Este protocolo descreve as etapas necessárias para gerar um modelo de sistema em que a transcrição de um gene endógeno de interesse pode ser condicionalmente controlada em animais vivos ou células usando reforçada ALC repressor e/ou sistemas de ativador de tet .
Aqui descrevemos um protocolo para a implementação do sistema de controle remoto (Reversible Manipulation of Transcription em Endogenous loci), que permite o controle de expressão reversíveis e ajustáveis de uma endógena do gene de interesse na vida modelar sistemas. O sistema de controle remoto emprega sistemas de ativação repressão e tet reforçada ALC para alcançar para baixo – ou upregulation de um gene alvo dentro de um sistema biológico. Repressão apertado pode ser alcançado de repressor vinculação sites flexìvel localizados mais a jusante de um site de início de transcrição por inibição da elongação da transcrição. Upregulation robusto pode ser alcançado por reforçar a transcrição de um gene endógeno pela segmentação ativadores transcricionais de tet à promotora cognata. Este controle de expressão reversível e ajustável pode ser aplicada e retirada repetidamente em organismos. A potência e a versatilidade do sistema, como demonstrado por endógena Dnmt1 aqui, permitirá mais precisas análises funcionais in vivo, permitindo a investigação da função dos genes em vários níveis de expressão e de testes a reversibilidade de uma fenótipo.
Nocaute genético ou abordagens transgênicas foram meios eficazes para estudar a função do gene em modelos animais. No entanto, regulação da expressão por essas abordagens é dicotômica (ligar/desligar), não-temporal e, portanto, não é capaz de revelar o espectro completo e funcional de um gene. Tecnologias deimg Cre/L condicionais permitiram inactivação espácio-temporais ou ativação da função do gene, mas sua natureza dicotômica continua a representar limitações, tais como célula letalidade e irreversibilidade1,2 , 3. a fim de preencher esse vazio, abordagens knockdown condicionais têm sido desenvolvidos usando tet-regulada shRNA ou miRNA4. No entanto, o alvo efeitos permanecem uma preocupação para RNAi5 e tem sido um desafio para controlar in vivo. Mais recentemente, CRISPR/Cas-mediada por tecnologias de controle transcricional introduziram uma abordagem mais versátil para alcançar tanto a montante e downregulation da expressão do gene endógeno e demonstrou seus utilitários6,7 . No entanto, a eficácia do controle transcricional mediada CRISPR/Cas desconhece-se ainda na vivo e a reversibilidade da repressão com base em CASCUDO continua a ser visto, tão forte repressão por CASCUDO e sua proteína de interação KAP1 foi mostrada para induzir silenciamento de8,9do gene permanente.
Para lidar com essas limitações, nós desenvolvemos um sistema regulador transcricional romance capaz de Controlar condicionalmente a expressão do gene endógeno em um reversível e forma sintonizável em ratos usando engenharia transcricional procariótico binário sistemas de regulação10. Sistemas reguladores transcricionais binários procarióticos com ligantes reguladoras, tais como lac e tet, permitiram tal reversível e expressão sintonizável controlar11,12,13, 14. no entanto, a potência de repressão inadequada dos sistemas binário atuais tem impedido sua ampla adoção para controlar a expressão do gene endógeno nos mamíferos. Desenvolvemos um sistema de repressão ALC reforçada suficientemente potente para a repressão de genes endógenos e empregou uma estratégia romance de direcionamento tet ativadores transcricionais diretamente para o cognato promotor de um gene endógeno para alcançar upregulation robusto (Figura 1)10. Com esta tecnologia, conseguimos fazer quase duas ordens de magnitude controle de expressão do gene endógeno Dnmt1 numa forma sintonizável, inducible e reversível10. Aqui nós fornecemos instruções passo a passo para a sua aplicação in vivo de outros genes e organismos usando ratos como uma espécie de modelo.
Figura 1 : Visão geral do sistema de controle remoto. A transcrição de um gene endógeno do alvo pode ser regulada usando repressor lac de engenharia e sistemas de ativador de tet . O promotor do gene alvo ou intrão é projetado para conter operadores para o repressor de LacIGY apertado-vinculação e/ou o rtativador TA-M2. R indica Repron (RepCV intrno), que contém 12 operadores simétrica ALC (S) e mais um intrão de beta-globina coelho parcial. T indica o operador tet . O repressor activator é e/ou exprimem-se de um promotor de tecido-específica. A expressão do gene do alvo pode então ser reversível sintonizada para o nível de expressão desejada pela administração de IPTG (isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside, um antagonista do repressor LacIGY) ou doxiciclina (Dox). Esta figura foi modificada de Lee et al.10, por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Antes de iniciar este protocolo, rever tabela 1 para identificar as etapas relevantes para o controle desejado da expressão do gene. Por exemplo, provocar um mouse que permite reversível downregulation de “Gene X”, completar as seções 1, 3 e 4 da abaixo de protocolo. Tabela 1 também resume os componentes necessários do sistema de controle remoto.
Mudança de expressão desejada | Repressão apenas | Ativação somente | Tanto a repressão e a ativação |
Seções relevantes do protocolo | 1, 3-4 | 2-4 | 1-4 |
Sequência de controle remoto necessária no Gene alvo | Repron (“Intrão repressão”; 12 operadores de ALC simétrica mais um intrão de beta-globina coelho parcial) | Operadores de Tet | Operadores Repron e Tet |
Localização de sequência de controle remoto | Intrão | Promotor | Intrão & promotor |
Ativador/Repressor necessário para o controle desejado | LacIGY Repressor | Ativador de rtTA-M2 | LacIGY Repressor e ativador rtTA-M2 |
Ligantes regulamentares | IPTG | Doxiciclina | IPTG e/ou doxiciclina |
Tabela 1: Visão geral dos componentes de controle remoto.
Um passo crítico e limitação potencial do sistema de controle remoto é o desafio que está associado com a inserção do repressor e/ou locais obrigatórios de ativador sem afetar a expressão do gene alvo. Nossa abordagem original de repressão, como aplicado ao gene Dnmt1 , envolveu inserção dos sítios de ligação do repressor lac dentro regiões transcricionalmente críticas de um promotor. Para reduzir o risco de afetar a função de promotor e, portanto, para melhorar a aplicabilidade geral do sistema de controle remoto, desenvolvemos uma abordagem baseada em intrão repressão. A potência do nosso sistema de reforço ALC permitiu-nos firmemente a reprimir a transcrição de todos os promotores fortes que testamos em operadores localizados centenas de diversos kilobases a jusante da transcrição iniciar sites (Figura 3A – C) 10. importante, os níveis de repressão eram independentes das forças transcriptional dos promotores (Figura 3A – C)10. Isto sugere que a capacidade de repressão de nosso sistema de repressão baseado em intrão excede a força transcriptional dos promotores testados. Essa abordagem baseada em intrão, é provável que a repressão é mediada através de interferência física entre dois componentes, a máquina de alongamento de transcrição e a ALC repressores57. Este mecanismo simples repressão e a robustez demonstrada do método baseado em intrão podem tornar essa abordagem geralmente aplicáveis aos organismos, tecidos e genes diferentes.
O upregulation pelo sistema de controle remoto requer as sequências de ligação liberada para estar em proximidade com o promotor do gene alvo, que implica um risco de afetar a função de promotor. No entanto, encontramos que a posição de ligação a sequências pode ser fora da região transcricionalmente crítica. Promotores de tanto Dnmt1 e EF1α foram robustamente upregulated de tet operadores localizado um par de cem bases rio acima da transcrição iniciar sites10. Essa restrição relaxada reduz bastante a chance de afetar a função de promotor de um gene alvo na ausência da liberada. Aumentando o número de ligação a sequências e/ou uso de transactivators mais fortes pode ajudar a reduzir ainda mais o risco, permitindo a regulação alta de sites mais distante longe do local de início de transcrição.
Nosso sistema de controle remoto fornece controle elegante do nível, sincronismo e localização da expressão do gene endógeno, permitindo testar a reversibilidade de um fenótipo e as consequências dos níveis de expressão diferente, que não são facilmente alcançáveis por atual em tecnologias de controle de expressão de gene vivo. É importante notar que, na maioria das análises de expressão de gene, incluindo a nossa, expressão valores representam a média de uma população de células entre as quais uma variação considerável pode ser encontrada. Esta heterogeneidade pode influenciar processos de tomada de decisão celulares, tais como diferenciação ou apoptose58. Embora a precisão do controle de expressão de gene provavelmente poderia ser melhorada pelo circuito genéticos adicionais engenharia59, a potência observada do nosso atual sistema permitirá investigação útil da função dos genes em muitos contextos biológicos. Além disso, espera-se um elevado grau de especificidade do alvo por causa da complexidade de sequências de operador, bem como a grande distância evolutiva entre mamíferos e a espécie originário dos componentes regulatórios60. Além disso, linhas de rato transgénico dos repressores e ativadores podem ser desenvolvidas e empregadas para qualquer gene endógeno. Por exemplo, modelos de rato liberada tet existentes podem ser adaptados para realizar a regulação alta de um gene alvo nos tecidos do mouse desejado. Recentemente desenvolvemos uma linha de transgênica que poderá conduzir a robusta expressão tecido-específica de nosso repressor lac reforçada em vários tipos de tecido quando combinado com linhas existentes do Cre introduzindo o gene lacIGY para o locus Hipp11 48 sob o controle de um elemento de Lox-STOP-Lox (não publicado). Esta linha substancialmente facilitaria a aplicação de tecido-específica do sistema de controle remoto.
Gene upregulation pelo sistema de controle remoto oferece várias vantagens em comparação com as abordagens atuais de transgénicas inducible. Não requer geração de múltiplas linhas transgénicas para testar os efeitos da posição da inserção, como ele utiliza o locus endógeno. Além disso, essa abordagem é well-suited para upregulation de genes com expressão de base forte porque aumenta a expressão de um promotor já robusto, Considerando que modelos transgénicos convencionais dependem mínimos promotores virais. Por último, o tecido especificidade, controle do ciclo celular e variantes de um gene alvo de emenda podem ser mantidos com upregulation pela nossa abordagem, que conserva elementos de regulação natural como inata cis-elementos reguladores. O advento da tecnologia de gene-alvo CRISPR/Cas-mediada facilitará grandemente a aplicação desta tecnologia em sistemas de diversos modelo.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a tarde Dr Heidi Scrable pelo seu generoso presente da construção de gene de mamífero Laureano (Mayo Clinic, Rochester, MN), Dr Daniel Louvard (Institut Curie, Paris, França) para fornecer o promotor Villin e Dr Laurie Jackson-Grusby (Hospital infantil, Boston, MA) por suas contribuições para as fases iniciais de desenvolvimento desta tecnologia. Estamos gratos por Dr Nancy Wu e Dr Robert Maxson por sua assistência na geração de ratos transgênicos e nocaute. Agradecemos os membros do laboratório Laird para discussões úteis e apoio. Este trabalho foi financiado pelos institutos nacionais de saúde [CA75090 R01 R01 DA030325, R01 CA157918 e R01 CA212374 para P.W.L. e 1F31CA213897-01A1 para N.A.V.S].
B6C3F1/J | The Jackson Laboratory | 100010 | https://www.jax.org/strain/100010 |
Cas9 Protein | PNA Bio | CP04 | http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE |
CRISPOR | Haeussler et al. 2016 | http://crispor.tefor.net/ | |
Doxycycline-Containing Mouse Diet | Envigo | Varies by concentration | https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/ |
ENCODE Database | Stanford University | https://www.encodeproject.org/ | |
iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI) | Addgene | 65795 | https://www.addgene.org/65795/ |
IPTG | GoldBio | I2481C | https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&q=iptg |
pGL3-Basic | Promega | E1751 | https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751 |
SVM-BPfinder | Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University | http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/ | |
TiProD: Tissue specific promoter Database | Department of Bioinformatics, UMG, University of Göttingen | http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de | |
UCSC Genome Browser | University of California Santa Cruz | https://genome.ucsc.edu/ |