Artigo de método

Um modelo de Interface de sangue-cérebro humano para estudar os cruzamentos de barreira por agentes patogénicos ou medicamentos e suas interações com o cérebro

DOI:

10.3791/59220

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9 de abril de 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut Pasteur, CNRS UMR 3569, Unité de Neuroimmunologie Virale, 2Institut Pasteur, Unité d’Epidémiologie et de Pathophysiologie des Virus Oncogènes, Université Sorbonne Paris Cité/Paris Diderot, 3Institut Pasteur, PFIA, DTPS

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui nós apresentamos um protocolo descreve a configuração de um cellulo em BBB (barreira hemato-encefálica)-cultura de poliéster membrana porosa Minibrain inserir o sistema a fim de avaliar o transporte de biomoléculas ou agentes infecciosos em um BBB humana e seus fisiológico impacto sobre as células cerebrais vizinhas.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Início da triagem de medicamentos do sistema nervoso em uma pertinente e fiável no modelo BBB cellulo para sua penetração e sua interação com a barreira e o parênquima cerebral é ainda uma necessidade insatisfeita. Para preencher esta lacuna, nós projetamos um 2D no modelo cellulo, o BBB-Minibrain, combinando um poliéster membrana porosa cultura inserir BBB modelo humano com um Minibrain formado por uma tri-cultura de células do cérebro humano (neurônios, astrócitos e células microglial). O BBB-Minibrain nos permitiu testar o transporte de um candidato de medicamento neuroprotetor (por exemplo, Neurovita), através do BBB, para determinar o direcionamento específico desta molécula de neurônios e para mostrar que a propriedade neuroprotetor da droga foi preservada após a droga tinha atravessado o BBB. Também demonstrámos que BBB-Minibrain constitui um modelo interessante para detectar a passagem de partículas de vírus através da barreira de células endoteliais e monitorar a infecção do Minibrain por neuroinvasive partículas de vírus. O BBB-Minibrain é um sistema confiável, fácil de manusear para pesquisador treinado em tecnologia de cultura de células e preditiva de fenótipos de células do cérebro após tratamento ou insulto. O interesse de tais testes cellulo seria dupla: introdução derisking passos no início do desenvolvimento da droga, por um lado e reduzindo o uso da experimentação por outro animal.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O cérebro é separado da circulação sistêmica por uma estrutura não-permeável que restringe as trocas entre o parênquima cerebral e o sangue, chamado a barreira hemato - encefálica (BBB). Na sua maioria composta de células endoteliais cerebrais, o BBB dinamicamente interage com astrócitos, micróglia perivascular e neurônios do parênquima cerebral vizinhas. As três principais funções do BBB são a criação e a manutenção da homeostase iónica para funções neuronais, fornecimento do cérebro com nutrientes e proteção contra lesões tóxicas ou entrada de patógenos1,2, que contribuem para a manutenção da homeostase do cérebro e suas funções3. Esta barreira é tão eficiente que apenas alguns medicamentos podem atravessar o BBB4,5. Actualmente, os métodos disponíveis para prever se uma molécula irá passar o BBB e se espalham o cérebro consistem em ex vivo estudos sobre rastreamento de imagem material, autópsia do cérebro de voluntários humanos por ressonância magnética (ressonância magnética) ou PET (posição de emissão tomografia computadorizada) ou farmacodinâmica e farmacocinéticos estudos pré-clínicos em animais6,7,8. Estas técnicas e modelos têm algumas limitações, como a resolução limitada do animal de estimação e a baixa sensibilidade de MRI6,8, a dificuldade de quantificar as moléculas (ou seja, moléculas de anticorpo com base, por exemplo) que mal penetrar o cérebro7e para o pré-clínicos estudos seu alto custo e estância de testes em animais.

O último ponto é importante porque, de acordo com a 3R regras, (substituição, redução e refinamento de experimentação animal) as administrações reguladoras pediram que os pesquisadores desenvolvem urgentemente alternativa cientificamente precisa ao animal experimentação9,10,11,12,13,14,15.

Nas últimas décadas, têm sido propostos vários modelos in vitro de BBB16,17,18 cultivando em filtro de membrana insere células endoteliais de diferentes espécies como o rato, rato, bovinos e suínos. Quanto a espécie humana é, a disponibilidade escassa e difícil de células primárias levou os pesquisadores a desenvolver modelos humanos baseados em células endoteliais do cérebro imortalizado ou células-tronco derivadas humanos19,20, 21. Estas barreiras são substitutos in-vitro adequados do BBB desde que eles expressam marcadores de célula endotelial, marcadores de junção apertada, transportadores de efluxo, portadores de soluto, receptores e responder a estímulos endotelial 20. Alguns modelos BBB usando inserções de filtro membrana revestidas com células endoteliais e outros tipos de células (ou seja, astrócitos, neurônios ou pericitos22,23,24) foram analisados. O objetivo dessas culturas co era aumentar as características físicas do BBB, aproveitando a secreção de fatores solúveis por astrócitos/neurônios ou pericitos.

No entanto, nenhum destes modelos inclui o parênquima cerebral para estudar e prever o destino de um candidato de drogas, uma vez que passou a barreira. Portanto, nosso objetivo era construir um cellulo em interface de sangue/cérebro, o BBB-Minibrain, combinando-se um modelo BBB e uma cultura de células cerebrais mistas em um único kit. O BBB-Minibrain usa um sistema de cultura que consiste em um filtro poroso, inserido em um poço de uma placa de cultura de células do multiwell. O filtro é revestido com células hCMEC/D3, uma linhagem de células endoteliais de cérebro humano que tem sido provada altamente confiável para droga BBB teste25,26,27, para formar o BBB. O Minibrain, que é uma cultura co diferenciada dos neurônios humanos e astrócitos derivados de28,o NTera/Cl2.D1 célula linha29 misturado junto com a linha de celular humana microglial CHME/Cl530 em proporção correspondente a microglia vs rácios de neurônio-astrócitos do cérebro31, é cultivada na parte inferior da placa bem.

Além de estudar a passagem de drogas através do BBB e o destino no parênquima, a interface de sangue-cérebro em cellulo modelo poderia ser uma ferramenta poderosa para lidar com a entrada de agentes patogénicos para o cérebro (neuroinvasiveness), a dispersão para o cérebro (neurotropismo) e a toxicidade (neurovirulence) podem exercer em células do parênquima cerebral. Estudos de Neurovirulence e neuroinvasiveness iria beneficiar o desenvolvimento de um eficiente no modelo cellulo e ser vantajoso para substituir os modelos animais. Usando o kit de BBB-Minibrain32, demonstrámos que o fenótipo neuroinvasive de raros mutantes virais que acumulados na francês neurotrópica estirpe do vírus do vírus da febre amarela (ou seja, FNV-YFV33,34) usada para preparar um descontinuados vacina viva YFV e a passagem de uma biomolécula neuroregenerative e neuroprotetor chamada Neurovita (conhecido como NV doravante no manuscrito)35. Porque NV nem naturalmente atravessa a membrana celular nem o BBB, NV foi fundida com a parte variável (VHH) de um anticorpo de cadeia única de lhama que atravessa as membranas biológicas incluindo o BBB e funciona como uma célula penetrante molécula (CPM)36. A propriedade CPM de VHH parece depender o ponto isoelétrico e o comprimento da VHH37.

Isto em cellulo teste deve tornar possível classificar as moléculas que potencialmente poderiam cruzar o BBB antes da realização de farmacocinética e análise farmacodinâmica em animais e, idealmente, ao mesmo tempo ser capaz de prever seu comportamento no sistema nervoso parênquima. Este sistema é fácil de configurar e manipular por profissionais bem treinados em cultura celular26,29,30,de38e biologicamente relevantes. O interesse de tais testes cellulo seria dupla: reduzindo os custos dos testes pré-clínicos de um lado e reduzir a utilização de testes em animais por outro lado.

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Protocolo

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1. celular cultura trabalho da Ntera/CL2. D1 para preparar uma cultura co de hNeurons pós-mitótica e hAstrocytes (NT2-n/a)

Nota: Este é o componente da Minibrain (Figura 1).

  1. Cultivo do Ntera/Cl2.D1
    1. Remova um frasco de células congeladas de tanque de nitrogênio líquido. Manter-se no gelo.
    2. Descongele as células rapidamente em banho maria a 37 ° C.
    3. Transferir as células em um tubo de 15 mL contendo 10 mL de meio DMEM F12 completo (o meio Eagle modificado de Dulbecco: meio nutriente mistura F-12) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), glutamina 2 mM, 100 UI de penicilina e 100 µ g estreptomicina (i.e., completa Meio DMEM F12).
    4. Centrifugar a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente (RT). Dissocia a pelota em 2 mL de meio DMEM F12 completo.
    5. Transferência em um frasco de cultura de tecidos T75 em poliestireno com tratamento específico para as células aderentes sensíveis (T75Cell+) contendo 13 mL de meio DMEM F12 completo.
    6. Cultura de células em uma incubadora mantida a 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade até confluência de 90% (ou seja, cerca de 5 dias). Médio de mudança a cada 2-3 dias.
  2. Repicagem o Ntera/Cl2.D1 e amplificação
    1. Retire o meio do balão.
    2. Enxágue a monocamada de células com 10 mL de solução salina tampão fosfato (PBS) suplementada com Ca2 + e Mg2 +.
    3. Enxágue a monocamada de células com 10 mL de solução de EDTA (mantida na RT).
    4. Adicionar 3 mL de solução de tripsina-EDTA (tripsina 0,05%, EDTA 0,02%) e incube a 2 min no RT
    5. Agitar o frasco e certifique-se que as células são separadas da superfície de plástico.
    6. Adicionar 10 mL de meio DMEM F12 completo para inactivar a tripsina, a transferência em um tubo de 15 mL e centrifugar durante 5 min à 200 x g em RT
    7. Dissociar a pelota com 10 mL de meio completo e use 1 mL para inocular cada novo frasco contendo 14 mL de meio DMEM F12 completo.
      Nota: Trinta balões T75 celular+ são necessários para cada diferenciação.
    8. Incube os frascos em 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade até 90% de confluência.
  3. Diferenciação de NTera/Cl2.D1 em co-cultura neurônio humano-astrocyte
    Nota: Este é o componente principal da Minibrain.
    1. No dia 0, dissociar as células com tripsina-EDTA, conforme descrito na etapa 1.2 e dissociar o centrifugado de cada frasco com 2 mL de meio DMEM F12 completo.
    2. Adicione 1 mL de suspensão de célula (correspondente a 5 x 106 células) em 60 pratos de Petri plástico de 85 mm de diâmetro contendo 11 mL de meio DMEM F12 completo.
      Nota: As células não é compatível com o plástico e agregarão a forma pseudo neurospheres (ver fotografia no painel inferior da Figura 1). Incube os 60 pratos de Petri em 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade por um dia.
    3. No dia 1, adicionar 1 mL de meio DMEM F12 completo suplementado com 130 µM de all-Trans ácido retinoico (ATRA) por placa de Petri (concentração final ATRA 10 µM) e retornar os pratos em 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade por 24 h.
    4. No dia 2, transferir cuidadosamente a mídia que contém esferas de célula de cada Petri Dish em um tubo de 50 mL e centrifugar por 10 min a 50 x g e RT. se cuidadosamente o sedimento solto com 13 mL de meio DMEM F12 completo suplementado com 10 µM ATRA e adicionar th e 13 mL em um novo diâmetro de 85 mm placa de Petri.
      Nota: Sobre as passagens diferentes, é extremamente importante manter a densidade de esferas tão alta quanto a densidade obtida no dia 2 (ou seja, em torno de uma densidade de 70%). Portanto, se a densidade da esfera está baixando, reduza o número total de placas de Petri de acordo com o número de células.
    5. Repita o procedimento acima (passo 1.3.4) nos dias 4, 6 e 8.
    6. No dia 10, repita o procedimento acima, mas adicione as esferas para os frascos de célula T75+ em vez de placas de Petri. Adicione as células de uma placa de Petri para um balão de célula T75+ .
    7. No dias 11, 13, 15 e 17, mude o meio usado com 14 mL de completa DMEM F12 suplementadas com 10 µM ATRA.
    8. No dia 19, mude o meio com 14 mL de meio DMEM F12 completo, sem ATRA por balão.
    9. No dia 20, dissocia suavemente as células com tripsina/EDTA como segue.
      1. Para cada frasco de célula T75+ , enxágue as células com 10 mL de PBS suplementado com Ca2 + e Mg2 +; Incube as celulas com 4 mL de EDTA durante 5 min à RT
      2. Retire cuidadosamente o EDTA e adicionar 2 mL de EDTA-tripsina e incubar 7 min em RT. agitar suavemente o frasco e adicione cuidadosamente a 8 mL de meio DMEM F12 completo.
      3. Centrífuga de 10 minutos a 160 x g e RT. dissociar o centrifugado em 13 mL de meio DMEM F12 completo e transferência em um balão de célula T75+ .
        Nota: A dissociação muito suave com tripsina-EDTA permitirá recuperar o ATRA células de células teratocarcinoma original, que estão fortemente conectadas para o ware plástico diferenciadas.
    10. No dia 21, remova o meio e as células mortas. 14 ml de meio DMEM F12 completo suplementado com 5% FBS, glutamina 2 mM, 100 UI penicilina, 100 µ g estreptomicina e 0,5 µM de AraC (citosina β-D-arabinofuranoside) (completar 5% FBS DMEM F12-AraC).
    11. No dias 23, 25 e 28, substituir usado médio com 14 mL de 5% FBS DMEM F12-AraC.
    12. Aos 29 dias até 49 (a cada dois dias), substituir usado médio com 14 mL de meio DMEM F12 completo suplementado com 5% de soro fetal bovino, glutamina 2 mM, 100 UI de penicilina, 100 µ g estreptomicina, 5 µM de FudR (5-fluoro-2' desoxiuridina) e 10 µM Urd (uridina) (5% completa FBS DMEM F12-FudR-Urd).
    13. Em 50 dias, substituir usado médio com 14 mL de meio DMEM F12 completo suplementado com 5% FBS, glutamina 2 mM, 100 UI de penicilina, 100 µ g estreptomicina e 10 µM Urd (completar 5% FBS DMEM F12-Urd).
    14. Em 51 dias até 95 (duas vezes por semana), substituir usado médio com 14 mL de completa 5% FBS DMEM F12-Urd.
      Nota: As células podem ser usado para experiências do dia 51 mas tardar dia 95. O uso de tratamentos seriais com inibidores da mitose permite recuperar a população pura de co-cultura de pós mitótica hNeuron e hAstrocytes (NT2-n/a).
    15. Para propagar as células, com suave tripsinização seguir o procedimento descrito por dia 20.

2. célula cultura trabalho de humano microglial células CHME/Cl5

Nota: Este é o componente microglial do Minibrain (Figura 1).

  1. Cultivo a microglial humana células CHME/Cl5
    1. Remova o tanque de nitrogênio líquido, um frasco de células congeladas. Manter-se no gelo.
    2. Descongelar rapidamente em banho maria a 37 ° C.
    3. Transferi as células em um tubo de 15 mL contendo 10 mL de meio DMEM F12 completo suplementado com 5% de soro fetal bovino, glutamina 2 mM, 100 UI de penicilina e 100 µ g estreptomicina (ou seja, 5% FBS DMEM F12 meio completo).
    4. Centrifugar a 200 x g por 5 min na RT. se a pelota com 2 mL de meio de FBS DMEM F12 5% completo.
    5. Transferir um balão de T75 celular+ contendo 13 mL de meio de FBS DMEM F12 5% completo.
    6. Células de cultura a 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade até 90% de confluência. Médio de mudança a cada 2-3 dias.
  2. Repicagem as células humanas microglial CHME/Cl5
    1. Remova o frasco médio.
    2. Enxágue a monocamada de células com 10 mL de PBS suplementado com Ca2 + e Mg2 +.
    3. Enxágue a monocamada de células com 10 mL de solução de EDTA (mantida na RT).
    4. Adicionar 3 mL de solução de tripsina-EDTA e incubar a 2 min no RT
    5. Agitar o frasco e certifique-se que as células são separadas da superfície de plástico.
    6. Adicionar 10 mL de meio de FBS DMEM F12 5% completo para inactivar a tripsina, a transferência em um tubo de 15 mL e centrifugar durante 5 min à 200 x g e RT
    7. Dissociar a pelota com 10 mL de meio completo e use 1 mL para inocular cada novo frasco contendo 14 mL de meio de FBS DMEM F12 5% completo.
    8. Incube os frascos em 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade até 90% de confluência.

3. cultura trabalho com o hCMEC/D3 para o revestimento porosas inserções e preparar BBB

  1. Cultivo de células endoteliais humanas hCMEC/D3 (Figura 2)
    1. Dilua o tipo eu rato colágeno para 01:30 com pura água estéril (grau de cultura de células).
    2. Transferir 10 mL para um balão de célula T75+ e incubar a 2 h em 37 ° C, 5% de CO2 e incubadora de umidade de 95%.
    3. Remover a solução de colágeno e substituí-lo com 15 mL de meio de célula endotelial suplementado com 10 mM de HEPES (conhecido como meio de célula endotelial completa).
    4. Remova um frasco de cryo de células do tanque de nitrogênio líquido. Manter-se no gelo.
      Nota: As células foram cultivadas, e um lote de sementes foi feito conforme descrito pelo fabricante. A linha celular é coberta por um acordo de transferência de material biológico. As células são obtidas no número de passagem 25 e não devem ser utilizadas mais do que 35 de passagem.
    5. Descongelar rapidamente em banho maria a 37 ° C.
    6. Transferir as células no frasco T75 celular+ e retornar o frasco a 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade para 2 a 4 h.
    7. Retire cuidadosamente o meio sem perder ou removendo células. Enxague as células uma vez com 10 mL de meio de célula endotelial completa.
    8. Adicione 15 mL de meio de célula endotelial completa.
    9. Células de cultura a 37 ° C, 5% de CO2 e umidade de 95% até 100% confluência (não menos de 4 dias) sem alterar o meio.
  2. Repicagem o hCMEC/D3 para preparar a inserção do BBB
    1. Revestir um novo balão T75 celular+ ou insere com o tipo rato colágeno como descrito acima (passo 3.1).
    2. Retire o meio do balão. Enxágue a monocamada de células com 10 mL de PBS suplementado com Ca2 + e Mg2 +.
    3. Adicionar 2 mL de solução de tripsina-EDTA e incubar 5 min a 37 ° C.
    4. Agitar o frasco e certifique-se que as células são totalmente separadas da superfície de plástico.
    5. Adicione 4 mL de meio de célula endotelial completa para inactivar a tripsina.
    6. Com uma pipeta de 5 mL de plástico, dissocia mecanicamente as células por aspiração e irrigando a suspensão de células, enquanto mantendo a pipeta de 5 mL para o fundo do recipiente de pelo menos 5 vezes.
    7. Contar as células e uso 5 x 104 células/inserção para uma cultura de membrana de poliéster bem 12 insere inserir e 2 x 106 células para um balão de célula T75+ . Prepare-se também três filtros sem células para os experimentos de PELy (i.e., permeabilidade de células endoteliais para ver Lúcifer amarelo abaixo n º 4.2) com as inserções de cultura de membrana de poliéster.
    8. Incube os frascos ou inserções em 37 ° C, 5% de CO2 e umidade de 95% até 100% de confluência.
    9. Não altere o meio para balão T75 celular+ até uma nova passagem. Ao contrário de BBB na cultura de membrana de poliéster insere: alterar médio nos dias 2 e 4, use o BBB para experiências no dia 6.

4. construção e controle de qualidade do BBB-Minibrain (Figura 2)

  1. Criação de um poliéster de BBB-Minibrain cultura de membrana inserir dispositivo (Figura 2B)
    1. Crescem as células hCMEC/D3 em 12 bem poliéster cultura membrana inserir filtros por 6 dias no meio da célula endotelial antes de usá-los para o experimento.
    2. Revesti uma placa bem 12 com poli-D-lisina (1 mL/bem, 10 µ g/mL, 4 h em RT) e, em seguida, laminina (1 mL/poço, 1 µ g/mL, a noite no RT).
    3. Remover laminina e adicionar 1 mL de meio de célula endotelial suplementado com 5% FBS (média de 5% de células endoteliais).
    4. Incube durante 1 h a 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade.
    5. Delicadamente trypsinize o NT2-n/d (conforme descrito na etapa 1.3.9) e CHME/Cl5 (conforme descrito no passo 2.2) e dissociar as pelotas de célula com o meio de célula endotelial completa.
    6. Conte as células, mistura 3,6 x 105 NT2-N/A e 0,4 x 105 CHME/Cl5 células/poço e bem placa semente a 12.
    7. Em T = 24 h (24 h após a semeadura): alterar o meio usado com meio fresco completa célula endotelial (células Minibrain e células endoteliais) e transferir o filtro de inserção da membrana de poliéster hCMEC/D3 cultura na parte superior das células Minibrain. Incube a BBB-Minibrain em 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade.
      Nota: O Minibrain-BBB então consistirá em uma camada de células endoteliais humanas hCMEC/D3 no filtro, isolando o compartimento luminal (ou compartimento "sangue") e de uma cultura mista de células humanas hNT2-n/d e hCHME/Cl5 (Minibrain) na parte inferior da definição bem o compartimento de abluminal (ou compartimento de "cérebro") (Figura 2B).
  2. Validação de permeabilidade endotelial do BBB-Minibrain (controle de qualidade) (Figura 2)
    1. Prepare a reserva de transporte (TB), que é o buffer HBSS (Hanks equilibrada solução salina) com Ca2 + e Mg2 + suplementado com piruvato de sódio HEPES e 1mm de 10 mM.
    2. Prepare-se 12 placas bem com 1,5 mL de tampão de transporte por bem.
    3. Em T = 0, fazer nova reserva transporte suplementado com 50 µM amarelo de Lúcifer (LY-TB).
    4. Reverta cada filtro de cabeça para baixo para remover cuidadosamente o meio sem afetar a barreira de células endoteliais.
    5. Coloque o filtro na placa 12 bem preenchida e adicionar 0,5 mL de LY-TB.
    6. Incube as placas em uma incubadora a 37° C, 5% de CO2 e 95% de umidade.
    7. A transferência de T = 10 min os filtros na nova TB encheu 12 placas bem e mantém o compartimento das abluminal da primeira placa para leitura de OD.
    8. Em T = 25 min, repita a etapa 4.2.7.
    9. Em T = 45 min, pare o transporte removendo os filtros das placas. Manter abluminal e compartimentos luminal para medidas de OD.
    10. Transferência em um escuro 96 placas bem as amostras: 10 µ l com 190 TB µ l para o LY-TB e os compartimentos de luminal, 200 µ l de amostra para os compartimentos de abluminal.
    11. Medir a fluorescência de LY-TB presente nas amostras de diferentes λ428 nm λ535 nm (comprimento de excitação e emissão de ondas respectivamente).
    12. Calcule a permeabilidade endotelial (Pe) em direção a LY-TB (PeLY) de acordo com Siflinger-Birnboim, A et al. (1987)39 e Da Costa, A. et al (2018)34 usando a fórmula:
      1/PSe = (1/PSt) – (1/PSf) e PeLY= PSe/S.
      Nota: O PSf é a permeabilidade do filtro sem células, PSt é a permeabilidade do filtro com células, PSe é a permeabilidade do tempo monocamada endotelial a superfície da monocamada, S é a superfície da monocamada (para um filtro bem 12 = 1,12 cm2 ), PeLY é expresso em cm/min. Para hCMEC/D3 o PeLY deve ser entre 0,7 e 1,2 x 10-3 cm/min dependendo principalmente o FBS utilizados nos experimentos. Importante: um PeLY superior 1.2 significa que o BBB não está apertado o suficiente e pode-se observar algum vazamento. Descarte essas barreiras.

5. uso do BBB-Minibrain para destacar a presença de partículas virais neuro-invasiva em uma amostra de vacina contra vírus da febre amarela, o vírus francês neurotrópica, YFV-FNV 34 (Figura 3)

  1. Cruzamento de BBB e multiplicação do vírus da febre amarela na Minibrain
    1. Usar o BBB-Minibrain preparado conforme descrito na etapa 4.1.7 24 h antes da adição do vírus; Substitua o médio por meio de célula endotelial FBS 2%.
      Nota: É extremamente importante evitar alterar o meio apenas antes de adicionar o vírus. Mudar o meio pode ativar as células endoteliais humanas e transitoriamente abrir a barreira que permitirá a passagem do vírus. Aqui o meio é alterado 24 h antes de iniciar o experimento.
    2. Em T = 0, adicione 3500 placa formando unidades (PFU) de YFV-FNV diluído em 50 µ l de 2% médio de célula endotelial FBS cuidadosamente na parte superior do compartimento luminal. O controle Minibrain-BBB é inoculado com 50 µ l de meio de célula endotelial de FBS 2% sem vírus. Determine PeLY , companheiro bem.
    3. Incube a BBB-Minibrain em uma incubadora a 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade.
    4. Após 24h, retire o dispositivo de filtro membrana de poliéster inserções de cultura e determinar PeLY, amostra de 1 mL do compartimento de abluminal e titula-se o vírus como descrito pela. da Costa et al (2018)34. Substitua o meio meio de célula endotelial FBS fresco 2%.
    5. Incube a BBB-Minibrain em 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade.
    6. Depois de 72 h, o meio do compartimento do abluminal da amostra e titula-se o vírus, e/ou extrair o RNA das células Minibrain para análise de expressão do gene como descrito pela. da Costa et al (2018)34.
  2. Amplificação de variantes neurotrópica YFV-FNV em células Minibrain por passagens seriais
    1. Uso Minibrain células revestido 12 placas bem (ou seja, as etapas 4.1.6 e 4.1.7).
    2. Em tempo de ponto h 0, adicionar 3.500 placa formando unidades de YFV-FNV diluído em 50 µ l de meio de célula endotelial 2% FBS cuidadosamente na parte superior das células (compartimento luminal).
    3. Depois de 1 h, remover o meio com a inoculação do vírus e substitua por meio de células endoteliais FBS fresco 2%.
    4. Após 48 h, 500 µ l do meio de cultura da amostra e infectar células frescas de Minibrain
    5. Após 120h, 500 µ l do meio de cultura da amostra e infectar células frescas de Minibrain.
    6. Após 192 h, salvar o meio de cultura (= estoque de vírus enriquecido) e extrair o RNA das células Minibrain para análise de expressão do gene como descrito pela. da Costa et al (2018)34.

6. uso de BBB-Minibrain para estudar a passagem de BBB e cérebro célula alvo de uma biomolécula

  1. Transportar através do BBB de um neurônio direcionamento biomolécula
    1. Use o Minibrain-BBB preparado como descrito passo 4.1.7.
    2. No ponto de altura h 0, adicionar a biomolécula (no exemplo fornecido na seção de resultado, 58.75 ng/BBB das moléculas NeuroTag-NV permeant célula foram adicionados por BBB-Minibrain inserir.
    3. Incube a BBB-Minibrain em 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade.
    4. Após 24h, retire o dispositivo de filtro membrana de poliéster inserções de cultura e determinar PeLY, manchar as células Minibrain para Neurofilamento hNeurons Nf200 e detectar a presença da biomolécula no Minibrain (no exemplo fornecido no resultado seção, NeuroTag-NV foi detectada usar um anticorpo dirigido contra o estreptococo-Tag contém35,,40).
  2. Transportar através do BBB de uma biomolécula neuroregenerative e ensaio subsequente neuroprotective no Minibrain depois a biomolécula cruzou o BBB
    1. Use o Minibrain-BBB preparado conforme descrito na etapa 4.1.7.
      Nota: Para moléculas visando apenas neurônios, células de Minibrain podem ser substituídas por apenas os neurônios células (NT2-N),38.
    2. No ponto de altura h 0, adicione 58.75 ng/BBB-Minibrain bem das células permeant NV moléculas (formulário ativo CPM-NeuroTag-NV, forma não-ativa CPM-NeuroTag-NVΔ) descrito por C. Prehaud et al (2014)35.
    3. Incube a BBB-Minibrain em uma incubadora a 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade.
    4. Após 4 h, fazer feridas individuais com uma agulha de injeção (26GX1/2 ", 12-4.5, Terumo, Bélgica) nas células Minibrain. Fazer pelo menos 10 arranhões em cada indivíduo bem. Determine PeLY , o companheiro bem.
    5. Incube a BBB-Minibrain em uma incubadora a 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade.
    6. Após 8 h, substitua o medium no compartimento de abluminal por meio de célula endotelial completa fresco.
      Nota: É importante substituir o médio a este passo, desde o ferimento das células Minibrain pode levar à morte celular e, em seguida, a liberação de compostos citotóxicos.
    7. Incube a BBB-Minibrain em uma incubadora a 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade.
    8. Após 48 h, manchado as células para a regeneração do axônio de hNeurons como descrito por C. Prehaud et al (2013)40.

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Resultados

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O BBB-Minibrain é uma em cellulo experimental modelo de interface de sangue-cérebro.

O BBB-Minibrain está configurado no sistema de inserção de cultura de membrana de poliéster para imitar um compartimento de sangue no piso superior e um compartimento de cérebro no piso inferior da interface do sangue-cérebro (Figura 2AB). Consiste em um compartimento luminal com as...

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Discussão

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Neste artigo demonstramos como construir um cellulo em interface de sangue/cérebro, o BBB-Minibrain, combinando-se um modelo BBB e uma cultura de misturado cérebro células cerebrais (Minibrain) em um único kit. Este sistema é fácil de configurar e manipular para experimentadores bem treinados em cultura de células, biologicamente relevantes.

Quanto a qualquer outro modelo in vitro de BBB, seria obtidos resultados fiáveis se drástico controle da tensão da barreira é aplicado. Inserções devem se...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A propriedade intelectual do sistema foi as patentes referenciados em 32, 35 e 38.

Agradecimentos

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Este estudo foi suportado por concessões internas do Institut Pasteur incluindo uma subvenção Incitative (PTR 435) e por uma concessão "Contrat de Soutien à la Recherche" fornecido pela Sanofi Pasteur ao Institut Pasteur. A. da Costa foi apoiado pela concessão de Sanofi-Pasteur e Florian Bakoa é beneficiário de uma bolsa de doutoramento fornecida pelo ANRT (Association Nationale de la Recherche et de la Technologie). Estamos em dívida para Pr Pierre-Olivier Couraud e Dr Florença Miller para debates úteis.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placas de 12 poçosCorning3336
5-fluoro-2' deoxiuridinaMerck-Sigma AldrichF0503
85mm Placa de PetriSarstedt83-3902-500
Anti-Nf200Merck-Sigma AldrichN4142
β-mercapto-etanolMerck-Sigma AldrichM3148
CHME/Cl5Unidadeé de Neuroimmunologie ViraleA pedido do Dr. Lafon
CMCCalbiochem217274
Citosina β-D-arabinofuranosídeoMerck-Sigma AldrichC1768
Placas escuras de 96 poçosCorning3915
DMEM F12Thermofisher Scientific31330-038
DMSOMerck-Sigma AldrichD2650
Endogro IVMilliporeSCME004meio de célula endotelial
EtanolCarlo Erba529121
FBSHycloneSV30015-04
FormaldeídoMerck-Sigma Aldrich252549
GIEMSARAL Diagnóstico320310
Cabra-Anti RatoJackson Immuno Research115-545-003
Cabra-Anti CoelhoThermofisher ScientificR37117
HBSS com Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14025-100
hCMEC/D3CedarlaneCLU512
Hepes 1MThermofisher Scientific15630-070
Hoescht 33342Merck-Sigma Aldrich33263
LaminineMerck-Sigma AldrichL6274
L-glutaminaThermofisher Scientific25030-024
Lúcifer AmareloMerck-Sigma AldrichL0259
MEM 10XThermofisher Scientific21430
MEM 1XThermofisher Scientific42360
Ntera/Cl2D.1ATCCCRL-1973
ParaformaldeídoMicroscopia Eletrônica Ciências15714
PBS sem Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14190
PBS-Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14040-091
Caneta/StrepEurobioCXXPES00-07
Poly-d-LysineMerck-Sigma AldrichP1149
Prolong GoldThermofisher ScientificP36930
QiashredderQIAGEN79656
Colágeno de Rato ICultrex3443-100-01
Ácido Retinóico All-TransMerck-Sigma AldrichR2625
Kit de purificação de RNAQIAGEN74104
SDSMerck-Sigma AldrichL4509
Bicarbonato de sódio 5,6%EurobioCXXBIC00-07
Piruvato de sódioThermofisher Scientific11360
T75 Cell+ FrascoSarstedt83-1813-302Frasco de poliestireno para cultura de tecidos com tratamento de superfície específico (Cell+) para células aderentes sensíveis
TranswellCorning3460inserções de cultura de membrana porosa de poliéster
Tripsina-EDTAMerck-Sigma AldrichT3924
Água Ultra PuraThermofisher Scientific10977-035
UridineMerck-Sigma AldrichU3750
VerseneThermofisher Scientific15040-033EDTA
YFV-FNVIP FrascoVacina
de Dakar

Referências

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