Corte o PDMS para formar uma superfície de flanco para que a pipeta pode ser inserida no processo de seguir (Figura 2).

3. forma de cluster inicial da célula em um hidrogel de controle

1. Injete um ECM apropriado para a cultura de célula desejada, tais como colágeno e artificial da membrana basal, o HGC para preencher o espaço de cultura (Figura 3A).
2. Defina o micromold fabricado sobre o HGC direta ou indiretamente com um suporte adequado, como mostrado na Figura 3B. Posteriormente, coloque o HGC numa incubadora de CO₂ por 25 min a 37 ° C para curá-la.
3. Cuidadosamente Retire o micromold para que o ECM não se deteriora (Figura 3). O bolso, como a forma do molde desejado, será fabricado em ECM.
4. Colher células do prato cultivada por tripsina – EDTA ou seu equivalente, dependendo dos tipos de célula. Posteriormente, Centrifugar as células para obter células altamente concentradas (para cultura NHBE, aplicar 0,25% do trypsin-EDTA e incubar as células por 3 min, depois neutralizar com meio contendo FBS e centrifugação a 300 x g durante 4 min).
5. Após a centrifugação, remover o sobrenadante médio para condensar as células e injetar células altamente concentradas (3,0 × 10⁴ células / µ l de células NHBE) no bolso o ECM (Figura 3D).
6. Incube a HGC com células numa incubadora de CO₂ por 20 min a 37 ° C para que as células se enquadram o bolso de ECM para preencher o espaço criado pelo micromolds. Se meio excessivo ou células estão presentes na superfície superior, Retire cuidadosamente com uma pipeta.
7. Coloque o HGC um 24-bem-prato e adicionar 100 µ l de meio apropriado (Figura 3E). Para as células NHBE, use uma mistura de 1:1 do meio especializado comercialmente disponível para NHBE e células endoteliais (ver Tabela de materiais).
8. Injete ECM adicional para fechar o bolso em ECM e então incubar a 37 ° C por 25 min.
9. Arrefecer pré-aquecido agarose 1,5% à temperatura ambiente (cerca de 20 ° C). Queda de aproximadamente 10 µ l do agarose para a superfície superior da HGC para fechar a superfície e impedir que o ECM fora o HGC durante o cultivo e a imagem (Figura 3F). Em seguida, incube o HGC por mais 20 minutos a 37 ° C para curar o agarose.
10. Adicione médio para cobrir o HGC inteira para que a pressão osmótica pode ajudar no fornecimento de nutrientes para as células dentro do HGC.

4. imagem multi-direcional

1. Reconhecimento de forma não-invasiva 3D pela observação multi-direcional
   1. Coloque o prato de cultura ou bem placa contendo o HGC em um microscópio e orientar o HGC para o quadro da câmera. Em seguida, obter uma imagem de exemplo de contraste de fase ou campo brilhante.
   2. Pegar e rodar o HGC para colocar uma superfície diferente para baixo.
   3. Repita as etapas 4.1.1 e 4.1.2 até imagens de todos os seis lados são obtidas.
2. Imagem de imuno-fluorescente por observação multi-direcional
   1. Para fixação, aplique paraformaldeído 4% da amostra sobre o HGC à temperatura ambiente (cerca de 20 ° C) por 20 min, seguido de duas lavagens de PBS por 10 min cada.
   2. Permeabilize a HGC com PBS contendo 0,5% Triton X-100 por 10 min a 4 ° C, e depois lavar 3 x por 10 min com PBS.
   3. Incubar a HGC com 10% de soro de cabra em tampão IF (0,2% Triton X-100, albumina de soro bovino 0,1% e 0,05% Tween-20 em PBS) para 60 min à temperatura ambiente para uma etapa preliminar de bloqueio.
   4. Para a coloração de uma molécula específica, use o anticorpo adequado. Para observar a geometria de cela coletiva, Alexa Fluor 488 faloidina pode ser usada para manchar a actina.
   5. Coloque um prato fundo de vidro sob um microscópio laser ou fluorescente a HGC e realizar a digitalização a partir de seis lados para obter a imagem de toda a amostra.

Results

Normal humano brônquica (NHBE) células epiteliais foram usadas para demonstrar a metodologia ilustrada e controlar a geometria inicial célula coletiva para alcançar uma forma do cilindro e uma forma de prisma, respectivamente, em um ambiente de ECM. São apresentados os resultados de imagem multi-direcional obtidos por contraste de fase, bem como a faloidina coloração de uma forma de cilindro (Figura 4AB) e a forma de prisma (

Discussion

O método apresentado neste trabalho é simples e pode ser realizado sem equipamentos de alta tecnologia. Simultaneamente, pode ser obtido um resultado do controle precisos célula aglomerado forma no espaço 3D de hidrogel. Após o controle inicial, as células podem crescer na HGC tanto quanto eles são cultivados em um prato. A imagem multi direcional é executada girando-se a amostra com o HGC usando qualquer sistema de microscopia e melhora significativamente a qualidade de imagem. A escolha dos materiais para o frame HGC e...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placa de 12 poços	Corning  Inc.	3513
Acetato de 2-Metoxi-1-metiletila	FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.	130-10505	PGMEA, CAS: 108-65-6
4% de paraformaldeído	FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.	161-20141	CAS: 30525-89-4
Agarose, baixa temperatura de gelificação  BioReagent	Sigma-Aldrich	A9414
Alexa fluor 488 faloidina	Thermo Fisher Scientific	A12379
AZ1512	Merck
BEGM kit de bala	Lonza	CC-3170	Meio especializado para células NHBE
Solução de albumina de soro bovino (10%)	Sigma-Aldrich	A1595
EGM-2 kit de bala	Lonza	CC-3162	Meio especializado para células endoteliais
Lipidure	NOF co.		Polímero MPC
Matrigel fator de crescimento reduzido matriz de membrana basal	Corning  Inc.	354230
Soro de cabra normal (10%)	Thermo Fisher Scientific	50197Z
Células epiteliais brônquicas humanas normais	Lonza	CC-2541
SILPOT 184 W / C	Dow Corning Co.	3255981	Resina base e catalisador para PDMS
SUEX D300		DJ MicroLaminates, Inc	Fotorresistente negativo espesso (espessura: 300 mm)
Triton X-100 (1%)	Thermo Fisher Scientific	HFH10
Tripsina-EDTA (0,25%)	Thermo Fisher Scientific	25200056
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416