Sistema baseado em microinjeção para na implantação de Vivo do Cardiomyocytes embrionárias no embrião aviária

Resumo

Neste método, tecidos embrionários cardíacos são cirurgicamente microdissected, dissociado, fluorescente etiquetado e implantou em tecidos embrionários de anfitrião. Isto fornece uma plataforma para estudar a organização do desenvolvimento nível individual ou tecido sob condições hemodinâmicas gravidez ectópica, e/ou alterados parácrina/justácrina ambientes.

Resumo

Interpretar o impacto relativo de padronização autónoma de célula versus extrínseca microenvironmental influência na determinação de linhagem celular representa um desafio geral na pesquisa de biologia do desenvolvimento. No coração embrionário, isto pode ser particularmente difícil, como as diferenças regionais na expressão de reguladores transcricionais, pistas de sinalização justácrina/parácrina, e força de hemodinâmica são todos conhecidos para influenciar a maturação de casos. Um método simplificado para alterar o microambiente molecular e biomecânicas de um desenvolvimento casos serviria, portanto, como uma técnica poderosa para examinar como local condições influência célula destino e função. Para resolver isso, otimizamos a um método para transplantar fisicamente cardiomyocytes juvenil em localizações ectópicas no coração ou o tecido embrionário. Isso nos permite examinar como microenvironmental condições influência casos destino transições em resolução única célula dentro do embrião intacto. Aqui, descrevemos um protocolo em que miócitos embrionários podem ser isolados de uma variedade de subdomínios cardíacas, dissociados, fluorescente etiquetados e injetados em embriões de anfitrião com alta precisão. Células podem ser diretamente analisadas no local usando uma variedade de técnicas de imagem e histológicas. Este protocolo é uma poderosa alternativa para experimentos de enxertia tradicionais que pode ser proibitivamente difícil em um tecido em movimento, tais como o coração. Em linhas gerais este método também podem ser adaptada a uma variedade de tecidos de doadores e ambientes de host e sua facilidade de uso, baixo custo, e velocidade de torná-lo uma aplicação potencialmente útil para uma variedade de estudos do desenvolvimento.

Introdução

Investigação do desenvolvimento cardíaca tem beneficiado enormemente o advento dos sistemas de transgénicos modelo germline que identificaram muitas das redes de regulação do gene que linhagens de células diferentes do padrão e domínios funcionais no coração. No entanto, identificando como estas redes gene interagirem e respondem às condições microenvironmental, incluindo sinais parácrina/justácrina e biofísicas entradas (estiramento, pressão, fluxo hemodinâmico), pode ser desafiador. Como tal, não é sempre fácil determinar se um fenótipo celular surge como uma consequência direta de uma perturbação genética ou como um resultado secundário de uma adaptação a alterações na biomecânica cardíaca ou maior ordem tecido composição^1,2 .

Enxertia experimentos, classicamente utilizados conceitos de endereço de especificação de destino, o compromisso, indução e competência^3,4, representaria uma abordagem ideal para contornar alguns dos desafios inerentes Definir célula autônoma contra a influência ambiental no coração. Infelizmente, as contrações do coração dificultam padrão abordagens de enxertia. Rápido movimento do tecido muitas vezes impede que as células transplantadas aderindo ao coração e tecido grande perfurações (normalmente exigidos para enxertia) frequentemente levar a insuficiência cardíaca e letalidade embrionárias^5,6,7. Portanto, nós desenvolvemos um baseado em pressão, sistema de microinjeção para implantação celular de precisão ao coração da garota em desenvolvimento, contornando os obstáculos técnicos de enxerto de tecido descrito anteriormente^8,9. Usando esta técnica, individuais ou pequenos grupos de células cardíacas isoladas de um embrião de doador podem ser injetados em uma variedade de regiões de um coração embrionário de anfitrião, eliminando a necessidade de acolhimento extensa preparação e os insultos de tecido grande que surgem usando técnicas de enxertia padrão. As agulhas de microinjeção utilizadas para estes estudos de implantação têm um diâmetro exterior de ~ 30−40 µm, o que significa que a agulha pode ser colocada diretamente no tecido-alvo (ou seja, podem penetrar a parede miocárdica embrionária) e células focally podem ser entregues com mínimo de danos para o tecido circundante. O protocolo pode ser usado para executar uma variedade de isotópica, heterotópica, adição e manipulações heterocrónico, proporcionando uma abordagem rápida, flexível e barato para examinar diretamente o clássicas experimentais paradigmas embriológicos no desenvolvimento coração de quatro cavidades.

O protocolo descrito abaixo, nós rotulamos doador de células com uma célula permeant corante fluorescente, que permite o sucesso de um experimento de microinjeção de ser monitorado em tempo real e a localização das células engrafted ser documentados sem necessidade de qualquer adicional a coloração. No entanto, deve notar-se que esta abordagem é mais adequada para experimentos de curto prazo (cerca de 48 h) como o corante fluorescente pode ser perdido através de divisão celular. Abordagens alternativas podem ser usadas para experiências de prazo mais longos.

Enquanto estamos apresentando esta técnica no contexto do desenvolvimento cardíaco, usamos isso com grande efeito para experiências de implantação de célula para a mesoderme, cabeça, membros e somitas. Como tal, a abordagem básica descrita abaixo é altamente tratável e pode ser usada em uma variedade de sistemas de órgãos.

Protocolo

Todos os métodos descritos seguem diretrizes de cuidados com animais de The University of North Carolina em Chapel Hill.

1. preparação da microinjecção pipetas

1. Puxe os capilares de vidro usando um extrator da micropipeta. Para algumas injeções, bisel da agulha é recomendada pois fornece uma superfície extremamente afiada desprovida de impurezas estruturais. Para fazer isso, polir o fim de uma agulha puxada em uma roda de chanfradura em um ângulo de 45° para min 15−20.
   Nota: As configurações exatas para puxar irão variar com base no extrator sendo usado. O diâmetro interno final do bisel deve estar entre 20−40 µm.
2. Revesti as superfícies internas e externas do vidro capilar com silicone. Primeiro Mergulhe as agulhas no agente siliconizing para revestir a superfície externa da agulha e depois carregue a solução de agente siliconizing em cada micropipeta para revestir a superfície interna.
   Nota: O revestimento dos capilares de vidro deve ser feito 24 h antes da experiência de implantação. Revestimento dos capilares de vidro com silicone fornece uma superfície quimicamente inerte ao vidro. Se os capilares são deixados sem tratamento, a suspensão de células gerada em etapas posteriores irá aderir ao vidro e conecte a agulha. Portanto, o revestimento é necessário e vital para o sucesso do método.
   Atenção: O agente siliconizing é uma mistura de comercialmente disponível ready-made de heptano e 1,7-dicloro-1,1,3,3,5,5,7,7-octamethyltetrasiloxane (Tabela de materiais). É extremamente inflamável e agudamente tóxicos. Sempre manuseie com EPI adequado dentro de uma coifa.
   1. Para Retrocarregue a agulha, carregar ~ 5−10 µ l do agente siliconizing em uma ponta da pipeta de injeção de micro (Tabela de materiais). Colocar a ponta da microinjecção no final de largura do vidro puxado capilar e posicione a ponta, tanto para baixo quanto possível (perto da ponta da agulha de vidro). Ejete o agente siliconizing enquanto lentamente, retirar a pipeta de carregamento a fim de minimizar as bolhas de ar na agulha.
   2. Deixar o agente siliconizing com a agulha de vidro para 10 min, retire por aspiração com uma pipeta de carregamento novo e permitir agulhas secar durante a noite em uma coifa.
3. A manhã do experimento, enxagúe os capilares de vidro com água desionizada, seguindo o procedimento na etapa 1.2 e deixar para secar durante 3−4 h.

2. preparação de soluções

1. Prepare-se 5 mL de tripsina neutralizando a solução completando 4,2 mL do médio modificados da águia de Dulbecco e nutriente mistura do Ham F12 (DMEM/F12) com 750 µ l de soro bovino Fetal (FBS) e 50 µ l de penicilina/estreptomicina. Armazenar a 37 ° C até o uso.
2. Prepare-se 5 µM rotulagem solução corante por pipetagem 5 µ l de estoque de 1 mM rotulagem corante (em Dimetilsulfóxido [DMSO], Tabela de materiais) em 995 µ l de Hank está equilibrada solução salina (HBSS). Vórtice por 1 min e loja a 37 ° C até o uso.
3. Prepare-se fresco paraformaldeído (PFA) combinando-se 10 mL da solução-mãe de PFA 32% com 62 mL de água de grau de biologia molecular e 8 mL de 10 x fosfato salino de Dulbecco (DPBS). A concentração final é 4% PFA em 1 x DPBS.

3. preparação dos embriões de acolhimento

1. Incube ovos férteis de galinha em uma orientação horizontal em uma incubadora umidificada em 38 ° C até Hamburger e Hamilton (HH) estágio 19¹⁰.
   Nota: O palco escolhido para manipulação é flexível e inteiramente dependente dos objectivos de cada experiência individual.
2. Marcar a extremidade "achatada" da casca do ovo ao longo do Equador do ovo usando fórceps angulado para fazer uma pequena punção > 1 mm de diâmetro. Inserir uma agulha de 18 G com seringa de 10ml anexado através da punção e remover ~ 5 mL de albumina.
   Nota: Esta localização anatômica é externa à célula de"ar" dentro do ovo e mantém a albumina vazem uma vez feita a punção. Esta etapa é recomendada, pois ela "desce" o embrião longe a casca do ovo, evitando possíveis danos nas etapas subsequentes.
3. Aplique a fita transparente para o topo da casca do ovo. Marcar com pinça angular e cortar uma janela de ~2.5 cm com uma tesoura curva para tenotomia.
4. Inspecionar e estágio do embrião com base em critérios estabelecidos pela Hamburger e Hamilton¹⁰ e selar a punção da etapa 3.2 com fita transparente.
   Nota: Aqui, embriões de etapa 19 HH são usados que têm 37−40 somitas estendendo-se para o broto de cauda. A punção não deve ser selada até depois que a janela é aberta na parte superior do ovo (passo 3.3).
5. Injete ~ 200 µ l de mistura de tinta nanquim/HBSS (1:5) sob o embrião usando uma agulha 32G com seringa de 1ml anexado.
   Nota: tinta nanquim fornece contraste visual entre o embrião e a gema abaixo. Alternativa de corantes como neutra comercialmente disponível ou vermelha ciana proteína fluorescente (PCP) ou conjuntos de filtros de fluorescência azul proteína fluorescente (BFP) podem ser usados para melhorar o contraste.
6. Adicionar 1 mL de HBSS, gota a gota no disco embrionário e selar conchas em janelas com película de parafina. Coloque os ovos em incubadora umidificada até que esteja pronto para a injeção.

4. isolamento do tecido do doador

1. Incube a doadora de óvulos férteis de galinha numa incubadora umidificado a 38 ° C até 19 HH de fase (ou estágio desejado).
2. Remover o embrião do ovo e coloque em um prato de petri 100 x 15 mm contendo HBSS estéril à temperatura ambiente (RT).
3. Cirurgicamente microdissect tecido atrial doador de cada embrião primeiro isolar todo o coração embrionário do embrião e isolando-se dos átrios do coração usando pinça, tesoura tenotomia e microspatula sob um estéreo microscópio de dissecção. Piscina em um tubo de microcentrifugadora mL 1,5 estéril contendo 1 mL de HBSS no gelo.
4. Uma vez que todo o tecido doador tenha sido coletado, pelota o tecido por centrifugação a 1000 x g por 5 min a 4 ° C, em uma ângulo fixo microcentrifuga.

5. digestão de tripsina do tecido do doador

1. Resuspenda pelotas de células em 1 mL de escaldadas 0.05% do trypsin-EDTA e incubar a 37 ° C por 15 min em um bloco de calor tremendo a 300 rpm. Como alternativa, use um banho de água com agitação periódica da amostra.
2. Adicionar a solução de digestão acima e para baixo para quebrar qualquer tecido restante e pelota como na etapa 4.4.
3. Resuspenda o pellet em 1 mL de neutralizar a solução e centrifugar como na etapa 4.4 a tripsina.
4. Ressuspender as células em 400 µ l de vermelho fluorescente, rotulando a solução corante e incubar a 37 ° C por 20 min em um bloco de calor. Como alternativa, use um banho de água.
5. Finalizada a reação de rotulagem, as células como na etapa 4.4 de pelotas e lavar com 1 mL de HBSS (número de lavagem etapas podem ser variadas entre 1 e 3).
6. Ressuspender as células em uma concentração de ~ 50.000 células / µ l, que geralmente resulta em um volume de trabalho 5−10 µ l dependendo do rendimento total da célula rotuladas, peletizadas.
   Nota: Concentrações de célula abaixo ~ 50.000 células / µ l podem resultar em eficiência de injeção pobre.

6. in vivo injeção

1. Carregue a suspensão de células para uma pipeta capilar de silicone vidro Tratado seguindo os procedimentos na etapa 1.2. Monte a pipeta no aparelho de microinjector de pressão.
2. Retirar embriões de anfitrião da incubadora umidificada e coloque em um suporte de ovo debaixo o fluorescente estéreo microscópio de dissecção.
   1. Abrir a membrana vitelínico usando pinça fina estéril e faça uma pequena incisão (~0.5−1.0 mm de comprimento) no pericárdio. Manipulação/dissecação adicional podem ser necessários dependendo da região de destino para a injeção.
3. Posicione o microinjector tal que a ponta da agulha microinjeção penetra o tecido-alvo.
   1. Pressão injetar células e usar a etiqueta fluorescente para determinar que as células implantadas estão presentes no tecido desejado. Para injeções típicas, aplicam-se pulsos único a menos de 0,5 s em duração variando de 100-400 hectopascals na pressão.
      Nota: Duração de pulso e pressão absoluta irão variar dependendo do número de células a ser injetado e podem ser modificados para atender necessidades individuais.
   2. Retrair o aparelho microinjector e remova o ovo do suporte após injeção de pressão.
4. Adicionar 1 mL de HBSS quente gota a gota até o embrião, selar ovos usando fita de embalagem transparente e incubar na incubadora umidificada a 38 ° C para implantação do posto de 24h.

7. isolamento e análise

1. Isolar os embriões de anfitrião em RT HBSS usando a pinça, tesoura tenotomia e microspatula semelhante ao passo 4.3 e corrigir em 4% PFA overnight a 4 ° C, com balanço suave.
2. Lavar 3 x 5 min de embriões em HBSS em RT com balanço suave e armazene em HBSS a 4 ° C para uma análise mais adicional a jusante (microscopia, imuno-histoquímica, hibridização in situ, etc.).

Resultados

Após 24 h incubação, o coração e bordadura tecido do hospedeiro embriões foram isolados, fotografaram (Figura 1A) e processadas para análise de imunofluorescência. Neste exemplo, doador myocytes atrial foram injetadas no proepicardium de um host semelhante encenado embrião. O embrião do anfitrião então estava manchado com o marcador de músculo (MF20 verde) e 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; azul). As células injetadas (vermelho) são claramente visíveis (Figura 1B). Eventuais ajustamentos para considerar se as células não são visíveis incluem: tecido doador mais foi digerido (células seria não é possível anexar), rotulagem solução corante foi também diluído, as células eram excessivamente lavadas ou múltiplas divisões celulares resultou na perda do rótulo.

Para confirmar que as células injetadas neste exemplo foram miocárdica, nós opticamente seccionado este embrião usando um microscópio confocal (Figura 1C-E). A única MF20 positivo dentro do proepicardium (PE) são as fluorescentes vermelhas positivas células que focally foram implantadas.

Figura 1 : Imagens representativas de embriões isolaram 24 horas pós injeção. (A) imagem de brightfield baixa ampliação da região de tronco de um embrião do pintinho E3.5 (HH estágio 19). (B) células de exibição de imagem mesclada injectada (vermelhas), cardiomyocytes (verde) e DAPI. As células foram isoladas a partir dos átrios e injetadas no proepicardium. (C) imagem confocal de alta ampliação mostrando rotulado de células no núcleo do proepicardium. Imagem latente confocal de alta magnificação de (D) confirmar CT vermelho rotulado células é cardiomyocytes. (E) reconstrução tridimensional (3D), de células injetadas de painéis, D e E. No, átrios; OFT, trato de saída; PE, proepicardium; VT, ventrículo; MF20, miosina 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A capacidade de definir como microenvironmental condições impacto cardíaco célula destino especificação e linhagem estabilização é fundamental para criar um entendimento à compressão de cardiopatia congênita, bem como para desenvolver protocolos eficientes para adequado maturação de células-tronco ou células somáticas cardiomyocytes reprograming-baseado. O protocolo descrito acima dá os investigadores a capacidade de ensaio diretamente o desenvolvimento da célula cardíaca sob alterado condições in vivo, permitindo processos de maturação autônoma celular ser separado de pistas parácrina/justácrina e/ou hemodinâmicas. Quando combinado com imagens de alta resolução, análise genética e fisiológicos ensaios, esta técnica pode servir como um complemento poderoso para modelos transgénicos existentes.

Formar um ponto de vista técnico, o protocolo aqui apresentado se baseia em isolamento eficiente, rotulagem e implantação precisa das células do coração doador em tecidos embrionários de anfitrião. O uso de um sistema de microinjeção grandemente ajuda a atingir as células do doador e permite a implantação bem sucedida sem a necessidade de criação de um site grande enxertia no tecido do hospedeiro. Alguma habilidade operacional é necessário para realizar esta técnica, no entanto, como viabilidade reduzida pode resultar se a agulha de injeção não é cuidadosamente colocada no tecido-alvo (causando a ruptura do coração ou da vasculatura local). Cuidados e pensamento também deve ser dado ao isolamento e rotulação passos. Sobre a digestão do dador tecido pode levar a eficiência de implantação pobre e transiente rotulagem técnicas pode limitar a janela de tempo durante o qual as células do doador podem ser rastreadas (como divisão celular pode diluir o rótulo).

Esta técnica é altamente modificável e pode ser adaptada para uma variedade de propósitos. Por exemplo, doador de células de uma grande variedade de tecidos e estágios podem ser isolados (embora otimização da digestão enzimática é necessária) e pode similarmente ser injetado em uma variedade de tecidos do hospedeiro através de diferentes estágios de desenvolvimento. Da mesma forma, a abordagem de rotulagem pode ser modificada para rastrear as células através de janelas temporais diferentes, incluindo o uso de nanocristais semicondutores inorgânicos fluorescente para a rotulagem mais transitória e implantação de células de codorna ou de verde proteína fluorescente transgênico (GFP +) doador embriões¹¹ para a rotulagem de permeant.

Enquanto atualmente usamos essa técnica para estudos de implantação aviária, achamos que poderia ser usado para uma grande variedade de estudos quiméricoes no futuro. Por exemplo, células cardíacas geneticamente alteradas de organismos transgénicos podem ser isoladas e injetadas no coração aviária usando um protocolo muito semelhante. Além disso, células diferenciadas em cardiomyocytes de caules de células ou através de células somáticas reprograming abordagens podem ser injetadas no coração embrionário para avaliar a sua integração no tecido e/ou maturação sob vivo em biomecânica condições.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringa de Insulina de 1 mL	BD	329654
Microtubos de 1,7 mL, Transparente	Seringa de	24-282
	BD	305482
1000ul Ponta de Barreira de Alcance Racked, Estéril	Genesee Scientific	24-430
15 mL Tubos Centriguge, Racked	Genesee Scientific	28-101
1588 Incubadora Genesis Hova-Bator	GQF	813927021221
18G x 1 1/2 Agulha	BD	305196
200ul Ponta de Barreira de Baixa Ligação, Racked, Estéril	Genesee Scientific	24-412
32G x 1/2" Agulha	TSK Steriject Air-Tite	TSK3213
Toalhetes para Álcool 70%	Thermo Fisher Scientific	19015744
Angulado Pinça	Fine Scientific Tools	11260-20
Pontas de Recarga	Eppendorf	930001007
Tinta da Índia Preta	KOH-I-NOOR	3084-F
CellTracker Verde CMF	Thermo Fisher Scientific	C7025	1 mM in DMSO
CellTracker Red CMTPX	Thermo Fisher Scientific	C34552	1 mM in
DMSO Centrifuge	Eppendorf	5424R
Fita de Embalagem de Grau Comercial	Grampos	2619001
Tesoura de Tenotomia Curva	Ferramentas Científicas Finas	14067-11
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11330-032
DMSO, Thermo Fisher	Scientific	D12345
DPBS (10X) anidro, sem cálcio, sem magnésio	Thermo Fisher Scientific	14025092
Femtojet 4i	Eppendorf	5252000021
Fetal Soro Bovino	Thermo Fisher Scientific	10437-028
Ovos para Incubação Incubadora	de Peregrinos	--
HBSS, cálcio, magnésio, sem fenol vermelho	Thermo Fisher Scientific	14025-092
Injectman 4	Eppendorf	5192000027D
Micromanipulador	Leica Microsystems	--
Parafilm	SIGMA	P6543-1EA
Paraformaldeído 32% em solução aquosa, Grau EM	VWR	100496-496
Penicilina/Estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140-022
Placa de Petri	Genesee Scientific	32-107
Moedor de Pipetas	Narishige	EG-44
Extrator de Pipetas	HEKA	PIP 6
Grampos	Fita Transparente Scotch	487909
Sigmacote	SIGMA	SL2-25ML
Microscópio Estéreo	Leica	--
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000023
Parede Fina Capilares de Vidro	World Precision Instruments	TW100F-4
Pipeta de transferência	Thermo Fisher Scientific	273
Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol	Thermo Fisher Scientific	25300-054