Aqui nós apresentamos um protocolo descreve a configuração de um cellulo em BBB (barreira hemato-encefálica)-cultura de poliéster membrana porosa Minibrain inserir o sistema a fim de avaliar o transporte de biomoléculas ou agentes infecciosos em um BBB humana e seus fisiológico impacto sobre as células cerebrais vizinhas.
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Artigo de método
Um modelo de Interface de sangue-cérebro humano para estudar os cruzamentos de barreira por agentes patogénicos ou medicamentos e suas interações com o cérebro
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Início da triagem de medicamentos do sistema nervoso em uma pertinente e fiável no modelo BBB cellulo para sua penetração e sua interação com a barreira e o parênquima cerebral é ainda uma necessidade insatisfeita. Para preencher esta lacuna, nós projetamos um 2D no modelo cellulo, o BBB-Minibrain, combinando um poliéster membrana porosa cultura inserir BBB modelo humano com um Minibrain formado por uma tri-cultura de células do cérebro humano (neurônios, astrócitos e células microglial). O BBB-Minibrain nos permitiu testar o transporte de um candidato de medicamento neuroprotetor (por exemplo, Neurovita), através do BBB, para determinar o direcionamento específico desta molécula de neurônios e para mostrar que a propriedade neuroprotetor da droga foi preservada após a droga tinha atravessado o BBB. Também demonstrámos que BBB-Minibrain constitui um modelo interessante para detectar a passagem de partículas de vírus através da barreira de células endoteliais e monitorar a infecção do Minibrain por neuroinvasive partículas de vírus. O BBB-Minibrain é um sistema confiável, fácil de manusear para pesquisador treinado em tecnologia de cultura de células e preditiva de fenótipos de células do cérebro após tratamento ou insulto. O interesse de tais testes cellulo seria dupla: introdução derisking passos no início do desenvolvimento da droga, por um lado e reduzindo o uso da experimentação por outro animal.
Introdução
O cérebro é separado da circulação sistêmica por uma estrutura não-permeável que restringe as trocas entre o parênquima cerebral e o sangue, chamado a barreira hemato - encefálica (BBB). Na sua maioria composta de células endoteliais cerebrais, o BBB dinamicamente interage com astrócitos, micróglia perivascular e neurônios do parênquima cerebral vizinhas. As três principais funções do BBB são a criação e a manutenção da homeostase iónica para funções neuronais, fornecimento do cérebro com nutrientes e proteção contra lesões tóxicas ou entrada de patógenos1,2, que contribuem para a manutenção da homeostase do c....
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Protocolo
1. celular cultura trabalho da Ntera/CL2. D1 para preparar uma cultura co de hNeurons pós-mitótica e hAstrocytes (NT2-n/a)
Nota: Este é o componente da Minibrain (Figura 1).
- Cultivo do Ntera/Cl2.D1
- Remova um frasco de células congeladas de tanque de nitrogênio líquido. Manter-se no gelo.
- Descongele as células rapidamente em banho maria a 37 ° C.
- Transferir as células em um tubo de 15 mL contendo 10 mL de meio DMEM F12 completo (o meio Eagle modificado de Dulbecco: meio nutriente mistura F-12) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), glutamina 2 mM, 100 UI de penic....
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Resultados
O BBB-Minibrain é uma em cellulo experimental modelo de interface de sangue-cérebro.
O BBB-Minibrain está configurado no sistema de inserção de cultura de membrana de poliéster para imitar um compartimento de sangue no piso superior e um compartimento de cérebro no piso inferior da interface do sangue-cérebro (Figura 2AB). Consiste em um compartimento luminal com as.......
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Discussão
Neste artigo demonstramos como construir um cellulo em interface de sangue/cérebro, o BBB-Minibrain, combinando-se um modelo BBB e uma cultura de misturado cérebro células cerebrais (Minibrain) em um único kit. Este sistema é fácil de configurar e manipular para experimentadores bem treinados em cultura de células, biologicamente relevantes.
Quanto a qualquer outro modelo in vitro de BBB, seria obtidos resultados fiáveis se drástico controle da tensão da barreira é aplicado. Inserções devem se.......
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Divulgações
A propriedade intelectual do sistema foi as patentes referenciados em 32, 35 e 38.
Agradecimentos
Este estudo foi suportado por concessões internas do Institut Pasteur incluindo uma subvenção Incitative (PTR 435) e por uma concessão "Contrat de Soutien à la Recherche" fornecido pela Sanofi Pasteur ao Institut Pasteur. A. da Costa foi apoiado pela concessão de Sanofi-Pasteur e Florian Bakoa é beneficiário de uma bolsa de doutoramento fornecida pelo ANRT (Association Nationale de la Recherche et de la Technologie). Estamos em dívida para Pr Pierre-Olivier Couraud e Dr Florença Miller para debates úteis.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placas de 12 poços | Corning | 3336 | |
| 5-fluoro-2' deoxiuridina | Merck-Sigma Aldrich | F0503 | |
| 85mm Placa de Petri | Sarstedt | 83-3902-500 | |
| Anti-Nf200 | Merck-Sigma Aldrich | N4142 | |
| β-mercapto-etanol | Merck-Sigma Aldrich | M3148 | |
| CHME/Cl5 | Unidadeé de Neuroimmunologie Virale | A pedido do Dr. Lafon | |
| CMC | Calbiochem | 217274 | |
| Citosina β-D-arabinofuranosídeo | Merck-Sigma Aldrich | C1768 | |
| Placas escuras de 96 poços | Corning | 3915 | |
| DMEM F12 | Thermofisher Scientific | 31330-038 | |
| DMSO | Merck-Sigma Aldrich | D2650 | |
| Endogro IV | Millipore | SCME004 | meio de célula endotelial |
| Etanol | Carlo Erba | 529121 | |
| FBS | Hyclone | SV30015-04 | |
| Formaldeído | Merck-Sigma Aldrich | 252549 | |
| GIEMSA | RAL Diagnóstico | 320310 | |
| Cabra-Anti Rato | Jackson Immuno Research | 115-545-003 | |
| Cabra-Anti Coelho | Thermofisher Scientific | R37117 | |
| HBSS com Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14025-100 | |
| hCMEC/D3 | Cedarlane | CLU512 | |
| Hepes 1M | Thermofisher Scientific | 15630-070 | |
| Hoescht 33342 | Merck-Sigma Aldrich | 33263 | |
| Laminine | Merck-Sigma Aldrich | L6274 | |
| L-glutamina | Thermofisher Scientific | 25030-024 | |
| Lúcifer Amarelo | Merck-Sigma Aldrich | L0259 | |
| MEM 10X | Thermofisher Scientific | 21430 | |
| MEM 1X | Thermofisher Scientific | 42360 | |
| Ntera/Cl2D.1 | ATCC | CRL-1973 | |
| Paraformaldeído | Microscopia Eletrônica Ciências | 15714 | |
| PBS sem Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14190 | |
| PBS-Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14040-091 | |
| Caneta/Strep | Eurobio | CXXPES00-07 | |
| Poly-d-Lysine | Merck-Sigma Aldrich | P1149 | |
| Prolong Gold | Thermofisher Scientific | P36930 | |
| Qiashredder | QIAGEN | 79656 | |
| Colágeno de Rato I | Cultrex | 3443-100-01 | |
| Ácido Retinóico All-Trans | Merck-Sigma Aldrich | R2625 | |
| Kit de purificação de RNA | QIAGEN | 74104 | |
| SDS | Merck-Sigma Aldrich | L4509 | |
| Bicarbonato de sódio 5,6% | Eurobio | CXXBIC00-07 | |
| Piruvato de sódio | Thermofisher Scientific | 11360 | |
| T75 Cell+ Frasco | Sarstedt | 83-1813-302 | Frasco de poliestireno para cultura de tecidos com tratamento de superfície específico (Cell+) para células aderentes sensíveis |
| Transwell | Corning | 3460 | inserções de cultura de membrana porosa de poliéster |
| Tripsina-EDTA | Merck-Sigma Aldrich | T3924 | |
| Água Ultra Pura | Thermofisher Scientific | 10977-035 | |
| Uridine | Merck-Sigma Aldrich | U3750 | |
| Versene | Thermofisher Scientific | 15040-033 | EDTA |
| YFV-FNV | IP Frasco | Vacina |
Referências
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.
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Reimpressões e permissões
Etiquetas
Modelo de Barreira HematoencefálicaModelo de BHE HumanaCultura de MinicérebroPermeabilidade de Células EndoteliaisTransporte de Lucifer YellowDetecção de Passagem de VírusTransporte do Fármaco NeurovitaBiomolécula de Direcionamento NeuronalCélulas Endoteliais Microvasculares CerebraisInserto de Cultura de Membrana de Poliéster
