Artigo de método

Indução e Caracterização da Hipertensão Pulmonar em Camundongos usando o Modelo De Hypoxia/SU5416

DOI:

10.3791/59252

⸱

3 de junho de 2020

 ,  ,  , 
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Phospholamban Foundation

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve a indução da hipertensão pulmonar (PH) em camundongos com base na exposição à hipóxia e na injeção de um antagonista receptor VEGF. Os animais desenvolvem hipertrofia ph e ventricular direita (RV) 3 semanas após o início do protocolo. A caracterização funcional e morfométrica do modelo também é apresentada.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hipertensão Pulmonar (AP) é uma condição fisioterológica, definida por uma pressão arterial pulmonar média superior a 25 mm Hg em repouso, conforme avaliado pelo cateterismo cardíaco direito. Um amplo espectro de doenças pode levar à ETI, diferindo em sua etiologia, histopatologia, apresentação clínica, prognóstico e resposta ao tratamento. Apesar dos progressos significativos nos últimos anos, a AP continua sendo uma doença não recorrente. Compreender os mecanismos subjacentes pode abrir caminho para o desenvolvimento de novas terapias. Modelos animais são importantes ferramentas de pesquisa para alcançar esse objetivo. Atualmente, existem vários modelos disponíveis para recapitulação de PH. Este protocolo descreve um modelo PH de dois hits do mouse. Os estímulos para o desenvolvimento de PH são a hipóxia e a injeção de SU5416, um antagonista do receptor fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Três semanas após o início da Hipóxia/SU5416, os animais desenvolvem remodelação vascular pulmonar imitando as alterações histopatológicas observadas na AP humana (predominantemente grupo 1). A remodelação vascular na circulação pulmonar resulta na remodelação do ventrículo direito (RV). Os procedimentos para medir as pressões de RV (utilizando o método do peito aberto), as análises morfômicas do RV (dissecando e pesando ambos os ventrículos cardíacos) e as avaliações histológicas da remodelagem (tanto pulmonares através da avaliação da remodelagem vascular quanto do cardíaco, avaliando a hipertrofia e a fibrose cardiomiocócica do RV) são descritas detalhadamente. As vantagens deste protocolo são a possibilidade da aplicação tanto em camundongos selvagens quanto em camundongos geneticamente modificados, a implementação relativamente fácil e de baixo custo, e o rápido desenvolvimento da doença de interesse (3 semanas). As limitações deste método são que os camundongos não desenvolvem um fenótipo grave e a FP é reversível no retorno à normoxia. A prevenção, assim como os estudos terapêuticos, podem ser facilmente implementados neste modelo, sem a necessidade de habilidades avançadas (em oposição aos modelos de roedores cirúrgicos).

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hipertensão pulmonar (AP) é uma condição fisioterológica, definida por uma pressão arterial pulmonar média (PA) superior a 25 mm Hg em repouso, conforme avaliado pelo cateterismo cardíaco direito1,,2. Há uma variedade de doenças que podem levar à PH. Na tentativa de organizar as condições associadas ao PH, vários sistemas de classificação foram desenvolvidos. A classificação clínica atual categoriza as múltiplas doenças associadas à AP em 5 diferentes grupos1. Essa distinção é importante, pois vários grupos de pacientes possuem doenças que diferem em sua apresentação clínica, patologia, prognóstico e resposta ao tratamento2. A Tabela 1 resume a classificação atual, complementada com as características histopatológicas básicas de cada doença.

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Tabela 1: Visão geral da classificação clínica de PH, juntamente com as principais características histopatológicas dentro dos grupos. Adequação do protocolo Hypoxia/SU5416 para modelagem de PH. Esta tabela foi modificada a partir de19. PH: Hipertensão pulmonar, PAH: Hipertensão Arterial Pulmonar

Apesar dos avanços significativos no tratamento de doenças associadas à AP, a AP ainda permanece sem cura, com uma taxa de mortalidade de 3 anos variando entre 20% e 80%3. Isso indica a necessidade imperativa de compreender os mecanismos subjacentes da AP e, posteriormente, o desenvolvimento de novas terapias para prevenir, retardar a progressão e curar a doença. Modelos animais são de importância crucial para este escopo. Atualmente, existem vários modelos para estudar PH. O leitor interessado é encaminhado para as excelentes avaliações sobre este tópico2,3,4. Tendo em vista a variedade de doenças que levam à PH, é óbvio que as diversas condições da AP humana não podem ser perfeitamente recapituladas em um modelo animal. Os modelos animais disponíveis podem ser categorizados em i) single-hit, ii) two-hit, iii) knockout, e iv) overexpression models3. Nos modelos de um único hit, a FP é induzida por um único estímulo patológico, enquanto os modelos de dois hits combinam dois estímulos patológicos com o objetivo de induzir a PH mais grave e, assim, imitar mais de perto a complexa doença humana. Além das diferenças etiológicas, os diversos estímulos resultam em diferenças de modelagem de PH que dependem também da espécie e do fundo genético dos animais4.

Um dos modelos clássicos de roedores PH mais usados é o modelo de hipóxia crônica2. A hipóxia é conhecida por induzir PH em humanos, bem como em várias espécies animais. A hipóxia tem a vantagem de ser um estímulo fisiológico para PH (Tabela 1). No entanto, enquanto o grau de hipóxia usado para induzir PH em roedores é muito mais grave do que em humanos, o único insulto (hipóxia) leva apenas a uma forma leve de remodelagem vascular. Isso não imita a gravidade da doença humana. A adição de um segundo hit, um estímulo extra para induzir a PH, mostrou resultados promissores: a injeção do composto SU5416 aos roedores combinado com o estímulo hipóxico induz um fenótipo PH mais grave2,,5,6. SU5416 é um inibidor do receptor fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) receptor-2. Bloqueia os receptores VEGF e leva à apoptose celular endotelial. Em condições hipóxiis, isso estimula a proliferação de um subconjunto de células endoteliais resistentes à apoptose. Além disso, o SU5416 leva à proliferação de células musculares lisas. A combinação desses efeitos resulta em remodelação vascular patológica da circulação pulmonar e leva à elevada pressão da AF e remodelação ventricular direita2,,5,,7. O modelo foi descrito pela primeira vez em ratos6 e posteriormente aplicado em camundongos4,5,7. O modelo do mouse exibe remodelagem vascular menos severa em comparação com ratos. Além disso, quando retornado à normoxia, a AP continua a progredir em ratos, enquanto em camundongos é parcialmente reversível.

O protocolo a seguir descreve todas as etapas para modelagem de PH em camundongos usando o método Hypoxia/SU5416 (planejamento, cronograma, execução). Além disso, a caracterização do modelo está descrita neste protocolo: funcionalmente (medindo invasivamente a pressão ventricular direita (RV) utilizando a técnica do peito aberto), morfometricamente (dissecando e pesando tanto os ventrículos direito quanto esquerdo), bem como histologicamente (avaliando a remodelagem vascular pulmonar, hipertrofia cardiomiófica ventricular direita e fibrose).

Todas as etapas e métodos descritos neste protocolo podem ser facilmente implementados pelos investigadores em qualquer nível de experiência. Embora as medidas funcionais do RV usando a técnica de peito aberto (descrita aqui) não seja o método padrão-ouro no campo, ele tem a vantagem de que pode ser rapidamente aprendido e reproduzido com precisão até mesmo por um experimentador menos experiente.

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Protocolo

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Antes de qualquer experimentação animal obter a autorização do comitê de cuidados com animais institucionais locais. Os experimentos atuais foram realizados após aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) na Escola de Medicina Icahn do Monte Sinai.

1. Indução de PH

  1. Preparação
    1. Antes de iniciar o estudo, planeje cuidadosamente o projeto experimental. Certifique-se de que os camundongos são submetidos à hipóxia ao mesmo tempo que a primeira injeção SU5416. Um exemplo do projeto experimental para induzir PH usando o método Hypoxia/SU5416 é mostrado na Figura 1A. Os ratos de controle receberam apenas o veículo. Para este modelo, o SU5416 será injetado nos ratos uma vez por semana durante 3 semanas consecutivas.
    2. Use camundongos C57BL/6 de oito a doze semanas para este estudo. Abriga os animais a 18-20 °C em um ciclo claro-escuro de 12 h. Certifique-se de que alimentos e água são acessíveis ad libitum.
    3. Pesar os animais. Atribuê-los aleatoriamente a cada grupo: Normoxia e Hypoxia/SU5416.
    4. Prepare a câmara hipóxica como mostrado nos tanques de nitrogênio (N2)da Figura 1B. Nitrogênio seguro (N 2 ) perto da câmara. Coloque o controlador de oxigênio (O2)em um ponto de 10% O2. Deixe o sistema chegar a um estado estável.
    5. Prepare SU5416 para injeção (use uma dose de 20 mg/kg de peso corporal). O SU5416 não se dissolve em soluções aquosas; portanto, dissolva o valor calculado em 100 μL DMSO8. Por exemplo, para um mouse de 25 g, a quantidade de SU5416 a ser injetado é de 0,5 mgs dissolvido em solvente de 100 μL (DMSO). A concentração final de SU5416 para este mouse é, portanto, de 5 mg/mL.
      ATENÇÃO: SU5416 é um material perigoso. Leia cuidadosamente a Ficha de Dados de Segurança acompanhada do produto e certifique-se de tomar as precauções recomendadas ao manusear esta substância. Use luvas de proteção e (quanto a qualquer injeção) use proteção ocular. A estrutura química de SU5416 é mostrada na Figura 1C.
      NOTA: Calcule um excesso adequado da solução para compensar o volume que será perdido durante a injeção (por exemplo, na seringa, frasco etc.). Dependendo da seringa utilizada, o volume morto é de aproximadamente 200 μL. Para um grupo de 10 camundongos, calcule um excesso de 2 doses de camundongos.
    6. Prepare as seringas para injeção. Use seringas de 1 mL com agulhas de 25 G x 5/8".
  2. Injeção subcutânea SU5416
    1. Contenha o animal. Coloque o mouse na tampa da gaiola para auxiliar a contenção. Segure a pele e forme uma tenda paralela à coluna. Certifique-se de agarrar firmemente a parte de trás da cabeça, para evitar a possível lesão de mordida pelo mouse.
      NOTA: A presença de dois investigadores torna o procedimento mais rápido e preciso, pois um pode segurar o animal enquanto o outro realiza a injeção.
    2. Insira a agulha subcutânea sobre o flanco na dobra solta da pele. Certifique-se de inserir a agulha paralela à pele. Evite penetrar na parede abdominal.
    3. Injete o teor da seringa (100 μL de SU5416 dissolvido ou veículo).
      NOTA: Para evitar vazamentos após o parto completo, segure a seringa por aproximadamente 10 s e gire ligeiramente a agulha sob a pele.
    4. Retire a agulha e devolva o animal para sua gaiola. Após a injeção de SU5416, coloque as gaiolas na câmara de hipóxia ventilada.
  3. Exposição à hipóxia
    1. Monitore a ventilação ao longo do tempo. Certifique-se de manter 10% do suprimento de oxigênio. Manter animais de normoxia em uma câmara semi-vedátil em 21% O2.
    2. Certifique-se de que as câmaras estão equipadas com um sensor de oxigênio para medir o nível de oxigênio. Evite a abertura extensiva das câmaras. Para limpeza e adição de alimentos e água abra as câmaras por não mais de 20 minutos a cada 3 dias.
    3. Inspecione animais diariamente. Considere sinais de estresse como piloerection ou perda significativa de peso.
      NOTA: Espera-se que animais sob Hipoxia/SU5416 percam peso5. Isso é uma indicação do desenvolvimento da doença.
    4. Repita a injeção SU5416 semanalmente por 3 semanas consecutivas (ver Figura 1A para a visão geral do design experimental).
      NOTA: Variar o local da injeção pode ajudar a reduzir as irritações na pele.

2. Caracterização funcional por medidas invasivas de pressão de RV

  1. Preparação
    NOTA: Selecione um regime anestésico. Podem ser utilizados anestésicos inalaáveis ou inaláveis. Uma vez que uma pequena overdose de anestésicos injetáveis (especialmente de cetamina/xilazina ou pentobarbital) pode afetar significativamente a função cardíaca, recomenda-se o uso de anestésicos voláteis. É de grande importância usar o mesmo anestésico para todos os camundongos dentro de um estudo.
    1. Use um vaporizador para garantir uma dose precisa de anestésico por animal. A dose para isoflurane é a seguinte: indução 3-4%, manutenção 1% misturada com 100% de oxigênio.
      NOTA: Use equipamentos de proteção individual e evite respirar o vapor.
    2. Prepare uma almofada de aquecimento e/ou lâmpadas de aquecimento para manter a temperatura corporal. Prepare uma sonda de temperatura retal para monitorar a temperatura corporal.
    3. Certifique-se de ventilação adequada. Prepare o ventilador com antecedência. Prepare o conector do tubo Y e verifique a função do ventilador usando o modo manual. Certifique-se de que a pressão inspiratória é <1 cm H2O para evitar barotrauma. Coloque a taxa respiratória em 110 respirações/min.
    4. Prepare um tubo endotraqueal cortando um cateter intravascular de 20 G.
    5. Prepare os instrumentos necessários: fórceps pequenos, tesouras, retráteis de gancho elástico, cauterizador de vasos e cotonetes de algodão. Em um cotonete ajuste uma pequena agulha de 25 G x 5/8" que será usada para fazer uma pequena punção no ventrículo direito.
    6. Prepare o Cateter de Pressão, a Unidade de Controle de Volume de Pressão e inicie o software de aquisição de dados. Coloque o Cateter PV em um tubo de 15 mL cheio de PBS a 37 °C por 15 min e calibrar de acordo com o protocolo do fabricante.
    7. Para a perfusão e fixação dos órgãos, preparar PBS e uma solução de 50% PBS / 50% OUT. Prepare 2 x 10 mL de seringas (com agulha de 25 G): uma será usada para perfusar o coração e o pulmão com PBS in situ e a segunda para injetar a solução OCT/PBS (50/50) para a amostra pulmonar que será usada para exame histológico.
  2. Intubação
    1. Pese o rato e regise o estado de saúde antes da anestesia.
    2. Induzir anestesia com 3-4% de isoflurane. Verifique a profundidade da anestesia testando o reflexo do dedo do pé-beliscar: belisque o dedo do pé de um dos membros firmemente. Se o animal retirar o membro, é um sinal de anestesia insuficiente.
    3. Após indução de anestesia, raspe o pescoço e as áreas do peito.
    4. Coloque o mouse na almofada de aquecimento. Coloque uma sonda de temperatura retal para monitorar a temperatura corporal.
      NOTA: A manutenção da temperatura corporal é importante para as medidas funcionais. A temperatura corporal deve ser de aproximadamente 36,5-37 °C.
    5. Usando fórceps curvos conecte um fio de sutura aos incisivos superiores do mouse, estique e fixe na almofada de aquecimento com fita cirúrgica. Fixar os membros do rato usando fitas cirúrgicas.
    6. Para entubar o animal faça uma pequena incisão de aproximadamente 1 cm na pele cervical medial usando uma tesoura pequena.
      NOTA: A intubação oral é um método alternativo que requer mais experiência.
    7. Com um aplicador de ponta de algodão separado sem rodeios as glândulas salivares parótidas e submandibulares no nível médio. Isso vai expor os músculos sobreovando a traqueia.
    8. Corte cuidadosamente esses músculos expondo a traqueia.
    9. Com uma tesoura pequena faça uma pequena incisão entre as cartilagens traqueais e insira o tubo endotraqueal preparado. Tire a guia metálica do cateter intravascular.
    10. Ligue o cateter ao ventilador. Verifique a posição do tubo traqueal inflando manualmente os pulmões. Proteja a posição com fita adesiva.
    11. Mantenha uma anestesia isoflurane de 1% durante todo o procedimento.
    12. Monitore regularmente a profundidade da anestesia testando o reflexo do dedo do dedo do dedo do dedo. Ajuste a anestesia de acordo.
      NOTA: A frequência cardíaca recomendada durante os experimentos, abaixo de 1% de anestesia isoflurane, é de aproximadamente 400 batimentos /min. A manutenção da temperatura corporal e da anestesia são essenciais para controlar a frequência cardíaca. O excesso de isoflurane pode reduzir a frequência cardíaca. No entanto, a recuperação pode ser alcançada reduzindo a taxa de isoflurano.
  3. Medidas de pressão do RV (abordagem de peito aberto)
    1. Com uma tesoura pequena, realize uma incisão cutânea de aproximadamente 1 cm sobre o processo xifoide e a parte abdominal superior. Separe a pele que cobre o peito e a parede abdominal dos quadrantes abdominais superiores: comece na linha do meio, distal até o xifoide e mova-se cuidadosamente lateralmente em ambos os lados. Use termocauteria para controlar o sangramento.
      NOTA: O objetivo é ter acesso à cavidade torácica através da parede abdominal.
    2. Abra a cavidade abdominal e corte o diafragma cuidadosamente, tomando cuidado para não ferir o coração batendo ou os pulmões.
      NOTA: O objetivo é expor o ápice e o ventrículo direito do coração. Uma boa exposição e visão do coração são de importância crucial para a correta colocação do cateter. É de grande importância evitar sangramento durante todo o procedimento. Mesmo pequenas alterações no volume intravasal podem alterar a carga do coração direito e afetar os parâmetros registrados.
    3. Remova suavemente o pericárdio usando um aplicador de ponta de algodão.
    4. Pouco antes de colocar o cateter de pressão no coração, traga o cateter ao lado do mouse.
    5. O uso do aplicador preparado com ponta de algodão com a agulha faz uma facada na parte distal apical do ventrículo direito. Remova cuidadosamente a agulha e insira o cateter de pressão neste orifício.
      NOTA: Isso deve funcionar sem aplicar força. Caso isso não seja possível, tente fazer um novo buraco perto do primeiro, a fim de evitar lesões prolongadas do coração. A agulha não deve ser inserida mais profundamente do que aproximadamente 3 mm.
    6. Insira o cateter de pressão paralelo à direção do ventrículo direito, com a ponta voltada para a artéria pulmonar.
    7. Observe o rastreamento da onda de pressão para garantir o posicionamento correto do cateter. Os rastreamentos representativos são demonstrados na Figura 2.
    8. Deixe o sinal de pressão estabilizar. Pausar as respirações e obter pelo menos 3 medidas. Entre as medidas individuais permitem que o animal seja ventilado.
    9. Uma vez que todas as medidas são registradas, remova o cateter e coloque-o de volta no tubo cheio de PBS no banho de água.
      NOTA: Após a conclusão do experimento, limpe o cateter de acordo com as instruções do fabricante.
  4. Eutanásia e perfusão pulmonar
    1. Após a conclusão do experimento eutanize o rato por exsanguinação.
    2. Abra o peito amplamente. Usando uma tesoura, corte todo o esterno e preste atenção para não ferir o coração ou os pulmões.
    3. O uso de uma tesoura de íris faz uma pequena incisão no ventrículo esquerdo para permitir que o sangue saia da câmara.
    4. Coloque a agulha de 25 G de uma seringa contendo 10 mL de PBS no ventrículo direito e injete a solução PBS até que os pulmões sejam limpos de sangue.
    5. Uma vez concluída esta etapa, confirme a eutanásia por colheita de tecido vital (coração e pulmões): corte os acessórios cava e aórtico e remova o coração e os pulmões em bloco.

3. Caracterização morfométrica

  1. Imediatamente após a remoção do coração e dos pulmões (Passo 2.4.5), isole o coração e remova ambos atria. Com a tesoura de tenotomia curva disseca cuidadosamente o ventrículo direito (RV) do ventrículo esquerdo (LV), deixando o septo (S) com o ventrículo esquerdo. Pesar RV e LV+S e calcular o índice Fulton= RV/LV+ S (Figura 3)5,9.
  2. Pegue uma parte do ventrículo direito e coloque-a em um molde de incorporação pré-preenchido em OCT. Use a outra parte do ventrículo direito para análise de RNA e/ou proteína. Encaixe o congelamento no gelo seco e armazene a -80 °C.
  3. Use uma tesoura de íris para isolar os pulmões do coração e qualquer outro tecido restante.
    NOTA: Para a preparação dos pulmões, a perfusão descrita acima (Passos 2.4.3-2.4.5) é de grande importância.
  4. Encaixe parte dos pulmões e armazene-a para RNA, extração de proteínas ou outros ensaios.
  5. Use a outra parte dos pulmões para análise histológica. Para isso, insira a seringa contendo 50% de PBS e 50% de OUTUBRO em um brônquio do lobo usado10,11. O experimentador pode facilmente ver que o pulmão fica inflado quando o conteúdo da seringa é perfundido no tecido.
  6. Coloque esses pedaços de pulmão em moldes de incorporação pré-preenchidos com OCT e escorram congelá-los em gelo seco. Armazene as amostras a -80 °C depois de congeladas.
  7. Prepare seções de 8 μm de RV e pulmão usando uma máquina de criostat. O ar seca as seções à temperatura ambiente por 30 minutos.
  8. Fixar os slides à temperatura ambiente usando 10% de paraformaldeído (PFA) por 10 minutos.
    NOTA: PFA é um conhecido cancerígeno humano. Reduza o risco de exposição usando uma coifa química, procedimentos adequados e equipamentos de proteção individual. Consulte a Folha de Dados de Segurança do Material (MSDS) para obter mais informações.
  9. Avaliação de remodelagem vascular por manchas de Hematoxylin/Eosin
    Nota: Realizar a coloração de Hematoxilina/Eosina para avaliar as alterações estruturais do coração e remodelagem vascular no pulmão(Figura 3).
    1. Mancha com solução de hematoxilina por 8 min.
    2. Enxágüe com água da torneira corrente por 5 minutos seguida de uma lavagem rápida em água destilada.
    3. Enxágüe em 95% EtOH por 1 min e contra-mancha na solução Eosin por 1 min.
    4. Desidratar (80% Etanol 10-30 s, 100 Etanol para 1 min e 100% Toluol por 3 min).
    5. Monte e cubra com uma mancha de cobertura. Seque os slides durante a noite à temperatura ambiente.
      NOTA: As soluções utilizadas para coloração podem ser perigosas. Reduza o risco de exposição usando uma coifa química, procedimentos adequados e equipamentos de proteção individual. Consulte o MSDS para obter mais informações.
  10. Avaliação da fibrose ventricular direita por Picrosirius Red Staining
    NOTA: No Picrosirius Red Staining, picrosirius vermelho, que é ácido, liga-se ao colágeno12. Portanto, essa coloração pode ser utilizada para um exame histológico do conteúdo do colágeno.
    1. Incubar os slides em uma Solução de Bouin pré-aquecido a 58 °C por 1 h.
    2. Lave os slides em água da torneira corrente para remover a cor amarela das seções por 10-15 min.
    3. Mancha em 0,1% Verde Rápido por 20 min em temperatura ambiente.
    4. Enxágüe em 1% ácido acético por 1 min.
    5. Enxágüe na água da torneira por 5 minutos.
    6. Mancha em 0,1% Vermelho Sirius por 30 min à temperatura ambiente seguido de desidratação em Toluol.
      ATENÇÃO: As soluções utilizadas para coloração podem ser perigosas. Reduza o risco de exposição usando uma coifa química, procedimentos adequados e equipamentos de proteção individual. Consulte o MSDS para obter mais informações.
  11. Avaliação de hipertrofia de cardiomiócitos rv por WGA Staining
    NOTA: A hipertrofia do ventrículo direito (RV) no nível celular pode ser avaliada com a realização de uma coloração de Agglutinina do Germe de Trigo (WGA)(Figura 4).
    1. Fixar os slides na solução de Acetona fria por 15 minutos seguidos de 3 passos de lavagem em PBS (5 min cada).
    2. Bloqueie com 10% de soro de cabra em uma solução Dako por 30 minutos à temperatura ambiente.
    3. Incubar os slides com WGA: Adicionar WGA 1:200 e incubar por 1 1/2 h a 37 °C no escuro.
    4. Lave os slides três vezes com PBS.
    5. Incubar os slides com um corante de ácido nucleico.
    6. Lave os slides três vezes com PBS.
    7. Para montagem, remova o excesso de líquido e aplique mídia de montagem e uma mancha de cobertura. Seque os slides por 1 hora à temperatura ambiente no escuro e armazene a 4 °C.
      NOTA: As soluções utilizadas para coloração podem ser perigosas. Reduza o risco de exposição usando uma coifa química, procedimentos adequados e equipamentos de proteção individual. Consulte o MSDS para obter mais informações.
  12. Realizar a imunoquímica do pulmão para avaliar mais e especificamente a remodelagem vascular. Por exemplo, a coloração de células musculares lisas pode ser usada para avaliar a musculação dos vasos, enquanto a coloração do Fator von Willebrand pode ser usada para visualizar alterações endoteliais. Esses métodos são descritos em outros lugares5.

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Resultados

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Neste protocolo, descrevemos detalhadamente a criação do modelo Desoxia/SU5416 para induzir a PH em camundongos. Além disso, detalhamos todas as etapas necessárias para a realização da avaliação vascular e cardíaca pulmonar no final do período de observação.

Uma visão geral do design experimental para este modelo é mostrada na Figura 1A13,14. Os camundongos são submetidos à hipóxia normobá...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve como modelar PH em camundongos combinando dois estímulos patológicos: hipoxia crônica e injeção de SU5416 (Hipóxia/SU5416)18. Na tentativa de correlacionar este modelo de mouse com a condição ph humana, inevitavelmente deve-se olhar para a classificação PH atual, mostrada na Tabela 1. A PH em quase todas as formas é caracterizada pela vasoconstrição pulmonar e proliferação aberrante de células musculares endoteliais e lisas. Isso leva a uma pressão elevada ...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a declarar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado por subsídios da American Heart Association (AHA- 17SDG33370112 e 18IPA34170258) e dos Institutos Nacionais de Saúde NIH K01 HL135474 a Y.S. O.B foi apoiado pela Deutsche Herzstiftung.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ácido acético glacialRoth3738.1
Acetona, Grau de HistologiaThe Lab DepotVT110D
ADVantage Sistema de Pressão-VolumeTransônicoADV500
Solução de BouinSigmaHt10132
Sistema de CauterizaçãoFerramentas de Belas Ciências18000-00
Tubulação de conexão e válvulas
Aplicadores com ponta de algodãoCovidien8884541300
lamínulas, 24 x50 mmRoth1871
Aquisição e análise de dadosEmkaiox2
Direct Red 80Sigma365548-5G
DMSO (Dimetilsulfóxido)Sigma Aldrich276855
Gelo seco
Dumont # 5 fórcepsFine Science Tools11251-10
Dumont # 7 Fine ForcepsFine Science Tools11274-20
Moldes de incorporaçãoSigma AldrichE-6032
Eosin Solution AquosoSigmaHT110216
Etanol, laboratório GrauCarolina Biological Supply Company861285
Tesoura Fina Fast Green FCFSigmaF7252-5G
Ferramentas de Ciência Fina14090-09
Soro de Cabrainvitrogen16210-064
Almofada de aquecimento Gaymar T/Pump
Hematoxilina 2Thermo Scientific7231
Câmara hipóxicaBiospherixA30274P
Câmara de induçãoDRE Veterinary12570
Cateter de intubação (cateter i.v. SurFlash (20 G x 1") )Terumo SR * FF2025
Tesoura de írisFerramentas de Belas Ciências14084-08
IsofluranoBaxterNDC-10019-360-40
Vaporizador de isofluranoDRE Veterinary12432
Ratos (C57BL / 6)Charles River
Needles 25 G x 5/8 "BD305122
OCTTissue Tek4583
PBS (solução salina tamponada com fosfato)Corning21-031-CV
saturada com ácido pírico 1,3SigmaP6744-1GA
Cateter de volume de pressãoTransonicFTH-1212B-4018
AfastadorKent ScientificSURGI-5001
Controlador de oxigênio estático ProOx 360BiospherixP360
Sutura Cirúrgica SU 5416Sigma AldrichS8442
, seda trançada preta, 5.0Surgical Specialties Corp. SP116
Fita cirúrgica3M1527-1
Seringa 10 mlBD303134
Seringas com agulha 1 mlBD309626
Sytox Green Nuclein Acid Stain ThermoScientificS7020
Tesoura de tenotomiaPricon60-521
ToluolRoth9558.3
Ventilador CWESAR-830/P
WGA Alexa Fluor Thermo ScientificW11261
XilenoRoth
Solução %

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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