Respiração mitocondrial é fundamental para a sobrevivência; Portanto, a taxa de consumo de oxigênio é um excelente indicador de saúde mitocondrial. Neste protocolo, descrevemos a utilização de um respirometer comercialmente disponível para medir basal e taxas de consumo máximo de oxigênio em viver, intacto e livremente motile Caenorhabditis elegans.
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Artigo de método
Medição das taxas de consumo de oxigênio em intacta Caenorhabditis elegans
Neste artigo
Resumo
Resumo
Função mitocondrial ideal é fundamental para a atividade celular saudável, particularmente nas células que têm demandas de alta energia como os do sistema nervoso e muscular. Consistente com isso, a disfunção mitocondrial tem sido associada com uma miríade de doenças neurodegenerativas e envelhecimento em geral. Caenorhabditis elegans tem sido um modelo poderoso sistema para elucidar os muitos meandros da função mitocondrial. Respiração mitocondrial é um forte indicador de função mitocondrial e respirometers recentemente desenvolvidos para oferecer uma plataforma de estado-da-arte para medir a respiração nas células. Neste protocolo, nós fornecemos uma técnica para analisar ao vivo, intacto c. elegans. Este protocolo abrange um período de ~ 7 dias e inclui etapas para o cultivo e a sincronização de c. elegans, (2) preparação de compostos para ser injetado e hidratação das sondas, carregamento e cartucho equilíbrio de drogas (3), (4) preparação do ensaio de minhoca (1) placa e ensaio executado e análise de dados de pós-experiência (5).
Introdução
Trifosfato de adenosina (ATP), a principal fonte de energia celular, é produzido na mitocôndria por enzimas da cadeia de transporte de elétrons (ETC), localizadas na membrana mitocondrial interna. Piruvato, um metabólito chave utilizado para a produção de ATP mitocondrial, é importado para a matriz mitocondrial, onde é sintetizado para produzir Acetil Coenzima A (CoA). Posteriormente, o acetil-CoA entra no ciclo do ácido cítrico, resultando na geração de dinucleótido de nicotinamida adenina (NADH), uma molécula transportadora de elétrons chave. Como os elétrons do NADH são passados ao oxigênio via o ETC, prótons se acumular no espaço intermembranar mitocondrial, que r....
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Protocolo
Nota: A Figura 2 fornece uma visão esquemática do protocolo completo.
1. crescimento e sincronização da população de nematoides9,10
- Transferir as larvas L4 de origens genéticas desejadas (por exemplo, N2 [tipo selvagem] e animais sel-12) para nematoides mídia (NGM) placas de crescimento (ver tabela 1 para receita) recém semeadas com um gramado de Escherichia coli (OP50)11. Use 100mm pelo menos duas ou três placas de 60 mm para todas as estirpes. Incube os vermes à temperatura de crescimento ade....
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Resultados
Usando o protocolo descrito neste documento, OCR de tipo selvagem animais e três diferentes sel-12 mutante estirpes foram determinadas. SEL-12 codifica a ortholog de c. elegans de presenilina17. As mutações em presenilina humana são a aberração genética mais comum associada com o desenvolvimento da doença de Alzheimer familiar18. Nossos estudos mostraram níveis elevados de cálcio mitocondrial em sel-12 ani.......
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Discussão
Respiração mitocondrial é um indicador perspicaz da função mitocondrial; Portanto, ser capaz de medir as taxas de consumo de oxigênio em um sistema biológico, se in vitro ou in vivo é altamente valioso. Respirometers sentir os níveis de oxigénio usando fósforos baseados em porfirina que ficar saciados pelo oxigênio ou através de sensores de oxigênio amperométrico que contam com a geração de um elétrico atual proporcional à pressão de oxigênio. Eletrodo de Clark cai na última categoria e tem sido amplamente utilizado na l.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostaria de reconhecer o Dr. Kevin Bittman para sua orientação no estabelecimento XFp o cavalo-marinho em laboratório. Institutos nacionais de saúde conceder que este trabalho apoiado por GM088213.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placas de Petri de 100 mm, 60 mm | Kord-Valmark Labware Products | 2900, 2901 | |
| Tubos de centrífuga de 1,5 mL | Globe Scientific | 6285 | |
| Tubos cônicos de 15 mL | Corning | 430791 | |
| 22 &vezes; lamínula de 22 mm | Globe Scientific | 1404-10 | |
| Tubos cônicos de 50 mL | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptona | BD, Bacto | 211677 | |
| Bacto triptona | BD, Bacto | 211705 | |
| Extrato de levedura Bacto | BD, Bacto | 212705 | |
| Alvejante | Genérico | ||
| Cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl2· 2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Cianeto de carbonila 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona (FCCP) | Abcam | ab120081 | |
| Colesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Água deionizada (dH2O) | |||
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Thomas Scientific | C987Y85 | |
| Pipetas Glass Pasteur | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO4· 7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Fosfato de potássio dibásico (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Cloreto de sódio | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Hidróxido de sódio (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Fosfato de sódio dibásico anidro (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 | |
| Seahorse XFp | Analyzer Agilent | ||
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent | 103022-100 | |
| Azida de sódio | Sigma-Aldrich | S2002 |
Referências
- Nelson, D. L., Cox, M. M. Ch. 19. Lehninger Principles of Biochemistry. Ahr, K. , W. H. Freeman and Company. 707-772 (2008).
- Marchi, S., et al. Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death. Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).
- Sarasija, S., et al.
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Reimpressões e permissões
