Estudando o RNA interactianos de proteína quinase RNA-ativado durante o ciclo celular dos mamíferos

Proteína quinase RNA-ativado (PKR), também conhecido como eucarióticas iniciação fator alfa-2 da quinase 2 (EIF2AK2), é uma bem caracterizadas proteína quinase que transmite informações fornecidas por RNAs. Pertence a alfa de subunidade de iniciação 2 Tradução eucariota (eIF2α) família quinase e fosforila eIF2α em serina 51 em resposta à infecção para suprimir a tradução global¹. Neste contexto, o PKR é ativado por RNAs virais double-stranded (dsRNAs), que fornecem uma plataforma para PKR dimerização e autofosforilação². Além de eIF2α, PKR pode também phosphorylate p53, substrato do receptor de insulina 1, inibidor κB e c-Jun N-terminal kinase (JNK) para regular a atividade de numerosos sinal transdução vias^{3,4,5, 6}.

PKR foi originalmente identificada como uma quinase que fosforilado eIF2α durante a infecção de poliovírus através do reconhecimento dsRNAs^{7,8 dos poliovírus}. PKR é encontrado cada vez mais a desempenhar papéis multifacetadas além da resposta imune, e sua ativação aberrante ou avaria está implícito em várias doenças humanas. Ativado/Phosphorylated PKR (pPKR) é frequentemente observada durante a apoptose e é uma característica comum dos pacientes do doenças degenerativas, particularmente doenças neurodegenerativas, como a doença de Huntington, Parkinson e a doença de Alzheimer^{9 ,10,11,12,13}. Além disso, o PKR é ativado sob várias condições de estresse, tais como estresse metabólico e calor choque^14,15,16,17. Por outro lado, a inibição da PKR resulta na proliferação celular aumentada e transformação maligna mesmo^18,19. PKR função também é importante na função cerebral normal e durante o ciclo celular, como o nível de pPKR é elevada durante a fase de M^20,21,22. Neste contexto, pPKR suprime tradução global e fornece dicas para sistemas de sinalização mitóticas chaves que são necessárias para a adequada divisão celular²⁰. Além disso, a ativação prolongada de PKR resultou na fase G2/M detenção do ciclo celular em ovário de hamster chinês células²³. Consequentemente, a fosforilação de PKR é regulada pelo ciclo de feedback negativo para garantir rápida desativação durante a transição de M/G1²¹.

Apesar da função de ampla gama de PKR, nossa compreensão da ativação PKR é limitado devido à falta de uma abordagem experimental padronizada de alta produtividade para capturar e identificar dsRNAs que pode ativar PKR. Estudos anteriores mostraram que a PKR pode interagir com dsRNAs formado por dois invertido Alu repetições (IRAlus)^20,24, mas a possibilidade da existência de dsRNAs celular adicional que pode ativar PKR durante o ciclo celular ou sob condições de estresse em células humanas era inexplorado. A abordagem convencional na identificação de RNA-interactianos de uma proteína de ligação de RNA (RBP) usa a luz UV para crosslink RNA-RBP complexos^25,26,27. Um estudo recente aplicado esta abordagem de reticulação UV em um sistema de rato e identificou que pequenos RNAs nucleolares podem regular a ativação PKR durante o estresse metabólico¹⁶. Utilizando a reticulação de alta eficiência de formaldeído, apresentamos um método alternativo para identificar RNAs PKR-interagindo durante o ciclo celular em células de HeLa²⁸. Uma abordagem similar foi aplicada para estudar outros dsRBPs como Staufen e Drosha^29,30,31. Nós achamos que a PKR pode interagir com vários tipos de RNA não-codificante tais como curto interspersed nuclear elemento (SINE), longo intercaladas elemento nuclear (linha), elemento de retrovírus endógenos (ERV) e alfa-satélite nem RNAs. Além disso, mostramos que a PKR pode interagir com RNAs mitocondriais (mtRNAs), que forma intermoleculares dsRNAs através da interacção complementar entre a luz e pesados-strand strand RNAs²⁸. Uma recente publicação mais suporte para nossos dados que algumas mtRNAs existe em um formulário frente e verso e pode ativar sensores dsRNA como melanoma diferenciação-proteína associada 5 para induzir os interferões³². Mais importante, a expressão e Localização subcellular das mtRNAs são modulados durante o ciclo celular e por vários factores de stress, que pode ser importante na sua capacidade de regular a ativação de PKR²⁸.

Neste artigo, apresentamos um protocolo detalhado para uma reticulação de formaldeído recentemente desenvolvidos e imunoprecipitação (fCLIP) método para capturar e analisar RNAs PKR-interagindo durante o ciclo celular. Demonstramos o método para preparar amostras de detenção do ciclo celular utilizando timidina e nocodazole. Em seguida apresentamos o processo de fCLIP para isolar RNAs ligados a PKR e um método para preparar a biblioteca de sequenciamento de alto rendimento para identificar estes RNAs. Além disso, podemos delinear procedimentos detalhados para analisar ligados a PKR RNAs usando qRT-PCR. Especificamente, apresentamos um procedimento de transcrição reversa vertente específica para analisar o strandedness de mtRNAs. O protocolo descrito é otimizado para as células HeLa e PKR, mas etapas-chave tais como a preparação da amostra de ciclo celular, fCLIP e análise da vertente específica qRT-PCR podem ser facilmente modificadas para estudar celular dsRNAs ou identificar interactianos de RNA de outros dsRBPs.

1. solução e célula preparação

1. Preparação da solução
   1. Para o meio de cultura celular, prepare-se meio para cultura de células HeLa, adicionando 50 mL de soro fetal bovino (FBS) para 500 mL de meio modificado águia de Dulbecco (DMEM).
      Nota: Os antibióticos podem ser adicionados ao meio de cultura celular, mas não usamos antibióticos.
   2. Para o 0,1% paraformaldeído, dissolver paraformaldeído 4% (p/v) em 1 x Phosphate-Buffered salino (PBS) com aquecimento em uma chapa quente e diluir para fazer 30 mL de 0,1% (v/v) paraformaldeído adicionando 1X PBS.
      Atenção: Executar todas as etapas em uma coifa e tenha cuidado para não ferver a solução de paraformaldeído. Proteger a solução 0,1% de luz e armazenar a 4 ° C. Utilize a solução dentro de um mês.
      Nota: O pH da solução de paraformaldeído final de 0,1% (v/v) deve ser em torno de 7.
   3. Preparar o tampão de Lise fCLIP: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM NaCl, 10 mM de EDTA, 0,5% (v/v) nonidet-p40 (NP-40), 0,1% (v/v) Triton X-100, 0,1% (v/v) sulfato dodecyl de sódio (SDS) e Deoxycholate do sódio de 0,1% (p/v). Adicione água destilada tripla (TDW) para 40 mL. Loja a 4 ° C.
   4. Preparar fCLIP tampão de lavagem: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM de EDTA, 0,1% (v/v) NP-40, 0,1% (v/v) Triton X-100, 0,1% (v/v) SDS e 0,1% (p/v) Deoxycholate do sódio. Adicione 40 mL TDW. Loja a 4 ° C.
   5. Preparar 4 x buffer de PK: 400 mM Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM NaCl, 40 mM de EDTA e SDS de 4% (v/v). Adicione 40 mL TDW. Armazenar em temperatura ambiente.
   6. Preparar o tampão de eluição de fCLIP: 20 mL de 4 x 8,5 mL de TDW, 21 g de ureia e buffer de PK. Prepare-se fresco.
   7. Preparar o tampão de eluição do RNA: 0,3 M de NaOAc e SDS 2% (p/v). Armazenar em temperatura ambiente.
   8. Prepare 2 x tintura de carregamento do RNA: 0.025% (p/v) de azul de bromofenol, xileno cianol de 0.025% (p/v), 5 mM EDTA, SDS de 0,05% (p/v) e formamida 95% (v/v). Loja a-20 ° C.
   9. Preparar 1 buffer de x TBE: 0.089 M Tris-borato e 0,002 M EDTA. Prepare 500 mL de tampão TBE.
2. Preparação de células de fase-preso S ou M
   1. Semente de 750.000 ~ ou ~ 1.000.000 HeLa células para amostras preso a fase S ou M, respectivamente. Desenvolvem-se células em 37 ° C e 5% CO₂ por 24 h.
   2. Tratar as células com timidina 2mm e incubar por 18 h a 37 ° C.
   3. Lave as células duas vezes com PBS. Adicionar mídia fresca e incubar durante 9 h a 37 ° C.
   4. Para S células fase-preso, tratar as células com timidina 2mm. Para células de fase-preso M, trate as células com 100 ng/mL nocodazole. Incube por 15 h a 37 ° C e a colheita de células.
      Nota: A homogeneidade das amostras de ciclo celular pode ser verificada usando FACS.

2. formaldeído cross-linking e imunoprecipitação

1. Colheita da pilha
   1. Para uma amostra da fase S, colete as células com um raspador de célula e transferência em um tubo cônico de 15 mL. Para uma amostra da fase M, bata com o lado do prato cultura celular para destacar células fase-preso M e transferi-los para um tubo cônico de 15 mL.
      Nota: Para aumentar a homogeneidade das células M fase-preso, não use um raspador de célula.
   2. Centrifugar as células a 380 x g em temperatura ambiente por 3 min. Retire o sobrenadante e ressuspender com 1 mL de frio PBS e transferir para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
   3. Centrifugar as células a 10.000 x g a 4 ° C durante 30 s. remover o sobrenadante completamente.
2. Reticulação de formaldeído
   1. Adicione 750 μL de paraformaldeído 0,1% por 10 min à temperatura ambiente para consertar as células.
   2. Adicionar 250 μL de glicina 1 M e incubar um adicional 10 min à temperatura ambiente para saciar a reação. Centrifugar as células a 10.000 x g a 4 ° C durante 30 s. remover o sobrenadante completamente.
   3. Re-suspenda com 1 mL de PBS. Centrifugar as células em 10.000 x g a 4 ° C por 30 s e remover o sobrenadante.
   4. Re-suspenda com 400 μL de tampão de Lise fCLIP suplementado com inibidor de protease de 0,2% (v/v) e 2% (v/v) inibidor de RNase. Incubar no gelo por 10 min e proceda à sonicação usando um ultrasonicator.
   5. Adicione 11 μL de 5 M NaCl, ajustar a concentração de NaCl ~ 150 mm. Vórtice brevemente e centrifugar 21.130 x g a 4 ° C por 15 min. Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrifugadora pre-refrigerados 1,5 mL.
      Nota: Manter 40 μL do sobrenadante em um novo tubo de centrifugação, como o exemplo de entrada. Armazenar o exemplo de entrada a 4 ° C.
3. Imunoprecipitação
   1. Adicione 20 μL de grânulos de proteína A um tubo de microcentrifuga de 1,5 mL.
   2. Lave os grânulos com 400 μL de tampão de Lise fCLIP. Centrifugue os grânulos a 1.000 x g a 4 ° C, durante 1 min. Retire o sobrenadante e adicionar 400 μL de tampão de Lise fCLIP cuidadosamente. Delicadamente, re-suspender os grânulos invertendo-se 3 ~ 4 vezes.
   3. Repeti a etapa de lavagem três vezes. Após a lavagem final, remova o sobrenadante completamente.
   4. Re-suspenda as contas em 300 μL de tampão de Lise fCLIP. Adicione 8.3 μL de 5 M NaCl, ajustar a concentração de NaCl ~ 150 mm. Adicionar 10 μL do anticorpo PKR e incubar durante 3 h em rotacao a 4 ° C.
   5. Centrifugue os grânulos a 1.000 x g a 4 ° C, durante 1 min. Retire o sobrenadante e adicionar 400 μL de tampão de lavagem fCLIP. Delicadamente, re-suspender os grânulos invertendo-se 3 ~ 4 vezes.
   6. Repita a etapa de lavagem duas vezes. Após a lavagem final, remova o sobrenadante completamente.
      Nota: Nunca use um misturador do vortex. Inverta o tubo delicadamente com as mãos.
   7. Adicionar 300 μL de lisado e incubar durante 3 h a 4 ° C em rotacao.
      Nota: O tempo de incubação pode resultar em vinculação do aumento do fundo.
   8. Centrifugue os grânulos a 1.000 x g a 4 ° C, durante 1 min. Retire o sobrenadante e adicionar 400 μL de tampão de lavagem fCLIP. Delicadamente, re-suspender os grânulos invertendo-se 3 ~ 4 vezes.
   9. Repeti a etapa de lavagem três vezes. Após a lavagem final, remova o sobrenadante completamente.
   10. Adicione 300 μL de tampão de eluição de fCLIP. Incube em uma thermomixer por 3 h a 25 ° C para eluir PKR de grânulos.
       Nota: Prepare o fresco de tampão de eluição fCLIP.
   11. Centrifugar a 1.000 x g , à temperatura ambiente e transferir o sobrenadante para um tubo siliconizado limpo.
       Nota: Um tubo de microcentrifugadora também é okey, mas tubo siliconizado é a preferida para evitar a evaporação durante a etapa de reticulação (etapa 2.3.12).
   12. Adicionar 300 μL de proteinase K (20 mg/mL) e incubar durante uma noite a 65 ° C.
       Nota: Utilize um thermomixer com tampa aquecida para evitar a evaporação.
4. Extração de RNA
   1. Adicione 580 μL de ácido fenol clorofórmio e vórtice por 30 s. Incubar a 37 ° C por 1h.
   2. Vórtex durante 30 segundos e centrifugar a 12.000 x g em temperatura ambiente por 10 min.
   3. Transferi a camada superior para um tubo de microcentrifugadora limpa 1,5 mL. Adicione o volume de 1/10 de 3M NaOAc, 0,5 µ l de coprecipitant (por exemplo, Glycoblue) e um volume igual de isopropanol. Incubar durante uma noite a-20 ° C.
   4. Precipitar pelotas por centrifugação a velocidade máxima a 4 ° C, durante 1 h.
      Nota: Se não foram observados aglomerados de RNA/DNA, adicione um adicional 0,5 μL de coprecipitant e centrífuga para um adicional 1 h. continuar esta etapa até pelotas de RNA/DNA são observadas.
   5. Remover o sobrenadante e adicionar 1 mL de álcool etílico de 75%. Centrifugar a 12.000 x g a 4 ° C por 5 min. repetir a etapa de lavagem mais uma vez. Remover o sobrenadante completamente e seque a pelota à temperatura ambiente.
   6. Adicione 42 μL de TDW, 5 μL de DNase eu de buffer, 1 μL de inibidor de RNase e 2 μL de DNase I. Incubar a 37 ° C por 1h.
   7. Adicione 150 μL de TDW e 200 µ l de ácido fenol clorofórmio. Vórtice de 30 s. centrifugar a 12.000 x g em temperatura ambiente por 10 min.
   8. Transferi a camada superior para um tubo de microcentrifugadora limpa 1,5 mL. Adicione 20 μL de 3 M NaOAc, 0,5 µ l de coprecipitant e 1 mL de álcool etílico de 100%. Incubar durante uma noite a-80 ° C.
   9. Precipitar pelotas e lavar com álcool etílico de 75%, conforme descrito nas etapas 2.4.4 para 2.4.5.
   10. Ressuspender em quantidade adequada de TDW.

3. sequenciamento biblioteca preparação

1. remoção de rRNA
   1. Re-suspenda as pelotas de RNA da etapa 2.4.10 com 28 μL de TDW.
      Nota: A quantidade máxima de RNA total deve ser inferior a 5 μg.
   2. Siga os procedimentos fornecidos pelo guia de referência do kit rRNA remoção para remover o rRNA.
   3. Limpar o rRNA empobrecido RNAs adicionando 160 μL de grânulos magnéticos.
      1. Misture pipetando ~ 15 vezes e incubar a temperatura ambiente por 15 min.
      2. Prenda o tubo em uma barra magnética e remover o sobrenadante.
      3. Adicionar 300 μL de álcool etílico a 80%, enquanto as contas ainda estão anexadas na Barra magnética e incubam por 30 s.
      4. Substitua o álcool etílico com uma solução de 300 μL a fresco. Ar seco os grânulos na Barra magnética para 12 min à temperatura ambiente.
      5. Re-suspenda as contas em 12 μL de TDW e misture pipetando 15 vezes.
      6. Anexar os grânulos na Barra magnética e mover o sobrenadante para um tubo limpo do PCR.
   4. Empobrecem as fragmentada RNAs ribossomal (rRNAs) seguindo os procedimentos fornecidos pelo rRNA Kit de depleção.
   5. Limpe os RNAs adicionando 110 μL de grânulos magnéticos e repetindo as etapas 3.1.3.1 para 3.1.3.6.
2. Ligadura de rotulagem e adaptador de RNA
   1. Em RNAs empobrecido rRNA, adicione 2 μL de tampão, x CIAP 10, 1 μL de inibidor de RNase e 2 μL de fosfatase alcalina da Antártica. Incube a 37 ° C por 1h e depois a 65 ° C por 5 min inactivar a fosfatase.
   2. Adicione 3 μL de tampão, x PNK 10, 1,5 μL de inibidor de RNase, 1,5 μL de T4 PNK enzima 0,8 μL de r-ATP e 1,7 μL de TDW. Incube a 37 ° C, durante 50 min.
   3. Adicionar 1,5 μL de 10mm ATP e incubar a 37 ° C por mais 40 min.
   4. Pare a reação adicionando 170 μL de tampão de eluição do RNA.
   5. Adicione 200 μL de clorofórmio fenol-ácido e vórtice por 30 s. centrifugar a 12.000 x g em temperatura ambiente por 10 min.
   6. Transferi a camada superior para um tubo de microcentrifugadora limpa 1,5 mL. Adicione 20 μL de 3 M NaOAc, 0,5 µ l de coprecipitant e 1 mL de álcool etílico de 100%. Incubar durante uma noite a-80 ° C.
   7. Precipitar o RNA pelotas e lavar com álcool etílico de 75%, conforme descrito nas etapas 2.4.4 para 2.4.5. Ressuspender em 4,5 μL de TDW e adicionar 9 μL de 2 x tintura do carregamento de RNA.
   8. Aquece a amostra a 95 ° C por 5 min e carga em um gel de ureia-página 10%.
   9. Funcione o gel a 370 V por 40 min.
      Nota: Pré-funcione o gel a 370 V para 90 min antes de carregar a amostra.
   10. Corte o gel na região de nucleotídeo ~ 100-500 e quebrar o gel.
   11. Adicione 700 μL de 0,3 M NaCl e incubar durante uma noite a 4 ° C em rotacao.
   12. Transferi a solução para uma coluna e centrifugar a velocidade máxima à temperatura ambiente por 5 min.
   13. Transferi o eluato num tubo microcentrifuga limpa 1,5 mL. Adicione o volume de 1/10 de 3M NaOAc 0,5 μL de coprecipitant e um volume igual de isopropanol. Incubar durante uma noite a-20 ° C.
3. Ligadura de adaptador 3'
   1. Precipitar o RNA pelotas e lavar com álcool etílico de 75%, conforme descrito nas etapas 2.4.4 para 2.4.5.
   2. Re-suspender as pelotas de RNA em 6,5 μL de TDW e adicionar 1 μL de 10 μM 3' adaptador.
   3. Transferir a solução para um tubo PCR e incubar a 70 ° C por 2 min.
   4. Adicione 1 μL de tampão, ligadura 10 x 0,5 μL de inibidor de RNase e 1 μL de RNA T4 ligase do 2. Incube a 28 ° C, durante 1 h, 6 h 25 ° C e 22 ° C, durante 6 h.
   5. Adicione 12 μL de 2 x tintura do carregamento de RNA e calor a 95 ° C por 5 min.
   6. Gel de purificar a 3' adaptador ligado RNAs, conforme descrito em 3.2.9 para 3.2.13.
4. Ligadura de adaptador 5'
   1. Precipitar o RNA pelotas e lavar com álcool etílico de 75%, conforme descrito nas etapas 2.4.4 para 2.4.5.
   2. Re-suspender as pelotas de RNA em 4.2 μL de TDW e adicionar 1 μL de 5 μM 5' adaptador.
   3. Transferir a solução para um tubo PCR e incubar a 70 ° C por 2 min.
   4. Adicione 0,8 μL de tampão, ligase 10 x, 0,4 μL de inibidor de RNase, 0,8 μL de 10mm ATP, 0,8 μL de RNA T4 ligase do 1. Incube a 28 ° C, durante 1 h, 6 h 25 ° C e 22 ° C, durante 6 h.
5. A transcrição reversa e amplificação por PCR
   1. No 5' adaptador RNAs ligados, adicionar 1 μL de primer de transcrição reversa 4 μM. Incubar a 70 ° C por 2 min e arrefecer imediatamente a 4 ° C.
   2. Adicione 4 μL de tampão, FS x 5, 4 μL de 2.5 mM dNTP, 1 μL de 0,1 M DTT 1 μL de inibidor de RNase e 1 μL de transcriptase reversa. Incube a 50 ° C por 1 h e 70 ° C durante 15 min.
   3. Preparar a amplificação por PCR
      1. Misturar 1 μL do produto da RT, 1 μL de primer RPI 25 μM, 1 μL de primer de RP1 25 μM, 10 μL de 5x buffer de HF, 4 μL de 2.5 mM dNTP, 32,5 μL de TDW e 0,5 μL de polymerase de alta-fidelidade.
      2. Executar programa PCR para 11 ~ 13 ciclos.
         Nota: O programa para o PCR é: 98 ° C por 30 s para um começo quente, 98 ° C, durante 10 s, 60 ° C por 30 s e 72 ° C por 45 s para amplificação e 72 ° C por 5 min. A etapa de amplificação é repetida em ciclos de 11-13.
   4. Limpe os produtos PCR usando 40 μL dos grânulos magnéticos e passos seguintes 3.1.3.1 para 3.1.3.6 mas usando 10 μL de TDW para Eluir o DNA.
   5. Adicione 2 μL de tintura de carregamento 10 x DNA. Carregar a amostra em um gel do acrilamido 6% e executar a 200 V por 30 min.
   6. Mancha com Sybr gold (0,01% (v/v) em 1 x TBE buffer) durante 5 min à temperatura ambiente.
   7. A mancha em 1 x TBE buffer durante 5 min à temperatura ambiente.
   8. Corte o gel na região de nucleotídeo ~ 200 – 700 e quebrar o gel.
   9. Adicione 700 μL de 0,3 M NaCl e incubar durante uma noite em temperatura ambiente para Eluir o DNA.
   10. Coloque tudo em uma coluna e centrifugar a velocidade máxima à temperatura ambiente por 5 min.
   11. Transferi o eluato num tubo microcentrifuga limpa 1,5 mL. Adicione o volume de 1/10 de 3M NaOAc 0,5 μL de coprecipitant e um volume igual de isopropanol. Incubar durante uma noite a-20 ° C.
   12. Precipitar o DNA pelotas e lavar com álcool etílico de 75%, conforme descrito nas etapas 2.4.4 para 2.4.5. Ressuspender em 20 μL de TDW.
   13. Analise a amostra com um sequenciador.

4. análise da PKR-interagindo RNAs usando qRT-PCR

1. Método 1: A transcrição reversa do hexâmero aleatória
   1. Re-suspender pelotas RNA da etapa 2.4.10 com 8,5 μL de TDW e transferir a solução para um tubo PCR.
   2. Adicione 0,5 μL de hexâmeros aleatória de 100 μM e 4 μL de mistura de 2.5 mM dNTP.
   3. Calor a solução a 65 ° C por 5 min e imediatamente incubar no gelo pelo menos 1 min.
   4. Fazer com que a reação mix: 4 μL de tampão de x SSIV 5, 1 μL de 100 mM DTT, 1 μL de inibidor de RNase e 1 μL de transcriptase reversa (200 U/μL). Adicione a mistura de reação para a solução de RNA.
   5. Incubar a mistura a 23 ° C por 10 min, 50 ° C por 10 min e 80 ° C por 10 min.
   6. Analise o cDNA usando um sistema PCR em tempo real.
      Nota: O programa para o PCR em tempo real é: 95 ° C por 3 min para arranque a quente, 95 ° C por 5 s e 60 ° C durante 10 s para amplificação e 95 ° C por 30 s, 65 ° C por 30 s e 95 ° C por 30 s para derreter. A etapa de amplificação é repetida para 40 ciclos.
2. Método 2: Transcrição reversa Strand-específicos
   1. Preparar uma mistura de mestre de primers inversa: mistura de quantidades iguais de primers específicos de transcrição reversa de gene que contém a sequência de promotor CMV seguidas de ~ 20 nucleotídeos de sequências de genes específicos.
      Nota: A concentração combinada de todos os genes específicos RT primeiras demão é de 4 μM.
   2. Re-suspender pelotas RNA da etapa 2.4.10 com 8,5 μL de TDW e transferir a solução para um tubo PCR.
   3. Adicione 0,5 μL da mistura mestre da 4 μM de primers de transcrição reversa e 4 μL de mistura de 2.5 mM dNTP.
   4. Calor a solução a 65 ° C por 5 min e imediatamente incubar no gelo pelo menos 1 min.
   5. Prepare a solução de reação misturando 4 μL de tampão de x SSIV 5, 1 μL de 100 mM DTT, 1 μL de inibidor de RNase e 1 μL de transcriptase reversa (200 U/μL). Adicione a solução de reação à mistura do RNA-primer.
   6. Incube a solução a 50 ° C por 10 min e 80 ° C por 10 min.
   7. Analise o cDNA usando o sistema PCR em tempo real.
      Nota: O programa para o PCR em tempo real é o mesmo que aquele descrito no método 1.

Um esquema para o processo de prender HeLa células em fase S ou M do ciclo celular é mostrado na Figura 1. Para uma amostra da fase-preso M, podemos Visualizar claramente redondo em forma de células sob o microscópio (Figura 2A). Para examinar a eficácia da detenção do ciclo celular, o conteúdo nuclear da célula pode ser analisado usando FACS (Figura 2B). A Figura 3 mostra dados representativos para teste de eficiência de imunoprecipitação, onde o anticorpo D7F7 mostra uma capacidade superior de immunoprecipitate PKR. Esta diferença na eficiência da imunoprecipitação pode foram refletida na discrepância na distribuição classe das bibliotecas do elevado-throughput sequenciamento preparado usando dois anticorpos diferentes PKR (Figura 4). A especificidade do anticorpo D7F7 é confirmada usando análise ocidental de toda mancha de immunoprecipitate o PKR (Figura 5A) e o total lisado celular (Figura 5B). A Figura 6 mostra o sinal de radioisótopo antes e após a remoção dos rRNAs durante a preparação da biblioteca de sequenciamento de alto rendimento. A Figura 7 mostra o enriquecimento da mtRNAs em RNAs co-immunoprecipitated com PKR, mas não em RNAs co-immunoprecipitated com coelho IgG ou DiGeorge síndrome cromossômica região 8 (DGCR8). A Figura 8 mostra a vertente representativa específicas análise de qRT-PCR de PKR-limite mtRNAs em S ou M-fase preso amostras.

Figura 1: esquemático para as amostras de detenção do ciclo celular preparação. (A, B) Esquemas da preparação de S (A) ou M (B) fase-preso as células HeLa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: análise de ciclo celular preso amostras. (A) fase imagens de contraste de amostras de fase-preso S ou M. As barras indicam 250 μm. (B), FACS análise mostrando o conteúdo nuclear das amostras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: teste de eficiência da imunoprecipitação para anticorpos PKR. Para enriquecimento bem sucedido de RNAs PKR-limite, um anticorpo com uma eficiência de imunoprecipitação definitivo como o anticorpo D7F7 deve ser usado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: distribuição de classe de RNA das bibliotecas de sequenciamento preparado usando anticorpos diferentes PKR. Usar anticorpos diferentes PKR para fCLIP resultou em uma distribuição de classe diferentes de leituras de sequenciamento mapeada. A discrepância é provavelmente devido as diferenças na eficiência da imunoprecipitação. Esta figura foi modificada de Kim et al.28. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: a especificidade do anticorpo PKR D7F7. (A, B) A análise de toda mancha ocidental de PKR immunoprecipitated (A) ou total HeLa lisado (B) mostrou que apenas uma banda forte correspondente ao tamanho da PKR, indicando que o anticorpo D7F7 é altamente específico em reconhecer PKR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: sinal de radioisótopos para PKR RNAs de co-immunoprecipitated. (A) PKR co-immunoprecipitated RNAs poderiam ser detectadas através da marcação de suas extremidades 5' com r-ATP. (B) diminuição do sinal de radioistope foi observada após a remoção bem sucedida do rRNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: validação de PKR-mtRNA interações. Log2 dobra enriquecimento de mtRNAs em RNAs co-immunoprecipitated com anticorpos indicados. Apenas a amostra de RNA de co-immunoprecipitated PKR mostrou forte enriquecimento de mtRNAs. Anticorpos IgG de coelho e DGCR8 foram usados como controles negativos. Esta figura foi modificada de Kim et al.28. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: análise de qRT-PCR Strand-específico de PKR-limite mtRNAs. (A, B) Strand-específicos transcrição reversa foi usada para analisar o strandedness de mtRNAs que foram co-immunoprecipitated com PKR para S (A) ou M (B) células de fase foi preso. Esta figura foi modificada de Kim et al.28. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada para divulgar.